Name: preparation and metabolic assay of 3-dimensional spheroid co-cultures of pancreatic cancer cells and fibroblasts
Uploaded: 2017-08-23T14:00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts at JoVE.com

نود أن نشكر صمويل زيربيل للمساعدة في تحسين أحوال الثقافة ورصد النمو كروي. ونحن ممتنون للتكنولوجيات اجيلنت لتوفير محلله96 XF فرس البحر، والكاشفات المقايسة والرؤى الفنية. كما نشكر الدكتور هيمانت كوخر بارتس معهد السرطان في المملكة المتحدة لتوفير خلايا PS1. تأييد هذا العمل جزئيا من مؤسسة ماجوويتز سينا لأبحاث سرطان البنكرياس والوقوف يصل إلى السرطان-سرطان لوستجارتين المملكة المتحدة مؤسسة البنكرياس السرطان حلم فريق البحوث منحة بحثية (عدد المنح: SU2C-آكر-DT-20-16). نقف للسرطان برنامج "مؤسسة صناعة الترفيه". المنح البحثية تدار بواسطة "الرابطة الأمريكية" "بحوث السرطان"، الشريك العلمي ل SU2C.

1-"الثقافة سرطان البنكرياس" الماغنيسيوم ثلاثي الأبعاد باستخدام "بيوبرينتينج المغناطيسي" تقنية <ol><li>استخدام معيار العقيم زراعة الأنسجة، والخلايا ثقافة الاهتمام قارورة T75 إلى كونفلوينسي من 70-80% في وسائط النمو المناسب. 
	ملاحظة: عادة، 5-7 × 10 6 خلايا من قارورة T75 المتلاقية 70-80% تم حصادها. استخدمت نوعين خلية مختلفة في هذه الدراسة-Patu8902 (خلايا ورم البنكرياس) والخلايا PS1 ( 21 من تنشيط الخلايا النجمية البنكرياس). كانت مثقف كلا خطوط الخلايا في روزويل بارك التذكاري معهد الإعلام 1640 (ربمي-1640) تستكمل مع serum(FBS) البقري الجنين 10% (v/v)، 1 × البنسلين-ستربتوميسين (p/s).</li>
	<li>يغسل خلايا مرة واحدة مع 5 مل دولبيكو &#39; s الفوسفات مخزنة saline(DPBS).</li>
	<li>فصل الخلايا من البلاستيك السطحية التي تريبسينيزينج مع 2 مل من 0.05% يدتا التربسين لمدة 5-10 دقيقة في 37 درجة الاختيار جيم لمفرزة الخلية تحت مجهر.</li>
	<li>Deactivate التربسين بإضافة وسائط النمو 8 مل لفصل الخلايا. تجنب الإفراط في تريبسينيزيشن، كهذا يمكن أن يؤثر على الصحة/صلاحية الخلايا.</li>
	<li>الخلايا بيبيت صعودا وهبوطاً لإنشاء تعليق خلية مفردة والعد الخلية كثافة استخدام عداد الآلي خلية أو هيموسيتوميتير.</li>
	<li>في الوقت نفسه، حجته قنينة NS إلى درجة الحرارة المحيطة-</li>
	<li>حساب كمية الخلايا المطلوبة لبذر العدد المطلوب من الماغنيسيوم (الآبار) وقاسمه لأنبوب مخروطي 15 مل جديدة. على سبيل المثال، بالبذور أكمله 96 لوحة جيدا مع 5,000 الخلايا/حسنا، قاسمة على الأقل 5.5 × 10 5 خلايا.</li>
	<li>جمع الخلايا من سينتريفوجينج في ز 500 x للحد الأدنى 3 بعناية نضح أو صب المادة طافية وريسوسبيند الخلايا بتركيز 1.0 × 10 6 خلايا/مل في وسائط النمو. ماصة برفق باستخدام تلميح بيبيت واسعة بالملل لتجنب إمالة. على سبيل المثال، ريسوسبيند 5.5 × 10 5 خلايا في 550 ميليلتر من وسائط النمو.</li>
	جذب <li>المبلغ المطلوب من الخلايا باستخدام NS متوازن (الخطوة 1، 6).
	إضافة NS إلى تعليق خلية في وسائط النمو <ol><li>مباشرة وتحرض بلطف. لوسم المغناطيسية فعالة من الخلايا، استخدم ميليلتر 10 نانوثانية الواحد 100 ميليلتر الخلايا (حراكه في 1 × 10 6 خلايا/مل)- 
		ملاحظة: لتجربة نموذجية، تسمية 5.5 × 10 5 Patu8902 الخلايا في ميليلتر 550 مع 55 ميليلتر NS و 1.1 × 10 6 PS1 الخلايا في 1100 ميليلتر، (كل على حدة) مع ميليلتر 110 NS.</li>
		<li>برفق عكس أنبوب بضع مرات لضمان تعليق خلية. مؤقتاً، نقل هذا المزيج NS الخلية في بئر واحدة من صفيحة 24-جيدا. القيام بذلك بشكل منفصل لكل نوع من الخلايا تكون ممغنط. تغطية صفيحة واحتضان خلايا في درجة حرارة الغرفة ح 2 مع الهز لطيف للسماح ربط NS إلى سطح الخلية. 
		ملاحظة: الثقافة ومقايسة من الماغنيسيوم ابتداء أما من الخلايا Patu8902 أو PS1 وحدها، بالإضافة إلى الماغنيسيوم الثقافة المشتركة بدءاً بكل خلية أنواع ممزوجة مسبقاً قبل الطباعة على محركات أقراص مغناطيسية تحقق بنجاح باستخدام هذا الأسلوب في المستقلة التجارب. فيما يلي طريقة لتوليد ثقافة المشارك الماغنيسيوم من الخلايا Patu8902 و PS2 في الخطوات اللاحقة-</li>
	</ol></li> <li>بيبيت صعودا وهبوطاً الخلايا الممغنطة بلطف المزيج بالتساوي وإعداد مزيج رئيسي الذي يحتوي على عدد الخلايا المطلوب. للبذر الماغنيسيوم، استخدم مجموعة خلايا 15,000 (10,000 PS1 + 5,000 Patu8902) وضبط حجم إجمالي 150 ميليلتر كل من صفيحة 96-جيدا جيدا. 
	ملاحظة: يجب أن تكون وحدة التخزين النهائي الاستغناء في كل بئر نفسه بغض النظر عن عدد الخلايا المستخدمة.</li>
	ضع لوحة 96-جيدا طارد خلية فوق محرك الأقراص كروي المغناطيسي 96-جيدا <li>والاستغناء عن 150 ميليلتر من مزيج خلية في كل بئر. مراقبة الخلايا جمع ببطء إلى مركز البئر فوق المغناطيس. تغطية واحتضان لوحة بين عشية وضحاها في حاضنة 2 CO 5% مبلغ 37 درجة مئوية مع محرك الأقراص الممغنطة كروي لا تزال تعلق. إزالة محرك الأقراص الممغنطة واحتضانها لتحقيق المزيد من النمو لتصل إلى 7 أيام. 
	ملاحظة: من الضروري استخدام لوحات نمو الخلية طارد للطباعة كروي باستخدام محركات أقراص مغناطيسية كروي. التأكد من أنه يتم استخدام محرك الأقراص كروي مع أرق مغناطيسات أصغر، ليس محرك الأقراص القابضة.</li>
	<li>رصد نمو الماغنيسيوم كل يوم. تجديد مع وسائط النمو جديدة كل ثلاثة أيام عن طريق وضع لوحة النمو التي شنت على عقد السيارة بزاوية المغناطيسي واستخدام بيبيت متعددة القنوات لاستخلاص وسائل الإعلام المستهلك. 
	ملاحظة: سوف تنمو خلايا Patu8902 و PS1 المصنف المشترك في الخلايا/بئر 15,000 إلى الماغنيسيوم ثلاثية الأبعاد التي يبلغ قطرها 400-600 ميكرون في غضون 5-7 أيام. عند هذه النقطة الماغنيسيوم مستعدون لتوصيف الأيضية وتقييم الدواء وتطبيقات أخرى المصب.</li>
</ol> 2. الفحص الأيضي من "الماغنيسيوم ورم البنكرياس" 3D "مسارات الاستقلاب" استخدام "محلل الجريان خارج الخلية" ملاحظة: في هذا القسم، تحليل الوظائف الأيضية الماغنيسيوم الجريان خارج الخلية باستخدام يتم وصف محلل مع الإنزيم ميكروبلاتيس خصيصا الماغنيسيوم 3D-
<ol><li>الغسيل ونقل الماغنيسيوم من لوحات النمو إلى كروي الاعتداء ميكروبلاتيس. 
	ملاحظة: قد تستخدم الماغنيسيوم لفحوصات الأيض عند وصولها إلى قطر ~ 500 ميكرومتر.
	<ol><li>اليوم قبل إجراء الفحص، هيدرات خرطوشة مسبار أو مجس مع الإنزيم كاليبرانت (200 ميليلتر في البئر) في لوحة الأداة المساعدة المقدمة واحتضان بين عشية وضحاها (ح 4-18) في حاضنة هوميديفيد (غير CO 2) تعيين في 37 درجة مئوية.</li>
		<li>إعداد المتوسط التحليل المناسب للفحص الأيضي المرجوة باستكمال وسائل الإعلام الأساسية (انظر الجدول للمواد) مع أما المقايسة مم 2 لتر-الجلوتامين لاختبار الإجهاد تحلل (GST) أو مع بيروفات 1 مم، 2 لتر-الجلوتامين و 10 ملم الجلوكوز تحليل اختبار الإجهاد المتقدرية (MST). 
		ملاحظة: التدابير محلل الجريان خارج الخلية التنفس المتقدرية (OCR) وتحلل (عكر) من الخلايا الحية في شكل لوحة 96-جيدا. هذه المعدلات تقديم لمحة عامة عن وظيفة الأيض الخلوية في العينات قيد التحقيق. الرجاء الرجوع إلى الدليل في مجموعات المقايسة للحصول على إرشادات تفصيلية.</li>
		<li>بعد الاعتداء إضافة المكملات الغذائية محددة (راجع الخطوة 2.1.1)، الحارة المتوسطة المقايسة المكملة في حمام مائي 37 درجة مئوية وضبط درجة الحموضة إلى 7.4 ± 0.1 مع 0.1N هيدروكسيد الصوديوم. الدفء في المتوسط حتى استخدام.</li>
		<li>إعادة الاعتداء الكواشف كيت في المتوسط معايرة الإنزيم إلى تركيزات الأسهم الموصى بها- 
		ملاحظة: يتم إجراء هذه في 10 × التركيز النهائي المطلوب في الآبار. الأسهم تركيزات الجلوكوز وأوليجوميسين 2-ديوكسي-الجلوكوز (2-DG) هي 100، 100 ميكرومتر و 500 ملم، على التوالي.</li>
		<li>الماغنيسيوم ملاحظة في لوحة النمو تحت ضوء المجهر للتحقق مورفولوجية كروي والاتساق عموما؛ ومن حيث الشكل وستروكتور(ه) من الماغنيسيوم.</li>
		نقل لوحة النمو على محرك أقراص مغناطيسية عقد <li>ونضح وسائط النمو ميليلتر ~ 120 بعناية. بلطف تغسل الماغنيسيوم مع ميليلتر ~ 120 المقايسة دافئة وقبل معايرة وسائل الإعلام ونضح وتكرار الغسيل مرتين. فحص الماغنيسيوم تحت المجهر مرة أخرى لضمان أن لا يتم غسلها الماغنيسيوم بعيداً.</li>
		<li>إعداد الميكروسكوبية المقايسة كروي بإضافة وسائط الحارة بالانزيم ميليلتر 180 لكل بئر.</li>
		<li>تعيين ميكروبيبيتي P20 إلى 10 ميليلتر وتناسب تلميح واسعة بالملل لذلك. إذا لم تتوفر نصائح واسعة بالملل، قطع نصائح نصائح ماصة العادية مع مقص نظيف أو مشرط لتوسيع تتحمل. 
		ملاحظة: هذا ينبغي الحد من القص والحفاظ على مورفولوجية عموما الماغنيسيوم أثناء نقله إلى الاعتداء لوحات.</li>
		<li>استخدام سطح دافئة (37 درجة مئوية) للقيام بنقل الماغنيسيوم. استخدام سطح عارض فيلم الأشعة سينية حرارة مع مصباح الضوء الأبيض لتعزيز التباين والمعونة تصور الماغنيسيوم أثناء عملية النقل.</li>
		<li>بعناية أسبيراتي كروي غسلها قبل واحد من لوحة النمو طارد الخلية باستخدام ميكروبيبيتي P20 مزودة بمجموعة واسعة تتحمل نصيحة ولطف كروي نقل مباشرة إلى المركز لكل بئر من صفيحة المقايسة كروي للقيام التمثيل الغذائي المقايسة. السماح لكل كروي بلطف الوقوع في الدقيقة-الدائرة المركزية لكل بئر بالجاذبية نقية لتجميع لوحة المقايسة. 
		ملاحظة: عادة ما يستغرق 5-8 ق لكل كروي للوقوع في وسط البئر بالجاذبية. لم تنسحب الماصة حتى الماغنيسيوم قد استقرت في قاعة الصغيرة. هل سيتم استخدام عدم إيداع الماغنيسيوم في الركن 4 آبار لوحة المقايسة (A1، A12، H1، H12) منذ هذه الآبار الخلفية.</li>
		<li>رصد مورفولوجيا وموقف كل كروي للتأكد من أن كل كروي في وسط كل بئر. إذا لزم الأمر، تغيير موضع إلى مركز جيدا قبل يسفط كروي باستخدام مجموعة واسعة من يحمل نصيحة بيبيت، وترسب اللاحقة بواسطة الجاذبية.</li>
		<li>متى تم نقل جميع الماغنيسيوم، ضع لوحة الإنزيم في حاضنة هوميديفيد جوية 37 درجة مئوية (غير CO 2) لمدة ساعة واحدة قبل الاعتداء.</li>
	</ol></li> <li>تحميل خرطوشة الاستشعار مع المركبات والقيام الفحص <ol><li>تحضير 10 × تتركز المقايسة الكواشف محددة في مقايسة وسائط الإعلام المحددة الموضحة في الخطوة 2.1.2. على سبيل المثال، إلى الاضطلاع بضريبة السلع والخدمات، وإعادة تشكيل الجلوكوز وأوليجوميسين 2-المديرية العامة في وحدات التخزين الموصى بها المشار إليها في الدليل المقايسة. ضريبة السلع والخدمات و MST فحوصات أجريت استخدام الماغنيسيوم Patu8902-PS1-</li>
		<li>بشكل صحيح توجيه خرطوشة الاستشعار مع الصفوف المسمى A-H على الجانب الأيسر ووضع دليل تحميل على رأس خرطوشة الاستشعار. ضمان التحميل الصحيح للمنفذ المطلوب بتوجيه دليل التحميل حيث يكون الحرف المقابل للميناء إلى أن يتم تحميل في الزاوية العلوية اليسرى.</li>
		<li>باستخدام الأقنية ماصة، الاستغناء عن الكواشف مباشرة إلى منافذ الحقن. اضغط تحميل خطوط إرشاد في موضع استخدام الأصابع طوال فترة الإجراءات. 
		ملاحظة: سيتم حقن كل كاشف في منفذ الموصى به المشار إليه في دليل المقايسة. تجنب خلق فقاعات الهواء ولكن لا انقر فوق أي جزء من خرطوشة لإزالة فقاعات الهواء-</li>
		<li>إزالة دليل تحميل وموقف في مستوى العين مع خرطوشة بصريا تفتيش الموانئ حقن لتحميل حتى.</li>
		<li>إنشاء البروتوكول تصميم/أداة التحليل التجريبي باستخدام أداة التحكم الموجه البرمجيات (من الآن فصاعدا، تحليل) كما هو موضح في الفرع 2-3-</li>
	</ol></li> <li>المقايسة التصميم والتنفيذ باستخدام برمجيات التحليل <ol><li>إنشاء قالب مقايسة للتجربة <ol><li>فتح برنامج التحليل وانقر فوق &#34; قوالب &#34; أو اختر من فحص موجودة قالب. انقر نقراً مزدوجاً فوق &#34; "قالب فارغ" &#34;.</li>
			<li>تعريف المجموعات التجريبية والظروف.
			<ol><li>"حقن تحديد" استراتيجيات لمنافذ ألف، وباء وجيم إجازة ميناء د فارغة. 
				ملاحظة: للمقايسة ضريبة السلع والخدمات، سيتم تحميل فقط من هذه المنافذ مع الجلوكوز وأوليجوميسين 2-المديرية العامة. في حالة فحص MST، سيتم تحميل أوليجوميسين وفككب ووالروتينون.</li>
				<li>تحديد المعالجات المسبقة إذا عوملت الماغنيسيوم مع واحد أو أكثر من المركبات الاختبار والسيطرة على المجموعة. تعريف الوسائط المقايسة لتشمل مصدر والمكملات الغذائية، ومعلومات أخرى.</li>
				<li>تحديد واحد أو أكثر نوع الخلية (مثل Patu8902، PS1) رؤية المعلومات عدد وكثافة المرور.</li>
			</ol></li> <li>انقر فوق &#34; إنشاء المجموعات &#34;.</li>
			<li>انقر فوق &#34; "خريطة لوحة" &#34; علامة التبويب، وقم بتعيين مجموعات لوحة فحص المقابلة للتصميم التجريبي-</li>
			<li>تحديد الآبار الزوايا الأربع الآبار الخلفية. التأكد من أنه لا يوجد أي الماغنيسيوم في هذه الآبار.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>تشغيل الفحص على المحلل <ol><li>انقر فوق علامة التبويب "بروتوكول صك" إبقاء الافتراضي أوامر بروتوكول التحقق من &#34; معايرة &#34;، &#34; اكويليبراتي &#34; و &#34; "دورة قياس خط الأساس" &#34;.</li>
		<li>انقر فوق &#34; الحقن &#34; وتعريف مجمع لكل منفذ. تحرير دورات القياس إلى 6 دورات من الافتراضي 3 دورات الماغنيسيوم. الاحتفاظ مزيج 3 دقيقة الافتراضي، والانتظار 0 دقيقة ودقيقة 3 مرات قياس. 
		ملاحظة: أوقات ميكس-الانتظار-التدبير الافتراضية هي دقيقة 3، 0 دقيقة، 3 دقيقة، على التوالي. عادة ما تؤخذ ثلاثة قياسات معدل القاعدية قبل الحقن للفحص الأولى مجمع. يمكن معايرة هذه القياسات وتعديلها وفقا للتصميم التجريبي-</li>
		<li>استعراض البروتوكول وملخص المجموعة.</li>
		<li>حفظ قالب تصميم المقايسة.</li>
		<li>المضي قدما لمعايرة الإنزيم قبل مجرد حقن المنافذ تم تحميلها مع ركائز المقايسة. نقل الخرطوشة مع لوحة الأداة المساعدة لمحلل الجريان خارج الخلية. 
		ملاحظة: هذا عادة ما يكمل خلال 15-20 دقيقة ومعايرة أجهزة الاستشعار إجراء قياسات التعرف الضوئي على الحروف وعكر.</li>
		<li>بعد معايرة الخرطوشة، استبدال لوحة الأداة المساعدة مع لوحة المقايسة المعالجون مسبقاً التي تحتوي على الماغنيسيوم 3D والشروع في التحليل. بعد الانتهاء من القياسات، تصدير البيانات إلى جدول بيانات أو برامج الرسوم البيانية والإحصائية لتحليل البيانات-</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Nyga, A., Cheema, U., Loizidou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+tumour+models:+Novel+in+vitro+approaches+to+cancer+studies.">3D tumour models: Novel in vitro approaches to cancer studies.</a> J Cell Commun Signal. 5 (3), 239-248 (2011).</li><li>Ware, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+an+in+vitro+3D+PDAC+stroma+rich+spheroid+model.">Generation of an in vitro 3D PDAC stroma rich spheroid model.</a> Biomaterials. 108, 129-142 (2016).</li><li>Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+the+Petri+dish.">Beyond the Petri dish.</a> Nat Biotechnol. 22 (2), 151-152 (2004).</li><li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension.">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294, 1708-1712 (2001).</li><li>Imamura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+2D-+and+3D-culture+models+as+drug-testing+platforms+in+breast+cancer.">Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer.</a> Oncol Rep. 33 (4), 1837-1843 (2015).</li><li>Jiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reductive+carboxylation+supports+redox+homeostasis+during+anchorage-independent+growth.">Reductive carboxylation supports redox homeostasis during anchorage-independent growth.</a> Nature. 532 (7598), 255-258 (2016).</li><li>Yamada, K. M., Cukierman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Tissue+Morphogenesis+and+Cancer+in+3D.">Modeling Tissue Morphogenesis and Cancer in 3D.</a> Cell. 130 (4), 601-610 (2007).</li><li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue.">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).</li><li>Souza, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+tissue+culture+based+on+magnetic+cell+levitation.">Three-dimensional tissue culture based on magnetic cell levitation.</a> Nat Nanotech. 5 (4), 291-296 (2010).</li><li>Haisler, W. L., Timm, D. M., Gage, J. A., Tseng, H., Killian, T. C., Souza, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culturing+by+magnetic+levitation.">Three-dimensional cell culturing by magnetic levitation.</a> Nat Protoc. 8 (10), 1940-1949 (2013).</li><li>Tseng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+spheroid+toxicity+assay+using+magnetic+3D+bioprinting+and+real-time+mobile+device-based+imaging.">A spheroid toxicity assay using magnetic 3D bioprinting and real-time mobile device-based imaging.</a> Sci Rep. 5, 13987 (2015).</li><li>Tseng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Luminescent Viability Assays in Magnetically Bioprinted 3D Cultures. , 1-9 (2015).</li><li>Tseng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+a+three-dimensional+multitype+bronchiole+coculture+model+using+magnetic+levitation.">Assembly of a three-dimensional multitype bronchiole coculture model using magnetic levitation.</a> Tissue Eng Part C Methods. 19 (9), 665-675 (2013).</li><li>Daquinag, A. C., Souza, G. R., Kolonin, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+engineering+in+three-dimensional+levitation+tissue+culture+system+based+on+magnetic+nanoparticles.">Adipose tissue engineering in three-dimensional levitation tissue culture system based on magnetic nanoparticles.</a> Tissue Eng Part C, Methods. 19 (5), 336-344 (2013).</li><li>Tseng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-dimensional+co-culture+model+of+the+aortic+valve+using+magnetic+levitation.">A three-dimensional co-culture model of the aortic valve using magnetic levitation.</a> Acta Biomat. 10, 173-182 (2013).</li><li>Nicholls, D. G., Darley-Usmar, V. M., Wu, M., Jensen, P. B., Rogers, G. W., Ferrick, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Bioenergetic+profile+experiment+using+C2C12+myoblast+cells.">a Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells.</a> J Vis Exp. (46), e3-e7 (2010).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Acute+Extracellular+Flux+(XF)+Assay+to+Assess+Compound+Effects+on+Mitochondrial+Function.">The Acute Extracellular Flux (XF) Assay to Assess Compound Effects on Mitochondrial Function.</a> J Biomol Screening. 20 (3), 422-429 (2015).</li><li>Gibert, Y., McGee, S. L., Ward, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+profile+analysis+of+zebrafish+embryos.">Metabolic profile analysis of zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. (71), e4300 (2013).</li><li>Mookerjee, S. A., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+and+Analysis+of+Extracellular+Acid+Production+to+Determine+Glycolytic+Rate.">Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate.</a> J Vis Exp. (106), e53464 (2015).</li><li>Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Optimized+Protocol+to+Analyze+Glycolysis+and+Mitochondrial+Respiration+in+Lymphocytes.">An Optimized Protocol to Analyze Glycolysis and Mitochondrial Respiration in Lymphocytes.</a> J Vis Exp. (117), e54918 (2016).</li><li>Froeling, F. E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+culture+model+of+pancreatic+cancer+demonstrates+that+stromal+cells+modulate+E-cadherin,+beta-catenin,+and+Ezrin+expression+in+tumor+cells.">Organotypic culture model of pancreatic cancer demonstrates that stromal cells modulate E-cadherin, beta-catenin, and Ezrin expression in tumor cells.</a> Am J Pathol. 175 (2), 636-648 (2009).</li><li>Kim, J. W., Dang, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer's+molecular+sweet+tooth+and+the+warburg+effect.">Cancer's molecular sweet tooth and the warburg effect.</a> Cancer Res. 66 (18), 8927-8930 (2006).</li><li>Holley, A. K., Dhar, S. K., St. Clair, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curbing+cancer's+sweet+tooth:+Is+there+a+role+for+MnSOD+in+regulation+of+the+Warburg+effect.">Curbing cancer's sweet tooth: Is there a role for MnSOD in regulation of the Warburg effect.</a> Mitochondrion. 13 (3), 170-188 (2013).</li><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics,+2017.">Cancer statistics, 2017.</a> CA: Cancer J Clinicians. 67 (1), 7-30 (2017).</li><li>Lin, R. Z., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+three-dimensional+multicellular+spheroid+culture+for+biomedical+research.">Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research.</a> Biotechnol J. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).</li><li>Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+generation+of+homogeneous+multicellular+tumor+spheroids+applicable+to+a+wide+variety+of+cell+types.">Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types.</a> Biotechnol Bioeng. 83 (2), 173-180 (2003).</li></ol>

الكتاب جورج دبليو روجرز وأندرو نيلسون هي الموظفين/المساهمين اجيلنت التكنولوجيات التي تنتج المواد الكاشفة، والأدوات المستخدمة في هذه المقالة. أن تعلن جميع مؤلفين آخرين أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

استخدام سرطان البنكرياس، 3rd يؤدي سبب الإصابة بسرطان المتعلقة بالوفيات في الولايات المتحدة وضعت24، كمثال ونموذج، طريقة سريعة ومتسقة لتنمو والاعتداء الماغنيسيوم ثلاثي الأبعاد باستخدام ثقافة المشارك من خلايا سرطان البنكرياس و تنشيط البنكرياس الليفية. استخدام بيوبرينتينج المغناطيسي، وتم الحصول على الماغنيسيوم يتراوح حجمها بين 400-600 ميكرون في القطر. وهذه قد تعرضوا لفحوصات الأيضية لاختبار الأداء الوظيفي لالماغنيسيوم 3D مثقف بنجاح. هذه الطريقة بسيطة ومتسقة ويمكن تكييفها بسهولة لأنواع الخلايا الأخرى.
بينما سيتم التعجيل بهذه المنهجية وإضافة إلى قيمة متعدية لفحوصات يؤديها مع الماغنيسيوم 3D، يمكن تحسينها بتطوير التقنيات التي تسمح للإرسال المتعدد للتلاعب كروي والتعامل معها. هذا وينبغي مواصلة تخفيض الوقت الكلي، التكلفة والعمالة اللازمة للاضطلاع التحليل. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام وحدات التخزين كروي لتطبيع إشارات التعرف الضوئي على الحروف كما أفاد البعض الآخر6. حجم كروي تطبيع بمتوسط حجم خلية يمكن أن تستخدم لتحديد التعرف الضوئي على الحروف كل خلية، ولكن نظراً لنمو الماغنيسيوم لن تكون متطابقة، حساب مطلق التعرف الضوئي على الحروف كل خلية قد تكون صعبة. حاليا، وهذه المنهجية يحد الافتقار إلى أداة فعالة لمعالجة كروي متعدد ونقل من لوحات النمو الاعتداء على البيئة.
تعديل الأسلوب الموصوفة ومقتبس من التكنولوجيا بيوبرينتينج المغناطيسي، وكذلك التحقق من صحة لإظهار صلة وظيفية بتطبيق الماغنيسيوم مثقف فحص أيضي المتلقين للمعلومات. الأسلوب الذي يوفر أداة هامة لتوليد الماغنيسيوم قوية وقادرة على البقاء والوظيفية التي تحتوي على هذين النوعين الخلية الرئيسية الموجودة في معظم أنسجة الورم والخلايا السرطانية والسرطان المرتبطة الليفية، التي يمكن أن تستخدم لفحوصات أخرى الفحص، مثل شاشات المخدرات. بسهولة نسبية وكفاءة المنهجية NS تحسن كبير على أساليب أخرى25، مثل إسقاط الشنق الأسلوب2،26 من جيل كروي.
الماغنيسيوم القوية التي تم إنشاؤها على هذا النحو توفر نموذج ورم في المختبر الذي يتضمن الخلايا اللحمية، التي غالباً ما تكون مفقودة من دراسات الثقافة 3D كثيرة. إمكانيات تطبيق نماذج كروي ثلاثية الأبعاد التي تم إنشاؤها على هذا النحو واسعة. على سبيل المثال، يمكن استخدام هذه النماذج للتحقيق-خلية التفاعلات، تحولات الاستقلاب واختبار القابلية الوراثية والتبعية للأنظمة العلاجية المختلفة. الماغنيسيوم 3D أن الخص في فيفو وورم المكروية كأداة هامة ومفيدة جداً للمخدرات فحص الدراسات والدراسات التي تحقق آليات العمل من العلاجات الحالية والجديدة. فحوصات الأيض سبر مسارات الطاقة باستخدام الماغنيسيوم قد تساعد الثقافات مع خلايا متحولة ضوءا جديداً إلى دور تلك الجينات ومسارات ذات الصلة في بل في نموذج ثلاثي الأبعاد ذات صلة بالسرطان، مثل الماغنيسيوم الموصوفة في هذه الدراسة.
التطبيق الناجح لهذا الأسلوب يعتمد قبل كل شيء على صحة الخلايا المطلوبة للطباعة المغناطيسية، ولهذا السبب ينبغي أن تحصد الخلية تنمو في المرحلة لوغاريتمي وممغنط. من المهم استخدام محرك الأقراص الممغنطة كروي لطباعة الخلايا الممغنطة وليس إجراء محرك الأقراص، التي ينبغي أن تستخدم فقط أثناء الغسيل كروي وتجديد خطوات الأسلوب وصف وسائل الإعلام. الجانب الآخر الأكثر أهمية لقراءات ناجحة لفحوصات الأيض الحفاظ على مورفولوجية الماغنيسيوم أثناء عملية النقل من لوحة النمو إلى لوحة المقايسة.
وبوجه عام، أنشئت هذا البروتوكول لجيل الماغنيسيوم ثلاثية الأبعاد التي تحتوي على السرطان والخلايا اللحمية، بعد الفحص الأيضي اللاحقة من الماغنيسيوم استخدام محلل الجريان خارج الخلية. الميزات الرئيسية لهذا الأسلوب هي أن سريعة، وقابلة للتكيف بسهولة ومتسقة وذات الصلة إلى ويحاكي في فيفو وورم المكروية وغير مكلفة نسبيا وقد تخدم كأداة جديدة لدراسة البيولوجيا الورم ووضع السرطان وكلاء.

في العقد الماضي، وضعت العديدة في المختبر نماذج ثلاثية الأبعاد الخص والتحقيق في فيفو ورم المكروية، والبيولوجيا والنمو ظروف سرطان خلايا1،2. ثنائي الأبعاد (2D) أحادي الطبقة خلية ثقافة تفشل الأنظمة مع موحدة من التعرض للعوامل الكيميائية الحيوية ومركبات الفحص لتكرار التفاعلات ورم stromal 3D الأصلي يتعرض لتدرج للمركبات التي تم نشرها من خلال الخلية مصفوفة البروتينات (ECM)3،4. وهكذا، بالمقارنة مع نماذج 2D زراعة الأنسجة، والسرطان 3D نماذج ظهرت لإظهار أفضل المحتملة في محاكاة ورم المكروية وخدم كأدوات هامة لتحسين فهم في فيفو خصائص الورم، مثل نقص، ديسموبلاسيا والسكون، بينيترانسي المخدرات، وسمية والمقاومة العلاجية5،6. وتحقيقا لهذه الغاية، إمكانيات نماذج ثلاثية الأبعاد سد الفجوة بين الثقافة خلية ثنائية الأبعاد ونماذج حيوانية كله عن طريق محاكاة في فيفو ميزات الورم، بينما يجري غير مكلفة نسبيا والأمثل لتوليد السريع والاتساق. يجري استغلال هذه المزايا لتسريع البحوث متعدية الجنسيات في العديد من المجالات بما في ذلك سرطان علم الأحياء و morphogenesis والأنسجة الهندسة7،8.
في موجه من تطور أساليب زراعة أنسجة ثلاثية الأبعاد، مؤخرا تم تطوير تقنيات الاسترفاع المغنطيسي ووصف للنمو، المعايرة والتصوير من الماغنيسيوم المستمدة من مختلف الخلية أنواع9،10، 11 , 12-بيوبرينتينج 3D المغناطيسي يستغل استخدام القوى المغناطيسية هندسة الأنسجة بجذب الخلايا مع جسيمات نانوية متوافق حيويا وطباعتها في تنسيقات متعددة جيدا. وهذا يسمح للإنتاج السريع ليتمشى، قرب الماغنيسيوم 3D متطابقة، التي يمكن تسخيرها واستخدامها لعدد كبير تطبيقات المتلقين للمعلومات للتحقيق البيوكيميائية والفيزيائية الحيوية10. هنا أننا قد تكيفت تقنية بيوبرينتينج المغناطيسي باستخدام مادة متوافق حيويا يسمى نانوشوتلي (NS) تتألف من أكسيد الحديد، وبولي L-يسين وجسيمات نانو الذهب لتسمية خلايا سرطان البنكرياس والخلايا الليفية. تولي NS الكهربية الاستاتية لغشاء البلازما، غير معروف لربط أي مستقبلات محددة، والنشرات خارج الخلية السطحية في غضون أسبوع. أنه يتطلب قوات مغناطيسية منخفضة جداً (30pN)، وما يكفي للتجميع ولكن الضرر لا خلايا ولا يؤثر على بقاء الخلية، والايض أو انتشار لجعله متوافق حيويا جداً للثقافات 3D10،13،14 ،15.
في هذه الدراسة، باستخدام سرطان البنكرياس كمثال ونموذج، ونحن وصف جيل والفحص الأيضي من 3D سرطان الخلية-تنتجها الخلايا الليفية الماغنيسيوم. بدءاً من الخلايا المستزرعة في 2D السفن، نحن لتوضيح ظروف الثقافة ونمو ورم البنكرياس-تنتجها الخلايا الليفية الماغنيسيوم ثقافة المشارك باستخدام بيوبرينتينج المغناطيسي. ثم استخدمت الماغنيسيوم المستزرعة في فحوصات الأيض الوظيفية باستخدام محلل الجريان خارج الخلية، أثبتت تقنية للتدبير في نفس الوقت مسارين المنتجة الكبرى لتوليد الطاقة، وتحلل والتنفس المتقدرية، في مجموعة متنوعة من العيش الخلايا والأنسجة16،،من1718،،من1920. وتم قياس تحلل كتغير في معدل تحمض خارج الخلية (عكر)، في حين تم قياس التنفس المتقدرية أو الفسفرة كمعدل استهلاك الأوكسجين (OCR). ونحن نقترح أن هذا الأسلوب الماغنيسيوم ورم البنكرياس يمكن بمثابة العمود الفقري للاستفادة المثلى وترجمة جيل كروي الورم 3D ومقايسة لأنواع الخلايا/أنسجة أخرى.

<table style="border-collapse:collapse;width:646pt" width="861">
	<colgroup>
		<col style="width:186pt" width="248" />
		<col style="width:140pt" width="187" />
		<col style="width:89pt" width="119" />
		<col style="width:230pt" width="307" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl22" height="21" style="width:186pt;height:15.75pt" width="248">0.05% Trypsin EDTA</td>
			<td class="xl22" style="width:140pt" width="187">Sigma</td>
			<td class="xl34" style="width:89pt" width="119">25300-054</td>
			<td class="xl35" style="width:230pt" width="307"></td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl19" height="42" style="width:186pt;height:31.5pt" width="248">96 well cell repellant plate</td>
			<td class="xl19" style="width:140pt" width="187">USA Scientific/ Griener Bio-One</td>
			<td class="xl26" style="width:89pt" width="119">655970</td>
			<td class="xl21">spheroid growth plate</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl19" height="21" style="width:186pt;height:15.75pt" width="248">Cellometry Cell counting slides</td>
			<td class="xl19" style="width:140pt" width="187">Nexcelom&#160;</td>
			<td class="xl26" style="width:89pt" width="119">CHT4-SD100-002</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl19" height="20" style="width:186pt;height:15.0pt" width="248">D-Glucose</td>
			<td class="xl19" style="width:140pt" width="187">Sigma</td>
			<td class="xl26" style="width:89pt" width="119">D9434</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl19" height="20" style="width:186pt;height:15.0pt" width="248">DPBS</td>
			<td class="xl19" style="width:140pt" width="187">Gibco</td>
			<td class="xl26" style="width:89pt" width="119">14190-144</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl19" height="21" style="width:186pt;height:15.75pt" width="248">Glycolysis Stress Test Kit</td>
			<td class="xl19" style="width:140pt" width="187">Agilent Technologies</td>
			<td class="xl26" style="width:89pt" width="119">103020-100</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl19" height="21" style="width:186pt;height:15.75pt" width="248">L-Glutamine</td>
			<td class="xl19" style="width:140pt" width="187">Sigma</td>
			<td class="xl26" style="width:89pt" width="119">59202C</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl19" height="21" style="width:186pt;height:15.75pt" width="248">Mitochondrial Stress Test Kit</td>
			<td class="xl19" style="width:140pt" width="187">Agilent Technologies</td>
			<td class="xl26" style="width:89pt" width="119">103015-100</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl19" height="21" style="width:186pt;height:15.75pt" width="248">n3D Magnetic Spheroid drive</td>
			<td class="xl19" style="width:140pt" width="187">Nano3D Bioscience</td>
			<td class="xl26" style="width:89pt" width="119">655841</td>
			<td class="xl21">Part of Spheroid Bioprinting Kit</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl19" height="42" style="width:186pt;height:31.5pt" width="248">n3D Magnetic Spheroid holding drive</td>
			<td class="xl19" style="width:140pt" width="187">Nano3D Bioscience</td>
			<td class="xl26" style="width:89pt" width="119">655841</td>
			<td class="xl21">Part of Spheroid Bioprinting Kit</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl19" height="21" style="width:186pt;height:15.75pt" width="248">n3D NanoShuttle-PL&#160;</td>
			<td class="xl19" style="width:140pt" width="187">Nano3D Bioscience</td>
			<td class="xl26" style="width:89pt" width="119">655841</td>
			<td class="xl21">Part of Spheroid Bioprinting Kit:&#160; store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl19" height="21" style="width:186pt;height:15.75pt" width="248">Patu8902 cells</td>
			<td class="xl19" style="width:140pt" width="187">Laboratory Stock</td>
			<td class="xl19" style="width:89pt" width="119"></td>
			<td class="xl21">pancreatic ductal adenocarcinoma cells</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl19" height="21" style="width:186pt;height:15.75pt" width="248">PS1 cells</td>
			<td class="xl19" style="width:140pt" width="187">Laboratory Stock</td>
			<td class="xl19" style="width:89pt" width="119"></td>
			<td class="xl21">activated pancreatic stellate cells</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl19" height="21" style="width:186pt;height:15.75pt" width="248">RPMI1640</td>
			<td class="xl19" style="width:140pt" width="187">Gibco</td>
			<td class="xl26" style="width:89pt" width="119">11875-093</td>
			<td class="xl21">growth media for cells, spheroids</td>
		</tr>
		<tr height="45" style="height:33.75pt">
			<td class="xl19" height="45" style="width:186pt;height:33.75pt" width="248">SeaHorse XFe96 extracellular flux analyzer</td>
			<td class="xl19" style="width:140pt" width="187">Agilent Technologies</td>
			<td class="xl26" style="width:89pt" width="119"></td>
			<td class="xl21">extracellular flux analyzer</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl19" height="21" style="width:186pt;height:15.75pt" width="248">Sodium Pyruvate</td>
			<td class="xl19" style="width:140pt" width="187">Sigma</td>
			<td class="xl26" style="width:89pt" width="119">S8636</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="24" style="height:18.0pt">
			<td class="xl19" height="24" style="width:186pt;height:18.0pt" width="248">XF Base media</td>
			<td class="xl19" style="width:140pt" width="187">Agilent Technologies</td>
			<td class="xl26" style="width:89pt" width="119">102365-100</td>
			<td class="xl21">base media for metabolic assays on XFe96</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and metabolic assay of 3-dimensional spheroid co-cultures of pancreatic cancer cells and fibroblasts

العديد من أنواع السرطان، بما في ذلك سرطان البنكرياس، وقد ستروما تليفية كثيفة التي تلعب دوراً هاما في تطور الورم والغزو. الليفية المنشط السرطان المرتبطة هي عنصر رئيسي ستروما الورم التي تتفاعل مع الخلايا السرطانية ودعم النمو والبقاء على قيد الحياة. نماذج الخص التفاعل بين الخلايا السرطانية وتنشيط الخلايا الليفية أدوات هامة لدراسة البيولوجيا stromal وتنمية عوامل انتيتومور. هنا، يتم وصف طريقة لتوليد ثقافة قوية كروي (3D) ثلاثي الأبعاد المشارك من خلايا سرطان البنكرياس وتنشيط الخلايا الليفية البنكرياس التي يمكن استخدامها في الدراسات البيولوجية اللاحقة السريع. بالإضافة إلى ذلك، وصف استخدام 3D الماغنيسيوم في القيام بفحوصات الأيض الفنية للتحقيق في سبل الاستقلاب الخلوي استخدام محلل الجريان خارج الخلية يقترن صفيحة كروي. خلايا سرطان البنكرياس (Patu8902) والخلايا تنشيط البنكرياس تنتجها الخلايا الليفية (PS1) قد شارك مثقف وممغنط استخدام جمعية نانوحبيبات متوافق حيويا. وكانت الزنزانات ممغنط سرعة بيوبرينتيد باستخدام محركات الأقراص المغناطيسية في شكل جيد 96، في وسائط النمو لتوليد الماغنيسيوم يبلغ قطرها يتراوح بين 400-600 ميكرون في غضون 5-7 أيام للثقافة. وأجريت فحوصات الأيض الوظيفية باستخدام Patu8902-PS1 الماغنيسيوم ثم استخدام تقنية الجريان خارج الخلية لسبر مسارات حيوية الخلوية. الأسلوب هنا بسيطة ويتيح الجيل متسقة من سرطان الخلية-تنتجها الخلايا الليفية كروي الثقافات المشتركة ويمكن تكييفه محتملة أخرى أنواع الخلايا السرطان عند تحسين المنهجية الحالية لوصف.

سير العمل العام بيوبرينتينج المغناطيسي وتحليل تدفق خارج الخلية من الماغنيسيوم 3D 
ويصور الشكل 1 لمحة عامة عن العملية برمتها الموصوفة في هذا البروتوكول. تم استزراع خلايا سرطان البنكرياس (Patu8902) وتنشيط الخلايا النجمية (PS1) في قوارير زراعة الأنسجة التي تحتوي على وسائط النمو المناسب إلى كونفلوينسي من 70-80%. خلايا منفصلة من السفينة الثقافة 2D وغسلها، وكثافة الخلايا مصممة والخلايا وأخيراً حراكه في وسائط النمو في 1 × 106 خلايا/مل. واستخدمت لجذب الخلايا NS، تشكل جمعية نانوحبيبات تتكون من الذهب، وأكسيد الحديد، وبولي-L-يسين. خلايا Patu8902 و PS1 ممغنط على حدة ثم مختلطة وطباعتها على لوحات نمو الخلية طارد 96-كذلك شنت على محرك أقراص مغناطيسية كروي. ونحن قد الأمثل 15,000 أن العدد الإجمالي للخلايا لبذر بئر واحدة (5,000 Patu8902 الخلايا المختلطة مع 10,000 PS1 الخلايا لتوليد كروي واحد). بعد الحضانة تحت ظروف زراعة الأنسجة مناسبة لمدة 5-7 أيام، وقد تحققت الماغنيسيوم ثلاثي الأبعاد، خلال الوقت الذي رصد نمو هذه الماغنيسيوم وسجلت. بعد الغسل بمقايسة وسائط الإعلام، نقلوا الماغنيسيوم جسديا على ميكروسكوبية كروي القيام بفحوصات الأيض استخدام محلل الجريان خارج الخلية القياس المتزامن لتحلل والتنفس المتقدرية.
الثقافة ونمو ورم البنكرياس-تنتجها الخلايا الليفية الماغنيسيوم للحصول على الماغنيسيوم الوظيفية وقوية، الخلايا السرطانية الظهارية خط Patu8902 وتنشيط الخلايا النجمية PS1 كانت مثقف في ربمي-1640 تستكمل مع المصل البقري الجنين. Pat8902 وخلايا PS1 المغنطة مع NS ثم مختلطة معا في نسبة 1:2، حيث البذور مجموعة خلايا 15,000 كل بئر في صفيحة نمو. خلال 24 ساعة من طباعة الخلايا على محركات الأقراص الممغنطة، الخلايا موجهة إلى مركز البئر بالضبط على رأس كل دبوس المغناطيسي تحت كل بئر. تم رصد نمو الماغنيسيوم Patu8902-PS1 بالتصوير في أيام 2 و 4، 7 و 9 بعد زرع الخلايا. ويبين الشكل 2 تقدير متوسط قطرها الماغنيسيوم الممثل في مختلف النقاط الزمنية المذكورة أعلاه. قطر الماغنيسيوم يزيد من 414 ميكرومتر في اليوم 2 إلى 596 ميكرومتر في يوم 7 وظيفة الطباعة. هناك لا يوجد فرق كبير بين النمو في أيام 7 و 9، وهكذا جميع كذلك التجريب محدودة لمدة 7 أيام نمو كروي. لاحظنا أن الماغنيسيوم الحصول مورفولوجيا أكثر وضوحاً لا سيما حول الحواف الخارجية و NS تدريجيا هو موزع بشكل متساو في جميع أنحاء حجم كروي مع الأيام أكثر في الثقافة. ونحن أيضا تقدر كروية الماغنيسيوم 10 استناداً إلى طول محاورها الرئيسية والثانوية. هو كروية متوسط 0.92 ± 0.04 لوحدها Patu8902 (الورم)، 0.95 ± 0.04 ل PS1 (stromal) وحدها و 0.94 ± 0.02 الماغنيسيوم ثقافة المشارك.
الفحص الأيضي الوظيفية من البنكرياس الماغنيسيوم ثلاثي الأبعاد باستخدام محلل الجريان خارج الخلية لاختبار الأداء الوظيفي ل الماغنيسيوم، استخدمنا الأيض والاستقلاب التحليل للتحقيق في مسارات الطاقة في الماغنيسيوم. قمنا بتنفيذ اختبار إجهاد تحلل على الماغنيسيوم مثقف كما هو موضح أعلاه. وتحقيقا لهذه الغاية، تعرضوا الماغنيسيوم المتولدة من الخلايا Patu8902 أو PS1 بالإضافة إلى تلك الناتجة عن ثقافة المشارك من أنواع الخلايا اثنين للمقايسة. من المثير للاهتمام، كل ثلاثة أنواع من الماغنيسيوم، سواء التي تنشأ من خلايا منفصلة أو مختلطة، أظهرت استجابة وظيفية بيولوجيا للمقايسة ضريبة السلع والخدمات. عند الحقن بتشبع تركيز الجلوكوز، اختبار أنواع الماغنيسيوم تظهر زيادات في مسار glycolytic كما يتضح من زيادة في أكار (الشكل 3). عندما كانت تعوق المتقدرية ATP الإنتاج باستخدام أوليجوميسين، ينتقل إلى تحلل إنتاج الطاقة ودفع الخلايا إلى أقصى قدرة glycolytic، ينظر إليها على أنها زيادة في أكار. تثبيط تحلل استخدام 2-المديرية العامة، جلوكوز تناظرية تنافسية يربط hexokinase الجلوكوز، أدت إلى انخفاض في أكار، مؤكدا أن الزيادة السابقة في أكار كان بسبب نشاط جليكوليتيك. لاحظنا أن الماغنيسيوم اختبارها في هذه الدراسة ورد على هذا النحو، على الرغم من أن الماغنيسيوم PS1 وحدها (متوسط قطرها 250 ميكرومتر) إشارة أقل نسبيا، ربما بسبب حجمها أصغر وأقل قدرة glycolytic مقارنة بالسرطان Patu8902 خلايا (متوسط قطرها 600 ميكرون). وبصفة عامة، إشارة عكر أعلى من خلية الورم المشتقة الماغنيسيوم مقارنة بتلك التي تنتجها الخلايا الليفية PS1 أصغر نسبيا من الماغنيسيوم، وربما يمكن أن يعزى إلى الأصيل الميل الأيضية للخلايا السرطانية نحو تحلل22، 23. كافة الأنواع الثلاثة من الماغنيسيوم مستمدة من البذور على نفس العدد من الخلايا، وعلى الرغم من أن لاحظنا كروي حجم الاختلاف بين كل نوع، مع PS1 الماغنيسيوم وحدها يجري أصغر، تليها الماغنيسيوم ثقافة المشارك، ويجري Patu8902 الماغنيسيوم وحدها أكبر.
لاختبار الوظيفة المتقدرية في 3D الماغنيسيوم، نتعرض الماغنيسيوم ثقافة المشارك مقايسة MST. MST تدابير المعالم الرئيسية للوظيفة المتقدرية بقياس التعرف الضوئي على الحروف خلايا (الشكل 4أ و 4B) مباشرة. حقنه مسلسل مع المركبات (أوليجوميسين، فككب، ومزيج من والروتينون وأنتيميسين A) استخدمت لقياس البارامترات المتقدرية الرئيسية، مثل إنتاج ATP والتنفس القصوى والتنفس غير المتقدرية. كذلك استخدمت هذه المعلمات ومعدلات التنفس القاعدية لحساب تسرب بروتون وقطع غيار قدرة الجهاز التنفسي (الشكل 4). انخفاض في التعرف الضوئي على الحروف في الرد على أوليجوميسين، مثبط ATP synthase (مجمع الخامس) يرتبط بالتنفس المتقدرية المرتبطة بإنتاج ATP الخلوي. كانت المحتضنة الماغنيسيوم مع أوليجوميسين لمدة أطول للسماح بتغلغل القصوى ووقت استجابة فعالة. حقنه ثانية مع أونكوبلير فككب يحفز الاستهلاك القصوى الأوكسجين وزيادة مناظرة في التعرف الضوئي على الحروف. التعرف الضوئي على الحروف حفزت فككب استخدمت لحساب قدرة الجهاز التنفسي قطع الغيار، مقياسا لقدرة الخلية على الاستجابة للطلب المتزايد على الطاقة. حقن الثالث؛ مزيج والروتينون، (مجمع أنا المانع)، وأنتيميسين أ (مثبط الثالث المعقدة) يمنع التنفس المتقدرية، ينظر إليها على أنها انخفاض حاد في التعرف الضوئي على الحروف (الشكل 4بأونج >).
وعموما، تأكيد ملاحظاتنا وظيفة مثقف الماغنيسيوم استخدام محلل تدفق خارج الخلية كتدبير الأيضية البصمة/نشاطهم على حد سواء من حيث إمكانية glycolytic والميتوكوندريا كما هو موضح أعلاه.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56081/56081fig1.jpg"> 
الشكل 1 . التمثيل التخطيطي لمنهجية للثقافة والفحص لسرطان البنكرياس خلايا/تنتجها الخلايا الليفية الماغنيسيوم. Patu8902 PS1cells مثقف، تريبسينيزيد، وغسلها وحسابها. لبذر كل كروي، Patu8902 (5,000 الخلايا أيضا) وكانت ممغنط PS1 الليفية (10,000 الخلايا في البئر) استخدام NS والمطبوعة على صفيحة نمو طارد خلية في يوم 1. بعد البذر، شنت على محرك أقراص مغناطيسية كروي (مع مغناطيس واحد تحت كل بئر لصفيحة النمو تنسيق جيد 96) لوحة النمو ويسمح للثقافة لمدة 2-7 أيام للحصول على الماغنيسيوم 3D. تم غسلها الماغنيسيوم الناتجة ونقلها إلى ميكروبلاتيس المقايسة كروي القيام بفحوصات الأيض في أداة التمويه خارج الخلية. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56081/56081fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56081/56081fig2.jpg"> 
الشكل 2 . نمو ورم البنكرياس-تنتجها الخلايا الليفية الماغنيسيوم. (أ) صورة تمثيلية ل Patu8902-PS1 ثقافة المشارك كروي المقابلة إلى اليوم في الثقافة يظهر في الجزء العلوي وهو كمياً حجم قطره من كروي (ميكرومتر) أدناه. ويتضح زيادة مطردة في حجم كروي ونشر جزيئات NS (بقع داكنة) في جميع أنحاء حجمه بين 2 و 7 أيام. وأبقى الماغنيسيوم في الثقافة لمدة 2 يوما إضافية بعد هذا، الذي لم يؤد إلى زيادة كبيرة في القطر كروي. (ب) يتم عرض الصور ممثل من الماغنيسيوم المستمدة من الخلايا السرطانية (Patu8902)، خلايا ستروما (PS1) والخلايا المستزرعة المشترك (Patu8902 + PS1). يتم تصوير البيانات (ج) كروية من 10 الماغنيسيوم الفردية من كل مجموعة. أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري (SD). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56081/56081fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56081/56081fig3.jpg"> 
الشكل 3 . تحلل "اختبار الإجهاد" (GST) مع الماغنيسيوم البنكرياس. (أ) التخطيطي تمثيل مقايسة نموذجية الدالة جليكوليتيك مع مختلف البارامترات المقايسة يصور. (ب) مثال على اختبار GST أجريت على الماغنيسيوم البنكرياس المزروع باستخدام المنهجية الموصوفة. سلالم حقن الجلوكوز حتى تحلل ينظر إليها على أنها زيادة في أكار، مع زيادة أخرى على إضافة أوليجوميسين إيقاف التنفس المتقدرية. يقع أكار ردا على 2-المديرية العامة، بث تنافسية من السكر، بمنع تحلل. وأشار إلى الماغنيسيوم كل يحمل استجابة فنية للمقايسة ضريبة السلع والخدمات. (ج) إنتاج الإنزيم ضريبة السلع والخدمات باستخدام منشئ التقرير الخاص بالشركة المصنعة التي تصور المعلمات الرئيسية الثلاث للمقايسة ضريبة السلع والخدمات. أشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري للوسط (SEM). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56081/56081fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56081/56081fig4.jpg"> 
الشكل 4. Mitochondrial اختبار الإجهاد (MST) مع الماغنيسيوم Patu8902-PS1- (A) ويرد التخطيطي تمثيل مقايسة الوظيفة المتقدرية نموذجية مع مختلف البارامترات المقايسة. (ب) مثال على MST على الماغنيسيوم ورم البنكرياس-تنتجها الخلايا الليفية ويرد. الماغنيسيوم 3D (ج) ثقافة المشارك يحمل استجابة فنية للمقايسة MST. كما هو متوقع، وقد لوحظ الوظيفة المتقدرية تقاس كانخفاض في التعرف الضوئي على الحروف عندما طعن الماغنيسيوم مع أوليجوميسين، مثبطات سينثاز ATP. استخدام فككب لتكثيف تدفق الإلكترون أسفرت عن التعرف الضوئي على الحروف القصوى، التي انهارت فورا على تثبيط استخدام التنفس المتقدرية-كوكتيل مثبطات الميتوكوندريا المعقدة. أشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري للوسط (SEM). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56081/56081fig4large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts at JoVE.com

Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts

هنا، يتم وصف أسلوب للتحضير لثقافة المشارك كروي ثلاثي الأبعاد (3D) لخلايا سرطان البنكرياس والخلايا الليفية، متبوعاً بقياس وظائف الأيضية باستخدام محلل الجريان خارج الخلية.

الإعداد والتحليل الأيضي الثقافات المشارك كروي ثلاثي الأبعاد لخلايا سرطان البنكرياس والخلايا الليفية

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

تقييم الأيضية للخلايا اللوكيميا الرئيسية

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

مقايسة قتل كروي من خلايا تي السيارة

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture

محاكاة والتلاعب في البنكرياس حؤول Acinar للأقنية في ثقافة الخلية 3 الأبعاد

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

بالبالكامل الإنسان القائم علي الورم مصفوفة في ثلاثه الابعاد كروي الغزو الفحص

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

تقييم صلاحية الخلية والموت في الثقافات الكروية ثلاثية الأبعاد للخلايا السرطانية

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

نموذج Spheroid 3D كنظام أكثر فسيولوجية للتمييز الليفي المرتبطة بالسرطان والغزو في الدراسات المختبرية

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

Time-Lapse 2D Imaging of Phagocytic Activity in M1 Macrophage-4T1 Mouse Mammary Carcinoma Cells in Co-cultures

الوقت الفاصل بين التصوير 2D من النشاط Phagocytic في M1 الضامة-4T1 الفئران سرطان الثدي خلايا في الثقافات المشتركة

Tumor-associated macrophages (TAMs) have been identified as an important component for tumor growth, invasion, metastasis, and resistance to cancer ...

Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

عزل خلايا شبيهه بالجذعية من ثقافات كروي ثلاثية الابعاد

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

Generation of an Orthotopic Xenograft of Pancreatic Cancer Cells by Ultrasound-Guided Injection

Pancreatic cancer (PCa) represents one of the deadliest cancer types worldwide. The reasons for PCa malignancy mainly rely on its intrinsic malignant ...

Real-Time Detection and Capture of Invasive Cell Subpopulations from Co-Cultures

الكشف في الوقت الحقيقي والتقاط المجموعات الفرعية للخلايا الغازية من الثقافات المشتركة

Invasion and metastatic spread of cancer cells are the major cause of death from cancer. Assays developed early on to measure the invasive potential of ...