Name: transplantation of schwann cells inside pvdf-trfe conduits to bridge transected rat spinal cord stumps to promote axon regeneration across the gap
Uploaded: 2017-11-03T12:30:00
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Nos gustaría dar las gracias al Vector Viral y núcleos de animales en el proyecto Miami para curar parálisis para producir el lenti-GFP-virus y proporcionar cuidado animal, respectivamente y la histología y núcleos de proyección de imagen para el uso del criostato, microscopio confocal, y microscopio de fluorescencia con el investigador estéreo. La financiación fue proporcionada por NINDS (09923), DOD (W81XWH-14-1-0482) y NSF (DMR-1006510). M.B. Bunge es el Christine E Lynn distinguido profesor de Neurociencias.

ratas Fischer adulto (peso 180-200 g) se encuentran directrices NIH y del USDA. El Animal cuidado institucional y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de Miami aprobaron todos los procedimientos animales.
 1. preparación de pre-trasplante <ol><li>preparación de conducto.
	<ol><li>Corta el conducto a 5 mm de longitud con una cuchilla #10 con un microscopio de disección. 
		Nota: El diámetro interno del conducto está entre 2.4-2.7 m; el diámetro exterior es de ...

El paso más crítico en la creación de un modelo de corte transversal eficaz es cortar la médula espinal en uno o dos cortes. Un 2-2.5 mm de espacio entre los tocones rostral y caudal de la médula espinal debe estar presente en el sitio de transección. Las tres razones más probables para tal espacio no aparece son (1) las raíces dorsal/ventral no se limpiaron adecuadamente, (2) la dura ventral no se elimina adecuadamente, o (3) el animal no fue colocado correctamente sobre el rodillo colocado debajo de ella.
<...

Reparación de lesión de la médula espinal es un problema complejo y difícil que requiere una estrategia de tratamiento combinatoria que involucran, por ejemplo, el uso de células y un biomaterial para proporcionar un microambiente favorable para la función de las células trasplantadas y axon regeneración en el sitio de la lesión. Hemisección1,2,3,4,5,6,7,8,9 y transección completa10 ,11,12,13,14,15,16,17,18,19 ,20,21,22 modelos se utilizan con frecuencia para evaluar los efectos de terapias puente basadas en biomateriales. La ventaja de utilizar un modelo de Hemisección es que proporciona más estabilidad para la construcción de puente en comparación con el transection completo. Sin embargo, en modelos de Hemisección, es difícil probar la regeneración del axón como un resultado del método terapéutico aplicado debido a la presencia de tejido ahorrado. El modelo del transection completo es el método más riguroso para demostrar la regeneración del axón.
Se han estudiado diversos materiales naturales y sintéticos para el uso como un gel inyectable, gel formado colocan en contusión o Hemisección modelos, o como un medio estructurado en Hemisección o completar modelos de corte transversal (detallados en los comentarios23 , 24 , 25). in situ gelificación de una mezcla de matriz/SC inyectable crea una interfaz más permisiva entre el trasplante y el cable host axon travesía26,27 comparado con implantes pregelados matriz/SC 5 , 18 , 19 , 28. in situ gelificante permite la matriz de contorno alrededor de las interfaces de host irregulares mientras que un tubo más rígido y más estructurado o un gel menos moldeable de formado no podría. Un conducto estructurado a menudo proporciona estabilidad contacto de guía y el implante en contraste con una matriz inyectable. Los protocolos aquí presentados describen un procedimiento quirúrgico que se aprovecha de una matriz inyectable la membrana del sótano (p. ej., matrigel, vea la Tabla de materiales, que se refiere como inyectable matriz aquí) y un conducto estructurado a evaluar la regeneración del axón en el más riguroso modelo de lesión de la médula espinal.
Electrospun poly-vinylidenedifluoride-trifluoroethylene (PVDF-TrFE) se utilizan conductos huecos fibrosos alineados en nuestro abordaje experimental. PVDF-TrFE es un polímero piezoeléctrico que genera una carga transitoria cuando se deforma mecánicamente y se ha demostrado para promover la regeneración de extensión y axon neurita en vitro29,30 y vivo en 31. Electrospinning es un método común de fabricación de andamio que puede producir rápidamente andamios fibrosos confiables usando una variedad de polímeros con propiedades controlables tales como la alineación de la fibra, fibra diámetro y espesor del andamio para 33,de32,34de nervios y otras aplicaciones.
Numerosos estudios de SCs trasplantados en sitios de lesión de médula espinal de rata han demostrado tratamiento eficacia5,9,18,19,20,21 ,26. Estos trasplantes son neuroprotectores para el tejido que rodea la lesión, reducir el tamaño de la cavidad de lesión y promueve la regeneración del axón en el sitio de trasplante de lesión y la mielinización de los axones regenerados. SCs humanos pueden trasplantarse autologously, una ventaja en comparación con otras neuronales relacionadas con las células24. Después de una biopsia de nervio periférico, SCs pueden ser aislados y purificados y se proliferan a la cantidad deseada para el trasplante en seres humanos. Trasplante autólogo de SC para pacientes lesionados medulares ha demostrado para ser seguro en Irán35,36,37,38, China39,40y el Estados Unidos41,42. SCs se conocen secretan numerosos factores neurotróficos y matriz extracelular proteínas importantes para el crecimiento del axón y juegan un papel esencial en la regeneración del axón después de lesión de nervio periférico. Nuestro objetivo aquí es describir los métodos que pueden investigar diseños de conducto para mejorar los resultados del trasplante de la SC en un modelo de corte transversal de médula espinal de ratas completa.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cryogenic vials</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>5000-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium: nutrient mixture F-12</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11039-021</td>
			<td>&#34;DMEM/F12&#34; in protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>&#34;Pen/Strep&#34; in protcol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH300-70-03</td>
			<td>&#34;FBS&#34; in protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pituitary extract</td>
			<td>Biomedical Technologies</td>
			<td>BT-215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heregulin</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>396-HB/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2636</td>
			<td>&#34;PLL&#34; in protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>&#34;DMEM&#34; in protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14170-112</td>
			<td>&#34;HBSS&#34; in protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryspin-EDTA</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female Fischer rat (160-180g)</td>
			<td>Envigo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissor, straight</td>
			<td>FST</td>
			<td>15018-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Vedco Inc</td>
			<td>5098976106</td>
			<td>100 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Lloyd Inc</td>
			<td>AnaSed</td>
			<td>20 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin</td>
			<td>APP Pharmaceuticals</td>
			<td>NDC 63323-010-02</td>
			<td>Can be any brand of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Spatula</td>
			<td>FST</td>
			<td>10089-11</td>
			<td>Can be any brand of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved scissors with blunt end</td>
			<td>FST</td>
			<td>14017-18</td>
			<td>Can be any brand of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11006-12</td>
			<td>Can be any brand of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rongeur</td>
			<td>FST</td>
			<td>16121-14</td>
			<td>Can be any brand of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angled spring scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>15006-09</td>
			<td>Can be any brand of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorption triangles</td>
			<td>FST</td>
			<td>18105-03</td>
			<td>Can be any brand of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelfoam</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>9083300</td>
			<td>&#34;Compressed foam&#34; in protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#10 blades</td>
			<td>Sklar</td>
			<td>06-3010</td>
			<td>Can be any brand of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>&#34;Injectable matrix&#34; in protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-green fluorescent protein antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB16901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse RT97 hybridoma antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>RT97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-neurofilament antibody</td>
			<td>Encor Biotechnology, Inc</td>
			<td>PRCA-NF-H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal Rabbit anti-Glial Fibrillary Acidic Protein antibody</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Z033401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-chicken IgG (H+L)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscopy</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>clsi</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transplantation of schwann cells inside pvdf-trfe conduits to bridge transected rat spinal cord stumps to promote axon regeneration across the gap

Entre los distintos modelos de lesión de la médula espinal en ratas, el modelo de la contusión se utiliza lo más a menudo porque es el tipo más común de lesión de la médula espinal humana. El modelo de transección completa, aunque no clínicamente relevantes como el modelo de contusión, es el método más riguroso para evaluar la regeneración del axón. En el modelo de contusión, es difícil distinguir de axones germinados o ahorrados debido a la presencia de remanente post lesión de tejido regenerado. En el modelo transection completo, un método de adaptación es necesario para llenar la brecha y crear continuidad de la rostral a los caudales muñones para evaluar la eficacia de los tratamientos. Una cirugía de puente confiable es esencial para poner a prueba las medidas de resultado reduciendo la variabilidad debido al método quirúrgico. Los protocolos descritos aquí se utilizan para preparar a Schwann las células (SCs) y conductos antes del trasplante, transección completa de la médula espinal a nivel torácico 8 (T8), inserte el conducto y trasplante del SCs en el conducto. Este enfoque también utiliza en situ de gelificación de una matriz de membrana del sótano inyectable con el trasplante de SC que permite el crecimiento del axón mejor a través de las interfaces rostrales y caudales con el tejido del anfitrión.

El objetivo de la utilización de esta técnica quirúrgica es evaluar el uso de un tubo estructurado y matriz inyectable que maximiza la función SC después del trasplante en cuerdas de espinal transected terminados. Tres semanas después del trasplante, los animales son perfundidos con paraformaldehído al 4% y las columnas vertebral son groseramente disecadas y fijo en el mismo fijador por otro 24 h. Luego se diseca la médula espinal y las muestras para las secciones sagitales criost...

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Transplantation of Schwann Cells Inside PVDF-TrFE Conduits to Bridge Transected Rat Spinal Cord Stumps to Promote Axon Regeneration Across the Gap

Este artículo describe una técnica para insertar un tubo hueco entre los tocones de la médula espinal después de la transección completa y se llenan de células de Schwann (SCs) y matriz inyectable la membrana del sótano para salvar y promover la regeneración del axón a través de la brecha.

Trasplante de Schwann las células dentro de conductos de PVDF-TrFE a puente tocones de médula espinal de rata seccionado para promover la regeneración del axón a través de la brecha

Among various models for spinal cord injury in rats, the contusion model is the most often used because it is the most common type of human spinal cord ...

Research

JoVE Journal

Medicine

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Investigación

Medicina

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Un modelo de trasplante de pulmón de rata de lesión por isquemia/reperfusión caliente: optimizaciones para mejorar los resultados

From our experience with rat lung transplantation, we have found several areas for improvement. Information in the existing literature regarding methods ...