Name: generation of native chromatin immunoprecipitation sequencing libraries for nucleosome density analysis
Uploaded: 2017-12-12T12:30:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis at JoVE.com

A.L. était soutenue par une bourse d’études supérieures canadiennes de l’instituts de recherche en santé du Canada. Ce travail a été soutenu par des subventions de Génome Colombie-Britannique et les Instituts canadiens de recherche en santé (IRSC-120589) dans le cadre de l’épigénétique canadiens, l’environnement et l’Initiative Consortium de recherche en santé et par le programme d’Institut de recherche Terry Fox Subvention de projet #TFF-122869 M.H. et une Institut de recherche Terry Fox bourse de nouveau chercheur (subvention # 1039) à M.H.

<ol>
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Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Compte tenu de la nature combinatoire de modification de la chromatine et nucléosome positionnement dans la régulation transcriptionnelle, une méthode qui permet la mesure simultanée de ces caractéristiques est susceptible d’offrir de nouvelles perspectives sur la régulation épigénétique. Le ndChIP-seq présenté ici est un protocole de ChIP-seq natif optimisé permettant l’interrogation simultanée de modification d’histone et densité des nucléosomes dans rares cellules primaires9,10. ndChIP-seq utilise la digestion enzymatique de la chromatine qui, lorsqu’il est couplé au séquençage massivement parallèle jumelé-fin et un modèle de distribution de mélange gaussien, permet les modifications d’histone enquête au niveau de single nucléosome et le déconvolution des profils épigénomique entraînée par l’hétérogénéité au sein d’une population. Utilisant ce protocole, nous avons déjà rapporté une distribution unique de tailles de fragment immuno-précipité, déterminée par jumelé-fin lire limites, associées aux États de chromatine spécifiques définies par ChromHMM10,24.
La qualité d’une bibliothèque de ndChIP-seq dépend de multiples facteurs, comme la spécificité de l’anticorps et de sensibilité, des conditions optimales de digestion MNase et qualité de la chromatine. La spécificité de l’anticorps utilisé est cruciale dans la production réussie ndChIP-seq bibliothèque. Un anticorps idéal montre une affinité élevée contre l’épitope d’intérêt avec peu de réactivité croisée avec les autres épitopes. Il est également important de choisir des billes magnétiques avec l’affinité de l’anticorps de choix.
MNase digestion est une réaction critique et sensibles au temps et concentration dans le présent protocole. Par conséquent, lors du traitement des échantillons multiples, il est important que chaque réaction est incubée pendant une durée équivalente (Voir l’étape 2.2). La qualité de la chromatine est un autre facteur que les effets significativement le résultat de ndChIP-suiv. fragmentés chromatine entraîne un profil de digestion MNase sous-optimal et résultats dans les bibliothèques avec un faible rapport signal sur bruit. Des échantillons primaires avec faible viabilité cellulaire ou dégradent de la chromatine, tels que fixés au formol des tissus inclus en paraffine (FFIP) ne sont pas recommandés pour ce protocole.
L’ajout d’un PIC au cours de l’extraction de la chromatine réduit non désirés (c.-à-d., aléatoire) chromatine fragmentation et préserve l’intégrité des queues d’histone. Par conséquent, PIC doit être ajoutée au tampon de lyse et immunoprécipitation tampon juste avant d’utiliser. Tandis que la sélection de cellules par cytométrie en flux, sélectionnez des cellules viables et vérifiez les cellules sont triés à un faible débit pour augmenter la précision de l’estimation numéro de cellulaire et de la viabilité des cellules. Éviter le tri des cellules directement dans le tampon de lyse. Le tampon de la gaine va diluer le tampon de lyse et empêche efficacement perméabilisation de la membrane cellulaire à MNase. Selon un type de cellules ou d’organismes, titrage de MNase peut être nécessaire d’obtenir une digestion optimale.
ndChIP-seq sur cellules de mammifères nécessite une profondeur minimale de séquençage de 50 millions jumelé-lectures (fragments de 25 millions) pour les marques étroites et 100 millions jumelé-lectures (fragments de 50 millions) pour l’entrée et les grandes marques. L’algorithme de distribution gaussienne de mélange ne pas fonctionne de manière optimale sur les bibliothèques qui ont été séquencés jusqu'à une profondeur largement inférieures de cette recommandation. ndChIP-seq classera pas promoteurs avec peu de distinction entre la valeur de la distribution pondérée pour des longueurs de fragment de mono - et di-nucléosomes dans mono - ou di-nucléosomes dominé promoteurs. Par conséquent, ces promoteurs doivent être enlevés dans l’analyse qui suit. Réplicats biologiques peuvent être générés pour accroître la confiance dans les distributions prédites et identifier la variabilité technique dans la construction de la digestion et bibliothèque MNase.
Contrairement aux itérations précédentes de protocoles natifs de ChIP-seq, ndChIP-seq fournit les moyens d’enquêter sur les effet combinatoire de modification de structure et les histones de la chromatine en utilisant la taille de fragment post immunoprécipitation pour intégrer la densité du nucléosome, déterminé par l’accessibilité MNase, avec mesures de modification des histones. Demande de ndChIP-seq primaires de cellules et tissus fournira de nouveaux aperçus de la nature intégrative de régulation épigénétique et permettre l’identification de signatures épigénétiques en raison de l’hétérogénéité au sein de la population.

Le génome des eucaryotes est emballé dans la chromatine par répétition de structures nucléosome qui se composent de deux copies de quatre protéines histones (p. ex., H2A, H2B, H3 et H4) circonscrits par 146 paires de bases d’ADN1,2. Complexes de remodelage de la chromatine nucleosome à stabiliser des limites gène promoteur et participent à la régulation de l’expression génique en altérant l’accessibilité de l’ADN à des facteurs de transcription et de l’ARN polymérase machines3, 4.
Aminés terminales queues des histones dans les nucléosomes sont soumis à diverses modifications covalentes, y compris l’acétylation, méthylation, phosphorylation, ubiquitination, sumoylation, formylation et hydroxylation des acides aminés spécifiques5 , 6 , 7 , 8. postes et degrés de ces modifications exigent un état de la chromatine qui influencent la chromatine structure et contrôle l’accès des complexes moléculaires qui permettent l’activation de la transcription,7. Étant donné que les deux modifications de densité et histone nucléosome jouent un rôle dans le contrôle local de la transcription des gènes, nous avons développé une approche native de puce qui permet la mesure simultanée de la densité du nucléosome et histone modification9, 10.
Natif de ChIP-seq profite de la nucléase de micrococci endonucléase (MNase) pour digérer la chromatine intacte dans son état natif dans le noyau11,12, une propriété qui a été mis à profit pour faire correspondre les nucléosomes positionnement13 , 14 , 15. densité nucléosome ChIP-seq (ndChIP-seq) tire profit de la propriété de l’accès préférentiel de MNase pour ouvrir les régions de chromatine pour générer des mesures qui allient accessibilité MNase histone modification10. ndChIP-seq est adapté pour le profilage des modifications d’histone dans les rares cellules primaires, des tissus et des cellules cultivées. Nous présentons ici un protocole détaillé qui permet la génération d’ensembles de données de séquence pour un travail de cadre analytique décrit précédemment10 qui intègre le fragment taille post immunoprécipitation, déterminée par jumelé-fin lire les limites, à en même temps étudier MNase accessibilité avec mesures de modification des histones. Auparavant, l’application du présent protocole au sang de cordon humain primaire 10 000 dérivés CD34+ les cellules et les cellules souches embryonnaires humaines ont révélé une relation unique entre la chromatine structure et histone modifications au sein de ces cellules types10 . Compte tenu de sa capacité à mesurer simultanément l’accessibilité nucléosome et modification d’histone, ndChIP-seq est capable de révéler épigénomique caractéristiques dans une population de cellules à un niveau unique nucléosome et de résoudre les signatures hétérogènes dans leurs éléments constitutifs. Enquête des promoteurs bivalents, où H3K4me3, une marque active et H3K27me3, une marque répressive, sont présents10, est un exemple de l’exploration des populations cellulaires hétérogènes par ndChIP-seq.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	
	<tbody>
		<tr >
			<td >1M Tris-HCl &#8211;pH 7.5</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >15567-027</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1M Tris-HCl &#8211;pH 8</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >15568-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.5M EDTA</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5M NaCl</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >1001385276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >1001412354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium-Deoxycholate</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >1001437582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SDS</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >15525-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium-Bicarbonate</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >S233-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100% EtOH</td>
			<td >NA</td>
			<td >NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >V-bottom 96 well plate (AB 1400)</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >AB-1400-L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gilson P2 pipetman</td>
			<td >Mandel</td>
			<td >F144801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gilson P10 pipetman</td>
			<td >Mandel</td>
			<td >F144802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gilson P20 pipetman</td>
			<td >Mandel</td>
			<td >F123600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gilson P100 pipetman</td>
			<td >Mandel</td>
			<td >F123615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gilson P200 pipetman</td>
			<td >Mandel</td>
			<td >F123601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gilson P1000 pipetman</td>
			<td >Mandel</td>
			<td >F123603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micrococcal Nuclease&#160;</td>
			<td >NEB</td>
			<td >M0247S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thermo Mixer C (Heating block mixer)</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >5382000023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Multi 12-channel Pippet P20</td>
			<td >Rainin</td>
			<td >17013803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Multi 12-channel Pippet P200</td>
			<td >Rainin</td>
			<td >17013805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1.5 ml LoBind tube</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.5 ml LoBind tube</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >22431005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic Plate Cover</td>
			<td >Edge Bio</td>
			<td >48461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PCR cover</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td >MSD-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Aluminum Plate Cover</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td >MSF-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Elution buffer (EB buffer)</td>
			<td >Qiagen</td>
			<td >19086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1M DTT</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >646563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Eppendorf 5810R centrifuge&#160;</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >22625004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ultrapure water</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Protein G dynabeads</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >10001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Protein A dynabeads</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >10001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Protease inhibitor Cocktail</td>
			<td >Calbiochem</td>
			<td >539134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Rotating platform</td>
			<td >Mandel</td>
			<td >1b109-12052010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plate magnet</td>
			<td >Alpaqua</td>
			<td >2523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Domed 12-cap strip</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td >TCS1201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Buffer G2</td>
			<td >Qiagen</td>
			<td >1014636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Protease</td>
			<td >Qiagen</td>
			<td >19155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Tube Magnet (DynaMag-2)</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
		<td>Tube Magnet (DynaMag-2)</td>
			<td >LabCore</td>
			<td >730-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >V shape Plastic reservoir</td>
			<td >Mandel</td>
			<td >S0100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vortex</td>
			<td >Mandel</td>
			<td >C1801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mini Fuge</td>
			<td >Mettler Toledo</td>
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			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Analytical scale</td>
			<td >Mandel</td>
			<td >LB109-12052010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Quick Ligation Reaction Buffer, 5X</td>
			<td >NEB</td>
			<td>B6058S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNA Polymerase I, Large (Klenow) Fragment</td>
			<td >NEB</td>
			<td>M0210S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Klenow Fragment (3&#39;-5&#39; exo)</td>
			<td >NEB</td>
			<td>M0212S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >T4 DNA Polymerase</td>
			<td >NEB</td>
			<td>M0203S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td >NEB</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Deoxynucleotide Solution mix, 10mM</td>
			<td >NEB</td>
			<td>N0447S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >dATP Solution 10mM</td>
			<td >NEB</td>
			<td>N0440S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Quick T4 DNA Ligase</td>
			<td >NEB</td>
			<td>M0202T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adenosine 5&#39;-Triphosphate (ATP), 25mM</td>
			<td >NEB</td>
			<td>P0756S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNA Polymerase</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td>F549L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NEBuffer 2</td>
			<td >NEB</td>
			<td>B7002S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hank&#39;s buffered salt solution</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td>14025076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td>A3160702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >phosphate buffer saline&#160;</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >H3K4me3</td>
			<td >Cell Signaling</td>
			<td >9751S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >H3K4me1</td>
			<td >Diagenode</td>
			<td >C15410037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >H3K27me3</td>
			<td >Diagenode</td>
			<td >pAb-069-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >H3K36me3</td>
			<td >Abcam</td>
			<td >ab9050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >H3K9me3</td>
			<td >Diagenode</td>
			<td >C15410056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SeraMag&#160; super-paramagnetic beads</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of native chromatin immunoprecipitation sequencing libraries for nucleosome density analysis

Nous présentons une immunoprécipitation de la chromatine native mis à jour le séquençage protocole expérimental (ChIP-seq) compatible avec une méthodologie de l’analyse de distribution basée mélange gaussien (densité nucléosome ChIP-seq ; ndChIP-seq) qui permet la génération de combinée des mesures d’accessibilité de la nucléase micrococcique (MNase) avec modification d’histone Génome-large. Position du nucléosome et densité locale et la modification post-traductionnelle de leurs sous-unités d’histone, agissent de concert pour réguler les États locaux de transcription. Des mesures d’accessibilité nucléosome avec modification d’histone générée par ndChIP-seq combinatoires permet l’interrogation simultanée de ces fonctionnalités. La méthodologie ndChIP-seq est applicable à un petit nombre de cellules primaires inaccessibles à réticulation selon des protocoles de ChIP-seq. L’ensemble ndChIP-seq permet la mesure de la modification des histones en combinaison avec une densité de nucléosomes local pour obtenir de nouvelles connaissances sur les mécanismes communs qui régulent la transcription de l’ARN au sein des populations rares cellules primaires.

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Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Génération d’immunoprécipitation de la chromatine Native séquençage des bibliothèques pour l’analyse de densité de nucléosomes

Nous présentons une immunoprécipitation de la chromatine native mis à jour le séquençage (ChIP-seq) méthodologie pour la production d’ensembles de données de séquence pour un cadre d’analyse des nucléosomes densité ChIP-seq intégrant l’accessibilité nucléase micrococcique (MNase) avec mesures de modification d’histone.

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

Optimisation et analyse comparative des méthodes d&#39;enrichissement de l&#39;ADN des plantes organiques Convient pour le séquençage de la prochaine génération

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

Recherche

Génétique

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Analyse du promoteur du ligand c-KIT utilisant l&#39;immunoprécipitation de la chromatine

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

Immunoprécipitation à la chromatine (ChIP) dans les lignes de cellules T de souris

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatine protocole d’immunoprécipitation (puce) pour les échantillons embryonnaires de faible abondance

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Génération de chromatine Genome-wide Conformation Capture bibliothèques d’embryons de drosophile début étroitement mise en scène

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) des Modifications d’Histone de Saccharomyces cerevisiae

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue

Immunoprécipitation de la chromatine du murin tissu adipeux brun

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells

Chromatin Immunoprecipitation Assay Utilisation de nucléases micrococciques dans les cellules de mammifères

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...

Discovering CsgD Regulatory Targets in Salmonella Biofilm Using Chromatin Immunoprecipitation and High-Throughput Sequencing (ChIP-seq)

Discovering CsgD Regulatory Targets in Salmonella Biofilm Using Chromatin Immunoprecipitation and High-Throughput Sequencing ChIP-seq

Découverte des cibles réglementaires de csgD dans le biofilm de Salmonella utilisant l'immunoprécipitation de chromatine et le séquençage à haut débit (ChIP-seq)

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-seq) is a technique that can be used to discover the regulatory targets of transcription ...

Optimization for Sequencing and Analysis of Degraded FFPE-RNA Samples

Optimisation du séquençage et de l’analyse des échantillons d’ARN FFPE dégradés

Gene expression analysis by RNA sequencing (RNA-seq) enables unique insights into clinical samples that can potentially lead to mechanistic understanding ...