Name: transplantation of schwann cells inside pvdf-trfe conduits to bridge transected rat spinal cord stumps to promote axon regeneration across the gap
Uploaded: 2017-11-03T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transplantation of Schwann Cells Inside PVDF-TrFE Conduits to Bridge Transected Rat Spinal Cord Stumps to Promote Axon Regeneration Across the Gap at JoVE.com

Gostaríamos de agradecer o vetor Viral e núcleos de Animal no projeto de Miami para cura paralisia produzindo lenti-GFP-vírus e fornecendo cuidados com animais, respectivamente e o histologia e núcleos de imagens para o uso do criostato, microscópio confocal, e microscópio fluorescente com investigador estéreo. Financiamento foi fornecido pelo NINDS (09923), DOD (W81XWH-14-1-0482) e NSF (DMR-1006510). M.B. Bunge é a Christine E Lynn Distinguished Professor de neurociência.

ratos de Fischer adulto feminino (180-200 g de peso de corpo) estão alojados de acordo com as diretrizes do NIH e USDA. O cuidado Animal institucional e Comissão de utilização (IACUC) da Universidade de Miami aprovaram todos os procedimentos animais.
 1. preparação de pré-transplante <ol><li>preparação Conduit.
	<ol><li>Corta o conduíte para 5 mm de comprimento, usando uma lâmina #10 sob um microscópio dissecação. 
		Nota: O diâmetro interno da canaliza?...

O passo mais crítico na criação de um modelo eficaz de transecção é rompimento da medula espinhal em um ou dois cortes. Um intervalo de 2-2,5 mm entre os cotos rostral e caudal da medula espinhal deve estar presente no local da transecção. Os três motivos mais prováveis para tal uma lacuna não aparecendo são (1) as raízes dorsal/ventral não foram removidas corretamente, (2) a dura-máter ventral não foi removido adequadamente, e/ou (3) o animal não foi corretamente posicionado no rolo colocado abaixo dela...

Reparação de lesão da medula espinhal é um problema complexo e desafiador que exigirá uma estratégia de tratamento combinatória envolvendo, por exemplo, o uso de células e um biomaterial para fornecer um microambiente favorável para função CÉL transplantado e axônio regeneração no local da lesão. Hemisection1,2,3,4,5,6,7,8,9 e transecção completa10 ,11,12,13,14,15,16,17,18,19 ,20,21,22 modelos são frequentemente usados para avaliar os efeitos das terapias pontes baseada em biomateriais. A vantagem de usar um modelo hemisection é que ele fornece mais estabilidade para construção de ponte em comparação com transecção completa. No entanto, nos modelos hemisection, é difícil provar a regeneração do axônio como um resultado do método terapêutico aplicado devido à presença de tecido poupado. O modelo de transecção completa é o método mais rigoroso para demonstrar a regeneração do axônio.
Vários materiais naturais e sintéticos têm sido estudados para uso como um gel injetável, um gel pré-formado colocados em hemisection modelos ou contusão, ou como uma conduta estruturada em hemisection ou completar modelos transecção (detalhados em23 comentários , 24 , 25). in situ gelificação de uma mistura injectável matriz/SC cria uma interface mais permissiva entre o transplante e o cabo de anfitrião para o axônio cruzamento26,27 , em comparação com implantes previamente coaguladas matriz/SC 5 , 18 , 19 , 28. em situ gelificação permitiu a matriz para contorno próximo as interfaces de host irregular, Considerando que uma conduta mais rígida e estruturada ou um gel menos moldável pré-formado não poderia. Um conduíte estruturado frequentemente fornece contato orientação e implante estabilidade em contraste com uma matriz injetável. Os protocolos aqui apresentados descrevem um procedimento cirúrgico que tira proveito de uma matriz de injetável de membrana basal (por exemplo, matrigel, consulte a Tabela de materiais, referido como injetável matriz aqui) e um condutor estruturado para Avalie a regeneração do axônio no modelo mais rigoroso de lesão da medula espinhal.
Electrospun poli-vinylidenedifluoride-trifluoroethylene (PVDF-TrFE) alinhados fibrosos ocos conduítes são usados em nossa abordagem experimental. PVDF-TrFE é um polímero piezoelétrico que gera uma carga transiente quando deformado mecanicamente e tem sido demonstrado para promover a regeneração de extensão e axônio axônio tanto em vitro29,30 e vivo em 31. eletrofiação é um método de fabricação de andaime comuns que pode rapidamente produzir confiança andaimes fibrosos, usando uma variedade de polímeros com propriedades controláveis como alinhamento de fibra, diâmetro da fibra e espessura do andaime para neural e outras aplicações32,33,34.
Numerosos estudos de SCs transplantados em sítios de lesão da medula espinhal dos ratos demonstraram tratamento eficácia5,9,18,19,20,21 ,26. Esses transplantes são neuroprotetor para o tecido circundante da lesão, reduzir o tamanho da cavidade de lesão e promover a regeneração do axônio para o sítio de lesão/transplante e mielinização dos axônios regenerados. SCs humanas podem ser autologously transplantados, uma vantagem quando comparado com a maioria dos outros neurais relacionadas com células24. Depois de uma biópsia de nervo periférico, SCs podem ser isoladas e purificadas e irá proliferar para a quantidade desejada para transplante em humanos. Transplante autólogo de SC para pacientes ferido da medula espinhal tem sido provado para ser seguro no Irã35,36,37,38, China39,40e o Estados Unidos41,,42. SCs são conhecidos para secretar numerosos fatores neurotróficos e proteínas da matriz extracelular importantes para o crescimento do axônio e desempenham um papel essencial na regeneração do axônio após a lesão de nervo periférico. Nosso objetivo aqui é descrever métodos que podem investigar projetos de canalização para melhorar o resultado da transplantação de SC em um modelo de transecção medular completa de rato.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cryogenic vials</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>5000-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium: nutrient mixture F-12</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11039-021</td>
			<td>&#34;DMEM/F12&#34; in protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>&#34;Pen/Strep&#34; in protcol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH300-70-03</td>
			<td>&#34;FBS&#34; in protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pituitary extract</td>
			<td>Biomedical Technologies</td>
			<td>BT-215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heregulin</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>396-HB/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2636</td>
			<td>&#34;PLL&#34; in protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>&#34;DMEM&#34; in protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14170-112</td>
			<td>&#34;HBSS&#34; in protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryspin-EDTA</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female Fischer rat (160-180g)</td>
			<td>Envigo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissor, straight</td>
			<td>FST</td>
			<td>15018-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Vedco Inc</td>
			<td>5098976106</td>
			<td>100 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Lloyd Inc</td>
			<td>AnaSed</td>
			<td>20 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin</td>
			<td>APP Pharmaceuticals</td>
			<td>NDC 63323-010-02</td>
			<td>Can be any brand of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Spatula</td>
			<td>FST</td>
			<td>10089-11</td>
			<td>Can be any brand of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved scissors with blunt end</td>
			<td>FST</td>
			<td>14017-18</td>
			<td>Can be any brand of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11006-12</td>
			<td>Can be any brand of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rongeur</td>
			<td>FST</td>
			<td>16121-14</td>
			<td>Can be any brand of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angled spring scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>15006-09</td>
			<td>Can be any brand of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorption triangles</td>
			<td>FST</td>
			<td>18105-03</td>
			<td>Can be any brand of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelfoam</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>9083300</td>
			<td>&#34;Compressed foam&#34; in protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#10 blades</td>
			<td>Sklar</td>
			<td>06-3010</td>
			<td>Can be any brand of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>&#34;Injectable matrix&#34; in protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-green fluorescent protein antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB16901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse RT97 hybridoma antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>RT97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-neurofilament antibody</td>
			<td>Encor Biotechnology, Inc</td>
			<td>PRCA-NF-H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal Rabbit anti-Glial Fibrillary Acidic Protein antibody</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Z033401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-chicken IgG (H+L)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscopy</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>clsi</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transplantation of schwann cells inside pvdf-trfe conduits to bridge transected rat spinal cord stumps to promote axon regeneration across the gap

Entre vários modelos para a lesão da medula espinhal em ratos, o modelo de contusão é o mais frequentemente usado porque é o tipo mais comum de lesão da medula espinhal humana. O modelo de transecção completa, embora não tão clinicamente relevantes como o modelo de contusão, é o método mais rigoroso para avaliar a regeneração do axônio. No modelo de contusão, é difícil distinguir regenerada de axônios germinados ou poupados devido à presença do restante post lesões no tecido. No modelo de transecção completa, um método de ponte é necessário preencher a lacuna e criar a continuidade partir o rostral para os cotos caudais para avaliar a eficácia dos tratamentos. Uma cirurgia de ponte confiável é essencial para testar as medidas de resultado, reduzindo a variabilidade devido o método cirúrgico. Os protocolos descritos aqui são usados para preparar Schwann células (SCs) e condutas antes da transplantação, transecção completa da medula espinhal torácica nível 8 (T8), insira o conduíte e transplantação SCs para a canalização. Essa abordagem também usa em situ gelificação de uma matriz de injetável membrana basal com transplante de SC que permite o crescimento do axônio melhorada entre as interfaces rostrais e caudais com o tecido do hospedeiro.

O objetivo de utilizar esta técnica cirúrgica é avaliar o uso de uma conduta estruturada e matriz injetável que maximiza a função de SC após transplante em concluído espinais necrosante. Três semanas após o transplante, os animais são pintados com paraformaldeído 4% e a coluna vertebral são grosseiramente dissecada e fixada no mesmo fixador para outro 24h. A medula espinhal é então dissecada e amostras para seções sagitais criostato são colocadas em uma solução de saca...

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Transplantation of Schwann Cells Inside PVDF-TrFE Conduits to Bridge Transected Rat Spinal Cord Stumps to Promote Axon Regeneration Across the Gap

Este artigo descreve uma técnica para inserir um canal oco entre os cotos de medula espinhal após a transecção completa e preenchimento com células de Schwann (SCs) e matriz de injetável membrana basal para ponte e promover a regeneração do axônio através da abertura.

Transplante de Schwann células dentro de conduítes de PVDF-TrFE a ponte rato necrosante tocos de medula espinhal para promover a regeneração do axônio através da abertura

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