Name: pulling membrane nanotubes from giant unilamellar vesicles
Uploaded: 2017-12-07T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles at JoVE.com

Forfatterne takke Benoit Sorre, Damien Cuvelier, Pierre Nassoy, François Quemeneur og Gil Toombes for deres afgørende bidrag til at etablere metoden nanorør i gruppen. P.B. gruppe tilhører CNRS konsortium CellTiss, Labex CelTisPhyBio (ANR-11-LABX0038) og Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02). F. C. Tsai blev finansieret af EMBO langsigtede fellowship (ALTF 1527-2014) og Marie Curie aktioner (H2020-MSCA-IF-2014 og projekt membran-ezrin-actin). M.S. er en Junior Fellow af Simons samfund af medmennesker.

1. forberedelse af GUVs af Electroformation på Pt-ledninger
<ol><li>Ren electroformation-kammer (Se Introduktion og figur 1A) og Pt-ledningerne med et organisk opløsningsmiddel som ethanol eller acetone at vaske væk lipider og vand til at vaske væk salte. Bemærk: Foreslår vi grundigt tørre væk rester med ethanol-gennemblødt væv og derefter sonicating i acetone, ethanol, så vandet, hver i 5 min.</li>
	<li>Forberede en lipid blanding af en ønskede lipid sammen...

Metoden med at trække rør fra GUVs giver rige oplysninger på membran-protein-system, så det er ikke kun et middel til at måle de grundlæggende mekaniske egenskaber af membranen, men det hjælper til at kaste lys over koblingen mellem proteiner og membran krumning. Som omtalt i indledningen, andre teknikker findes for at måle virkningerne af membran-buede proteiner, enten ved at inkubere proteiner med sub micron Liposomer tøjret til en passivated overflade18,19<...

Mange cellulære processer, såsom endocytose, menneskehandel, dannelsen af filopodia, infektion, osv., er ledsaget af en dramatisk ændring i form af cellemembraner1,2. I cellen deltager en række proteiner i disse processer ved at binde sig til membranen og ændre deres form. De mest bemærkelsesværdige eksempler er medlemmer af familien Bin/Amphiphysin/autocampere (BAR) protein, der indeholder en karakteristisk uløseligt buet BAR domæne3,4,5,6,7. Typisk, de interagerer med membranen ved at tilslutte domænet BAR til overfladen, og i mange tilfælde også grundt indsætte amphipathic helices i tolagede. Form, størrelse og beregning af domænet BAR sammen med antallet af amphipathic helices bestemmer: (1) i retning af membran krumning (dvs., om de vil fremkalde invaginations eller fremspring), og (2) omfanget af membran krumning5,8. Af note, er positiv krumning her defineret som den konvekse side af den buede membran, dvs, bule mod de interagerende partikel, og negative ellers. Desuden kvantitative undersøgelser af BAR proteiner afsløret, at deres virkning på membranen afhænger af en række fysiske parametre: overflade tæthed af proteiner, membran spændinger og membran form (flad versus rørformede versus sfæriske figur)7. Afhængigt af disse parametre BAR proteiner kan: (1) fungerer som sensorer af membran krumning, (2) bøje membraner, eller (3) fremkalde membran virksomhedsdeling7.
På grund af det store antal af involverede i membranen omformningen i cellen, at studere de kvantitative aspekter af fænomener, såsom endocytose komponenter, er i vivo ekstremt udfordrende. In vitro rekonstituering af minimal komponenter efterligne buede membraner i cellen giver mulighed for at få en mekanistisk forståelse af hvordan membran-buede proteiner fungere. I denne artikel beskrives en protokol for at rekonstruere en membran nanorør in vitro- ved hjælp af micromanipulation, Fluorescens mikroskopi og optiske pincet. Metoden kan bruges til at studere i en kvantitativ måde, hvordan proteiner, lipider, eller små molekyler interagere med buede membraner. Lipid GUVs bruges som modeller af en cellemembran, hvis krumning er ubetydelig i forhold til størrelsen af interagerende membran-buede molekyler. De er tilberedt ved hjælp af electroformation metoden9 hvor vesikler er dannet af hydrating en lipid film og hævelse i GUVs under en vekselstrøm (AC)10. Mest almindelige substrater som GUVs dyrkes er enten semi-ledende plader overtrukket med indium tin oxid (ITO) eller platinum ledninger (Pt-ledninger)11. I dette arbejde dyrkes GUVs på Pt-ledninger, som denne metode har vist sig at fungere meget bedre end alternativet med at gøre GUVs i nærværelse af salte i buffer12. Selvom electroformation protokol er beskrevet her i tilstrækkelige detaljer til at gengive det, henvise vi læseren til tidligere artikler hvori lignende og andre metoder til at gøre GUVs er beskrevet detaljeret13,14. I vores hænder, har electroformation på Pt-ledninger med held givet GUVs fra en blanding af syntetiske lipider eller naturlige lipid ekstrakter i en buffer, som indeholder ~ 100 mM NaCl. Derudover blev det også muligt at indkapsle proteiner inde i GUVs under væksten. Et eksempel electroformation kammer er vist i figur 1A; Det består af to ~ 10 cm lange Pt-ledninger sat ind i en holder, der er fremstillet af polytetrafluorethylen (PTFE) der kan forseglet på begge sider med glas coverslips ~ 1-2 cm fra hinanden (figur 1A).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56086/56086fig1.jpg"> Figur 1: eksperimentel opsætning. (A) GUV electroformation kammer med elektriske forbindelsesdele knyttet til Pt-ledninger. (B) venstre: eksperimenterende systemet viser mikroskop, den eksperimentelle kammer over målet og to Mikropipetter (venstre og højre) knyttet til micromanipulators og indsættes i den eksperimentelle kammer for tube trække og protein injektion. Højre: et nærbillede af den eksperimentelle kammer monteret over målet viser tips af aspiration og injektion Mikropipetter indsat. (C) en sprøjten udstyret med en tynd dispenser indsat i en mikropipette på sin back-end. Bunden er et nærbillede af dispenser inde mikropipette med den blå prikkede linje skitserer mikropipette. Dette system bruges til at udfylde mikropipette med kasein passivering glasoverfladen og tilbage fyld med mineralsk olie efter behov. (D) A system anvendes til Aspirér µL mængder af protein løsning. Nålen er tilsluttet en sprøjte og slanger, som er forbundet til injektion mikropipette. Mikropipette tip er omhyggeligt nedsænket i protein løsning og indsugning så for at udfylde den mikropipette spids. Mikropipette udfyldes derefter tilbage med mineralsk olie ved hjælp af det system, der er vist i panelet C. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56086/56086fig1large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
En membran nanorør, spænder i radius fra 7 nm til flere hundrede nm, kan trækkes fra en GUV af en ekstern kraft. Denne metode blev oprindeligt designet til at måle de elastiske egenskaber af cellemembraner og vesikler, såsom bøjning stivhed15,16. I de seneste værker, blev metoden udvidet til at studere samspillet mellem proteiner med buede membraner af microinjecting proteiner nær trak nanorør7,17. Andre metoder er blevet udviklet for at studere membran-buede proteiner. I én metode inkuberes proteiner med forskellige størrelser Liposomer tøjret til en passivated overflade. Konfokal mikroskopi anvendes til at måle protein bindingen som en funktion af Liposom diameter, hvilket kan indikere krumning-induceret sortering18,19. I en anden metode, er proteiner indsprøjtet i nærheden af en mikro-indsugning GUV at måle deres evne til at fremkalde spontant tubuli20,21. De i denne protokol beskrevne metode er unikt tilpasset til at studere membran-buede proteiner involveret i endocytose, hvor de fleste proteiner typisk støder på præfabrikerede membran nanorør forbinder cargo-holdige membran invagination med den underliggende flad plasma membran. Desuden i denne metode, er i modsætning til i analysen med tøjret lille Liposomer, membran nanorør konstant tilsluttet membran; Derfor er det i mekanisk ligevægt med GUV, en situation forventes i vivo. Derfor grundlæggende membran fysik gælder, og vi kan udlede et væld af mekaniske egenskaber af vores målinger22,23,24.
For en fuldstændig gennemførelse af denne metode omfatter det nødvendige udstyr en Konfokal mikroskop, Optisk pincet, og en eller to Mikropipetter tilsluttet en vandtank (figur 1B). Ved at kombinere alle tre, er det muligt at samtidig måle membran spændinger, membran krumning, overflade tæthed af proteiner, og tube kraft25. Mikropipette aspiration er afgørende og det opbygges nemt ved at indsætte et glas mikropipette i indehaveren tilsluttet en vandtank, der via hydrostatisk tryk, styrer aspiration pres26. Mikropipette og indehaveren styres af en micromanipulator og ideelt set i én retning ved en piezo-aktuator til præcision bevægelse. For at trække en nanorør, microaspirated GUV kortvarigt fast til en micron mellemstore perle derefter trukket væk skaber et nanorør. I denne implementering holdes perlen af optisk pincet, der kan konstrueres ved at følge en offentliggjort protokol27. Det er muligt at give afkald af optisk pincet og pull nanorør på forskellige måder, selv på bekostning af præcise kraft målinger. Hvis det er for udfordrende at bygge en optisk fælde eller hvis force målinger er ikke afgørende, som hvis man blot ønsker at kontrollere proteiner forkærlighed for buede membraner, kan en slange trækkes ved hjælp af en perle indsugning på spidsen af en anden mikropipette28. Det er også muligt at trække rørene ved hjælp gravitationel kraft29 eller flow30,31. Derudover heller konfokalmikroskopi ikke er væsentlige; dog foretrækkes det så til at måle overflade tætheden af proteiner. Det giver også mulighed for måling af nanorør radius fra fluorescens intensiteten af lipider i røret, således uafhængigt af membran kraft og spændinger. Udlede tube radius fra fluorescens er især vigtigt, hvis forholdet mellem disse mængder afviger fra veletablerede ligninger på grund af tilstedeværelsen af membran-overholdt proteiner25. Vigtigere, man kan ikke give afkald af både optisk fælde og konfokal mikroskopi, da det ikke vil være muligt at måle tube krumning.
Metoden som beskrevet i denne protokol er blevet brugt til at studere krumning-induceret sortering af forskellige perifere Membranproteiner på nanorør, for det meste dem fra de BAR familie25,32,33,34 . Det viste sig også at conically formet transmembrane kalium kanal KvAP er beriget på buet nanorør på samme måde som BAR proteiner35. Ved at optimere metoden for at indkapsle proteiner inde i GUVs, er samspillet mellem proteiner og negativ krumning for nylig undersøgt som godt36. Desuden, denne metode har været brugt til at belyse dannelsen af protein stilladser25,37 og studere mekanismen af membran virksomhedsdeling enten linje spænding38, protein dynamin39, eller BAR proteiner40,41. Ud over proteiner, kan små molekyler eller ioner også fremkalde krumning. Du bruger denne metode, blev calciumioner vist sig at fremkalde positive krumning under salt-fri betingelser42. Interessant, har det også vist at lipider kan gennemgå krumning sortering, selvom kun til kompositioner, der er i nærheden af et demixing punkt43,44. I sum, metoden, der kan bruges af forskere interesseret i at undersøge hvordan enten integreret membran komponenter (fx, lipider eller transmembrane proteiner) eller perifert bindende molekyler (enten indenfor eller udenfor GUVs) interagere med cylindrically buet membraner, fra mekanisk og kvantitativ synspunkter. Det er også beregnet til dem interesseret i at måle de mekaniske egenskaber af membranen selv22,23,45.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DOPC)</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850375</td>
			<td>Example lipid used in data for Figure 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000] [DSPE-PEG(2000)-biotin]</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>880129</td>
			<td>biotinylated lipid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BODIPY-TR-C5-ceramide</td>
			<td>Molecular Probes (ThermoFisher)</td>
			<td>D7540</td>
			<td>fluorescent lipid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BODIPY- FLC5-hexadecanoyl phosphatidylcholine (HPC*)</td>
			<td>Molecular Probes (ThermoFisher)</td>
			<td></td>
			<td>fluorescent lipid for protein density calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>egg L-&#945;-phosphatidylcholine (eggPC)</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>840051</td>
			<td>used for calibrating the tube radius constant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-casein from bovine milk (&#62;99%)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C6905</td>
			<td>used for passivating the micropipette and the experimental chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+) glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10708976001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>osmometer</td>
			<td>Loser</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pt-wires, 0.5 mm diameter, 99.99% pure</td>
			<td>Goodfellow USA</td>
			<td>PT005139</td>
			<td>used for GUV electroformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>function generator</td>
			<td></td>
			<td>n/a</td>
			<td>used to create current for GUV electroformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>putty sealant</td>
			<td>Vitrex (from CML France)</td>
			<td>CRIT 140013</td>
			<td>used to seal the electroformation chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bath sonicator</td>
			<td></td>
			<td>n/a</td>
			<td>useful to clean the electroformation chamber, but not crucial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon TE2000 inverted microscope, eC1 confocal system (Nikon), with two laser lines (&#955; = 488 nm and 543 nm); optical tweezers induced by a 5 W ytterbium fiber continuous wave laser (&#955; &#62; 1070 nm; IPG GmBH Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>an example of a confocal microscopy system equipped with optical tweezers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulators</td>
			<td></td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosilicate capillaries (with internal and external radii of 0.78 mm and 1 mm, respectively)</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>30-0036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microforge</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MF-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>piezoelectric actuator</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polystyrene streptavidin coated beads (diameter 3.2 &#181;m)</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>SVP-30-5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pulling membrane nanotubes from giant unilamellar vesicles

Omdannelsen af cellemembranen er en integreret del af mange cellulære fænomener, såsom endocytose, menneskehandel, dannelsen af filopodia, osv. Mange forskellige proteiner associere med buede membraner på grund af deres evne til at fornemme eller fremkalde membran krumning. Typisk, disse processer indebærer en lang række proteiner, hvilket gør dem alt for kompleks til at studere kvantitativt i cellen. Vi beskriver en protokol for at rekonstruere en buet membran i vitro, efterligne en buet cellestruktur, såsom endocytic halsen. En kæmpe unilamellar vesikel (GUV) bruges som en model af en cellemembran, hvis indre pres og overfladespænding styres med mikropipette aspiration. Anvende en punkt trækkraft på GUV ved hjælp af optiske tweezers skaber et nanorør høj krumningsradius tilsluttet en flad membran. Denne metode har traditionelt været brugt til at måle de grundlæggende mekaniske egenskaber af lipid membraner, såsom bøjning stivhed. I de seneste år, er det blevet udvidet for at studere, hvordan proteiner interagerer med membran krumning og den måde de påvirker figuren og mekanik af membraner. Et system, der kombinerer micromanipulation, mikroinjektion, Optisk pincet og konfokal mikroskopi tillader måling af membran krumning, membran spændinger og overflade tætheden af proteiner, samtidigt. Fra disse målinger, kan mange vigtige mekaniske og morfologiske egenskaber af protein-membran system udledes. Desuden lå vi ud en protokol for at skabe GUVs fysiologiske saltkoncentration, og en metode til kvantificering af den overflade tæthed af proteiner på en membran fra fluorescens intensiteter af mærket proteiner og lipider.

Tube-trækker eksperimentet kan give vigtige mekaniske oplysninger om membranen. I mangel af proteiner eller andre molekyler, der parret med membran krumning, membranen kraft og tube radius kan være relateret til membran spændinger ved at anvende Canham-Helfrich Hamiltonske ligning til en tube trukket fra en GUV50,51 
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56086/...

Watch this Scientific Journal Video about Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles at JoVE.com

Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles

Mange proteiner i cellen fornemme og fremkalde membran krumning. Vi beskriver en metode til at trække membran nanorør fra lipid vesikler til at studere samspillet mellem proteiner eller eventuelle krumning-aktive molekyle med buede membraner in vitro.

Trække membran nanorør fra Giant Unilamellar blærer

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many ...

Research

JoVE Journal

Biology

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

Måling peptid translokation i store Unilamellar Vesikler

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1.  Many of these are referred ...

Examining BCL-2 Family Function with Large Unilamellar Vesicles

Undersøgelse BCL-2 familie funktion med store unilamellære vesikler

The BCL-2 (B cell CLL/Lymphoma) family is comprised of approximately twenty proteins that collaborate to either maintain cell survival or initiate ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Rekonstituering af et transmembranprotein, Voltage ionkanal, KvAP, i Giant unilamelvesikler til mikroskopi og Patch clamp-forsøg

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Mikroperfusionskammerindretning Teknik at undersøge Regulering af mikrokardannelse permeabilitet i rotte mesenterium

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Flow Cytometric analyse af ekstracellulære vesikler fra celle-aircondition medier

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies

Isolering af hjerte- og vaskulære glatte muskelceller fra voksne, unge, larve- og embryonale zebrafisk til elektrofysiologiske undersøgelser

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the ...

Detection and Quantification of Tunneling Nanotubes Using 3D Volume View Images

Detektion og kvantificering af tunnelnanorør ved hjælp af 3D-volumenvisningsbilleder

Recent discoveries have revealed that cells perform direct, long-range, intercellular transfer via nano-scale, actin-membrane conduits, namely ...

Production and Imaging of Recombinant Protein-Filled Vesicles from E. coli

Optimized Production and Analysis of Recombinant Protein-Filled Vesicles from E. coli

The Production of Recombinant Proteins (Video) | JoVE

Optimeret produktion og analyse af rekombinante proteinfyldte vesikler fra E. coli

This innovative system, using a short peptide tag, that exports multiple recombinant proteins in membrane bound vesicles from E. coli, provides an ...

Cell Culture Techniques and Practices to Avoid Contamination by Fungi and Bacteria in the Research Cell Culture Laboratory

Cellekulturteknikker og praksis for at undgå forurening med svampe og bakterier i forskningscellekulturlaboratoriet

Cell culture is a delicate skill necessary for growing human, animal, and insect cells, or other tissues, in a controlled environment. The goal of the ...