Name: generation of native chromatin immunoprecipitation sequencing libraries for nucleosome density analysis
Uploaded: 2017-12-12T12:30:00
Duration: 10 min 5 s
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アダムローリーは健康の研究のカナダの協会からカナダ大学院奨学金によって支えられました。この作品はゲノム ブリティッシュ コロンビア州、カナダ研究所の健康研究 (機構 120589) カナダのエピジェネティクス、環境および健康研究コンソーシアム イニシアチブの一部としてからの助成金やテリー Fox 研究所プログラム サポートされています。プロジェクト助成金 #TFF-122869 取扱い、取扱いにテリー Fox 研究所新しい調査官賞 (グラント # 1039)

<ol>
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著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

クロマチンの修飾とヌクレオソームの転写調節における配置の組合せの性質を考えると、これらの機能の同時測定を可能にするメソッドは、エピジェネティック制御に新たな洞察を提供する可能性が高いです。ここで示される ndChIP seq プロトコルは、ヒストン修飾とまれな一次電池9,10ヌクレオソーム密度の同時尋問をできるように最適化ネイティブ チップ seq プロトコルです。ndChIP seq クロマチンの酵素の消化力を利用して、ペアエンド大量並列シーケンスとガウス混合分布モデルに結合された場合、単一ヌクレオソーム レベル調査のヒストンの修正をできるようにと、集団内の不均一性によるエピゲノム プロファイルのデコンボリューション。このプロトコルを使用して、境界、ChromHMM10,24によって定義されている特定のクロマチン状態に関連付けられているを読むペアエンドによって決まります、免疫沈澱フラグメント サイズの独自のディストリビューションを以前報告しています。
NdChIP seq ライブラリの品質は、抗体の特異性と感度、最適な MNase 消化条件の chromatin の品質など複数の要因に依存します。使用される抗体の特異性は、成功 ndChIP seq ライブラリの生産に重要です。理想的な抗体は、他のエピトープを持つ小さな交差反応と関心のエピトープに対して高い親和性を示しています。好みの抗体の高い親和性と磁気ビーズを選択することも重要です。
MNase 消化はこのプロトコルで重要かつ時間と濃度感受性反応です。したがって、複数のサンプルを処理するときは、各反応が時間の同量の培養です重要です (手順 2.2 参照)。Chromatin の品質は、低信号対雑音比の最適 MNase 消化プロファイルとライブラリの結果 ndChIP シーケンス断片化クロマチン リードの結果が大きく影響する別の要因です。低次のサンプルは、細胞の生存率やホルマリン固定パラフィン包埋 (FFPE) 組織はこのプロトコルの推奨されませんようクロマチンの低下します。
クロマチン抽出の間に写真の付加を低減 (すなわち、ランダム) クロマチンの断片化と保持の整合性ヒストンの尾を望ましくないです。そのため、PIC を使用する換散バッファーおよび免疫沈降バッファーの直前に追加する必要があります。実行可能なセルを選択し、フローサイトメトリー、を介して選択するセル間細胞は細胞数の推定値の精度と細胞の生存率を向上する低流量で並べ替えられます。換散バッファーに直接セルを並べ替えを避けます。シース バッファーは換散バッファーを希釈して MNase に細胞膜の有効透過を防ぐことができます。細胞または有機体の種類に応じて MNase の滴定は最適な消化を取得する必要があります。
哺乳動物細胞 ndChIP seq 広いマークおよび入力のため狭いマークおよび 1 億対読み取り (5000 万フラグメント) のため 5000 万対読み取り (2500 万フラグメント) の最小のシーケンスの深さが必要です。ガウス混合分布アルゴリズムは、この勧告の大幅下深度化されているライブラリには最適な実行されません。ndChIP seq ないモノラルまたはディ ヌクレオソームの支配のプロモーターにモノラルとディ ヌクレオソーム フラグメントの長さの配分値の間少し分離とプロモーターにより分類されます。したがって、これらのプロモーターは、その後の分析で削除する必要があります。予測分布の信頼性を向上し、MNase 消化と図書館建設の技術的な変動を識別する生物の複製を生成できます。
ネイティブ チップ seq プロトコルの以前のイテレーションとは異なり ndChIP seq はヌクレオソーム密度を統合するフラグメント サイズのポスト免疫沈降法を用いたクロマチン構造とヒストンの修正の組合せの効果を調査するための手段を提供します。MNase アクセシビリティ、ヒストン変更の測定によって決定されます。NdChIP seq の初代培養細胞や組織への応用はエピジェネティック制御の統合的な性質に新しい洞察力を提供し、集団内での不均一性によるエピジェネティックな署名の識別を許可します。

真核生物のゲノムは、146 の塩基対の DNA1,2に囲まれた 4 つのヒストン蛋白質 (例えばH2A、H2B、H3、および H4) の 2 つのコピーを含むヌクレオソーム構造を繰り返しを介してクロマチンにパッケージされています。クロマチン改造複合体遺伝子プロモーターの境界内のヌクレオソームの位置を制御し、dna の転写因子、RNA ポリメラーゼ機械3、アクセシビリティを変更することにより遺伝子発現の調節に関与 4。
ヌクレオソームのヒストンのアミノ ターミナル尾はアセチル化、メチル化、リン酸化、ユビキチン化、sumo 化、化、および特定のアミノ酸5の水酸化反応を含む種々 の共有結合修飾を受ける,6,7,8します。 位置とこれらの変更の度転写7のアクティベーションを許可する分子複合体のクロマチン構造と制御アクセスに影響を与えるクロマチンの状態を決定します。ヌクレオソームの密度とヒストン修正9の同時測定を可能にするネイティブ チップ アプローチを開発私たちことを考えると両方のヌクレオソーム密度とヒストン修飾は、遺伝子転写のローカル制御の役割を果たす、 10。
ネイティブ チップ seq エンドヌクレアーゼ球菌ヌクレアーゼの本来の状態、核11,12ヌクレオソームの13の配置をマップに活用されているプロパティ内でそのままクロマチンを消化する (MNase) の活用します。,14,15. ヌクレオソーム密度チップ seq (ndChIP-seq) MNase アクセシビリティを組み合わせてヒストン修正10測定を生成するクロマチン領域を開く MNase の優先的なアクセスのプロパティを活用します。ndChIP seq は珍しい初代培養細胞、組織および培養細胞におけるヒストン修飾のプロファイリングに最適です。ここでは、フラグメント サイズのポスト免疫沈降、ペアエンドに境界を読むによって決定を統合する前述の分析フレーム作業10に適したシーケンス データセットの生成を可能にする詳細なプロトコルを提案します。同時にヒストン修正測定 MNase アクセシビリティを調査します。以前は、このプロトコルの 10,000 の主な臍帯血への応用派生 CD34+細胞とヒト胚性幹細胞はこれらの内のクロマチン構造とヒストン修飾関係のユニークな携帯型10 明らかに.ヌクレオソーム アクセシビリティとヒストン修飾を同時に測定する能力を与え、ndChIP seq は単一ヌクレオソーム レベルで細胞のエピゲノム機能を明らかにし、解決に異種の署名が可能です、構成要素。NdChIP seq によって異種の細胞集団の探査の例は H3K4me3、アクティブなマークと H3K27me3、抑圧的なマークの両方が現在10二価プロモーターの調査です。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	
	<tbody>
		<tr >
			<td >1M Tris-HCl &#8211;pH 7.5</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >15567-027</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1M Tris-HCl &#8211;pH 8</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >15568-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.5M EDTA</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5M NaCl</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >1001385276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >1001412354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium-Deoxycholate</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >1001437582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SDS</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >15525-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium-Bicarbonate</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >S233-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100% EtOH</td>
			<td >NA</td>
			<td >NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >V-bottom 96 well plate (AB 1400)</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >AB-1400-L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gilson P2 pipetman</td>
			<td >Mandel</td>
			<td >F144801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gilson P10 pipetman</td>
			<td >Mandel</td>
			<td >F144802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gilson P20 pipetman</td>
			<td >Mandel</td>
			<td >F123600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gilson P100 pipetman</td>
			<td >Mandel</td>
			<td >F123615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gilson P200 pipetman</td>
			<td >Mandel</td>
			<td >F123601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gilson P1000 pipetman</td>
			<td >Mandel</td>
			<td >F123603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micrococcal Nuclease&#160;</td>
			<td >NEB</td>
			<td >M0247S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thermo Mixer C (Heating block mixer)</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >5382000023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Multi 12-channel Pippet P20</td>
			<td >Rainin</td>
			<td >17013803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Multi 12-channel Pippet P200</td>
			<td >Rainin</td>
			<td >17013805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1.5 ml LoBind tube</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.5 ml LoBind tube</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >22431005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic Plate Cover</td>
			<td >Edge Bio</td>
			<td >48461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PCR cover</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td >MSD-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Aluminum Plate Cover</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td >MSF-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Elution buffer (EB buffer)</td>
			<td >Qiagen</td>
			<td >19086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1M DTT</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >646563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Eppendorf 5810R centrifuge&#160;</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >22625004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ultrapure water</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Protein G dynabeads</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >10001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Protein A dynabeads</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >10001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Protease inhibitor Cocktail</td>
			<td >Calbiochem</td>
			<td >539134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Rotating platform</td>
			<td >Mandel</td>
			<td >1b109-12052010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plate magnet</td>
			<td >Alpaqua</td>
			<td >2523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Domed 12-cap strip</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td >TCS1201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Buffer G2</td>
			<td >Qiagen</td>
			<td >1014636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Protease</td>
			<td >Qiagen</td>
			<td >19155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Tube Magnet (DynaMag-2)</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
		<td>Tube Magnet (DynaMag-2)</td>
			<td >LabCore</td>
			<td >730-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >V shape Plastic reservoir</td>
			<td >Mandel</td>
			<td >S0100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vortex</td>
			<td >Mandel</td>
			<td >C1801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mini Fuge</td>
			<td >Mettler Toledo</td>
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			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Analytical scale</td>
			<td >Mandel</td>
			<td >LB109-12052010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Quick Ligation Reaction Buffer, 5X</td>
			<td >NEB</td>
			<td>B6058S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNA Polymerase I, Large (Klenow) Fragment</td>
			<td >NEB</td>
			<td>M0210S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Klenow Fragment (3&#39;-5&#39; exo)</td>
			<td >NEB</td>
			<td>M0212S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >T4 DNA Polymerase</td>
			<td >NEB</td>
			<td>M0203S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td >NEB</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Deoxynucleotide Solution mix, 10mM</td>
			<td >NEB</td>
			<td>N0447S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >dATP Solution 10mM</td>
			<td >NEB</td>
			<td>N0440S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Quick T4 DNA Ligase</td>
			<td >NEB</td>
			<td>M0202T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adenosine 5&#39;-Triphosphate (ATP), 25mM</td>
			<td >NEB</td>
			<td>P0756S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNA Polymerase</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td>F549L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NEBuffer 2</td>
			<td >NEB</td>
			<td>B7002S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hank&#39;s buffered salt solution</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td>14025076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td>A3160702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >phosphate buffer saline&#160;</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >H3K4me3</td>
			<td >Cell Signaling</td>
			<td >9751S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >H3K4me1</td>
			<td >Diagenode</td>
			<td >C15410037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >H3K27me3</td>
			<td >Diagenode</td>
			<td >pAb-069-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >H3K36me3</td>
			<td >Abcam</td>
			<td >ab9050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >H3K9me3</td>
			<td >Diagenode</td>
			<td >C15410056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SeraMag&#160; super-paramagnetic beads</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of native chromatin immunoprecipitation sequencing libraries for nucleosome density analysis

(チップ seq) 実験的プロトコルとガウス混合分布解析手法 (ヌクレオソーム密度チップ seq; ndChIP seq) の生成を可能にする互換性のある配列変更されたネイティブ クロマチン免疫沈降を提案します。ヒストン修飾ゲノムとミクロコッカスヌクレアーゼ (MNase) のアクセシビリティの結合された測定。ヌクレオソームの位置と局所密度と翻訳後修飾ヒストン亜単位のローカル転写状態を規制するコンサートで行動します。NdChIP シーケンスによって生成されたヒストン修飾とヌクレオソーム アクセシビリティの組合せ測定は、これらの機能の同時の尋問のためことができます。NdChIP seq 方法論ベースのチップ seq プロトコルを架橋にアクセスできない一次電池の小さな数字に適用されます。NdChIP seq 一緒に取られて、珍しい主細胞内 RNA 転写を制御する共有メカニズムへの新しい洞察を取得するローカル ヌクレオソーム密度とヒストン修飾の組み合わせでの測定が可能。 にします。

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Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

ネイティブのクロマチン免疫沈降のヌクレオソーム密度解析ライブラリをシーケンスの生成

提案するミクロコッカスヌクレアーゼ (MNase) のアクセシビリティを統合ヌクレオソーム密度チップ seq 解析フレームワークに適したシーケンス データセットの生成 (チップ seq) 方法論をシーケンス変更されたネイティブ クロマチン免疫沈降ヒストン修正測定。

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

次世代シークエンシングに適した植物オルガネラDNA濃縮法の最適化と比較分析

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

クロマチン免疫沈降法を用いたc-KITリガンドプロモーターの解析

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

マウスT細胞株におけるクロマチン免疫沈降（ChIP）

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

クロマチン免疫沈降 (チップ) プロトコル低豊富な胚サンプル

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

しっかりと段階的な初期のショウジョウバエの胚からゲノムワイドなクロマチン構造キャプチャ ライブラリの生成

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

酵母からヒストン修飾のクロマチン免疫沈降 (チップ)

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue

マウスの褐色脂肪組織のクロマチン免疫沈降

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells

哺乳類細胞における微小コッカルヌクレアーゼを用いてクロマチン免疫沈殿アッセイ

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...

Discovering CsgD Regulatory Targets in Salmonella Biofilm Using Chromatin Immunoprecipitation and High-Throughput Sequencing (ChIP-seq)

Discovering CsgD Regulatory Targets in Salmonella Biofilm Using Chromatin Immunoprecipitation and High-Throughput Sequencing ChIP-seq

クロマチン免疫沈降とハイスループットシーケンシング(ChIP-seq)を用いたサルモネラバイオフィルムにおけるCsgD調節標的の発見

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-seq) is a technique that can be used to discover the regulatory targets of transcription ...

Optimization for Sequencing and Analysis of Degraded FFPE-RNA Samples

分解されたFFPE-RNAサンプルのシーケンシングと分析の最適化

Gene expression analysis by RNA sequencing (RNA-seq) enables unique insights into clinical samples that can potentially lead to mechanistic understanding ...