Name: pulling membrane nanotubes from giant unilamellar vesicles
Uploaded: 2017-12-07T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles at JoVE.com

De auteurs bedanken Benoit Sorre, Damien Cuvelier, Pierre Nassoy, François Quemeneur en Gil Toombes voor hun essentiële bijdragen methode vast te stellen de nanobuis in de groep. De P.B. groep behoort aan het CNRS consortium CellTiss, de Labex CelTisPhyBio (ANR-11-LABX0038), en Parijs Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02). F.-C. Tsai werd gefinancierd door de EMBO op lange termijn fellowship (ALTF 1527-2014) en de Marie Curie-acties (H2020-MSCA-IF-2014, project membraan-ezrin-actine). M.S. is een Junior Fellow van de samenleving van Fellows van Simons.

1. bereiding van GUVs door Electroformation op Pt-draden
<ol><li>Schoonmaken van de kamer van electroformation (Zie Inleiding en figuur 1A) en de Pt-draden met een organische oplosmiddelen zoals ethanol of aceton om weg te wassen de lipiden en met water weg te wassen de zouten. Opmerking: We raden grondig veegde weg het residu met ethanol doordrenkte weefsel dan sonicating in aceton, ethanol, dan water, elk gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Bereiden een lipide mix van een ...

De methode van het trekken van buizen van GUVs geeft rijke informatie op het membraan-eiwit-systeem, maar het is niet alleen de middelen voor het meten van de fundamentele mechanische eigenschappen van het membraan, helpt het om licht werpen op de koppeling tussen eiwitten en membraan kromming. Zoals besproken in de inleiding, andere technieken bestaan voor het meten van de effecten van membraan-gebogen eiwitten, door de eiwitten aan het broeden met sub micron liposomen vastgebonden aan een speciaal oppervlak<sup class="...

Veel cellulaire processen, zoals endocytose, mensenhandel, de vorming van filopodia, infectie, enz., worden begeleid door een dramatische verandering in de vorm van celmembranen1,2. In de cel deelnemen een aantal eiwitten aan deze processen door te binden aan het membraan en veranderen hun vorm. De opmerkelijkste voorbeelden behoren tot de familie van de Bin/Amphiphysin/Rvs (BAR) eiwit, met een karakteristiek intrinsiek gebogen BAR domein3,4,5,6,7. Typisch, ze interageren met het membraan door het domein van de BAR aan de oppervlakte en, in veel gevallen ook ondiep invoegen amphipathic helices in de dubbelgelaagde vast te houden. De vorm, grootte en kosten van het domein van de BAR samen met het aantal amphipathic helices bepaalt: (1) de richting van membraan kromming (d.w.z., of zij zal induceren invaginations of uitsteeksels), en (2) de omvang van het membraan kromming5,8. Van de nota, is hier positieve kromming gedefinieerd als de convexe kant van het gebogen membraan, dat wil zeggen, de Ardennen richting de interagerende deeltjes, en negatieve anders. Bovendien, kwantitatieve studies van BAR eiwitten bleek dat hun effect op het membraan hangt af van een aantal fysieke parameters: dichtheid van eiwitten, membraan spanning en membraan vorm (platte versus buisvormige versus sferisch oppervlak vorm)7. Afhankelijk van deze parameters BAR eiwitten kan: (1) fungeren als sensoren van membraan kromming, (2) buigen membranen of (3) induceren membraan splitsing7.
Vanwege het enorme aantal onderdelen die betrokken zijn bij het membraan omvormen in de cel, het bestuderen van de kwantitatieve aspecten van de verschijnselen, zoals endocytose, is in vivo zeer uitdagend. In vitro reconstitutie van minimale onderdelen nabootsen van gebogen membranen in de cel de mogelijkheid biedt een mechanistische begrip van hoe membraan-gebogen eiwitten werken te krijgen. Dit artikel beschrijft een protocol om te reconstrueren een membraan nanobuis in vitro met micromanipulation, confocal microscopie en optisch pincet. De aanpak kan worden gebruikt om te studeren, op een kwantitatieve manier, eiwitten, lipiden, of kleine moleculen interactie met een gebogen membraan. Lipide-GUVs worden gebruikt als model van een celmembraan, waarvan de kromming te verwaarlozen in vergelijking met de grootte van interagerende membraan-gebogen moleculen is. Ze zijn bereid met behulp van de electroformation methode9 waarin de blaasjes worden gevormd door een lipide-film hydraterende en zwelling het in GUVs onder een wisselstroom (AC)10. Meest voorkomende ondergronden waarop GUVs worden geteeld zijn beide semi-geleidend platen bedekt met indium tin oxide (ITO) of platina draden (Pt-draden)11. In dit werk worden GUVs gekweekt op Pt-draden zoals deze methode gebleken te werken veel beter dan het alternatief bij het maken van GUVs in aanwezigheid van zouten in de buffer12. Hoewel het electroformation-protocol hier in voldoende detail beschreven wordt te reproduceren, verwijzen we de lezer naar eerdere artikelen waarin vergelijkbare en andere methoden van het maken van GUVs zijn beschreven in detail13,14. In onze handen, heeft electroformation op Pt-draden met succes opgeleverd GUVs uit een mix van synthetische lipiden of uit natuurlijke lipide extracten in een buffer met ~ 100 mM NaCl. Bovendien was het ook mogelijk om in te kapselen eiwitten binnen GUVs tijdens groei. Een kamer van de electroformation in het volgende voorbeeld wordt getoond in figuur 1A; het bestaat uit twee ~ 10-cm lange Pt-draden ingevoegd in een houder gemaakt van polytetrafluorethyleen (PTFE) dat kan worden verzegeld aan beide zijden met glas coverslips ~ 1-2 cm uit elkaar (figuur 1A).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56086/56086fig1.jpg"> Figuur 1: experimentele opzet. (A) de GUV-electroformation kamer met elektrische aansluitingen op Pt-draden aangesloten. (B)-links: de experimenteel systeem tonen de Microscoop, de experimentele kamer boven de doelstelling en twee micropipetten (links en rechts) aan de micromanipulators en ingevoegd in de experimentele zaal voor buis trekken en eiwit injectie. Rechts: een vergrote weergave van de experimentele kamer gemonteerd boven de doelstelling met de toppen van de ambitie en de injectie micropipetten ingevoegd. (C) A injectiespuit voorzien van een dunne dispenser ingevoegd in een micropipet op de back-end. De onderkant is een vergrote weergave van de dispenser binnen de micropipet met de blauwe stippellijn overzichten van de micropipet. Dit systeem wordt gebruikt voor het vullen van de micropipet met caseïne om te passivate het glasoppervlak en ook om opvulling met minerale olie wanneer nodig. (D) een systeem gebruikt om µL hoeveelheden van de eiwit-oplossing gecombineerd. De naald is verbonden aan een injectiespuit en slang die is aangesloten op de micropipet van de injectie. De micropipet tip is zorgvuldig ondergedompeld in de eiwit-oplossing en aanzuiging dus om te vullen de micropipet tip. De micropipet is vervolgens weer gevuld met minerale olie met behulp van het systeem dat is afgebeeld in deelvenster C. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56086/56086fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
Een membraan nanobuis, variërend in straal van 7 nm tot enkele honderden nm, bij een GUV kan worden opgevraagd door een externe kracht. Deze methode was in eerste instantie bedoeld voor het meten van de elastische eigenschappen van celmembranen en blaasjes, zoals de buigende stijfheid15,16. In de meest recente producties, werd de methode uitgebreid bestuderen de interactie van eiwitten met een gebogen membraan door de eiwitten in de buurt van de getrokken nanobuis7,17microinjecting. Andere methoden zijn ontwikkeld voor het bestuderen van de membraan-gebogen eiwitten. In één methode, worden eiwitten geïncubeerd met verschillend formaat liposomen vastgebonden aan een speciaal oppervlak. Confocale microscopie wordt gebruikt voor het meten van de binding aan eiwitten als een functie van liposoom diameter, die kromming-geïnduceerde sorteren18,19kunt aangeven. Een andere methode, worden eiwitten geïnjecteerd in de buurt van een micro-aanzuiging GUV voor het meten van hun vermogen om spontaan induceren tubuli20,21. De in dit protocol beschreven methode is uniek geschikt om te studeren membraan-gebogen eiwitten die betrokken zijn in endocytose, waar de meeste eiwitten meestal tegenkomen voorgevormde membraan nanotubes aansluiten van de lading-bevattende membraan-invagination met de onderliggende platte plasma membraan. Bovendien, in deze methode, in tegenstelling tot in de test met vastgebonden kleine liposomen, het membraan nanobuis is voortdurend in verbinding staan op het membraan; Daarom is het in mechanisch evenwicht met de GUV, een situatie verwacht in vivo. Vandaar, fundamentele membraan Natuurkunde geldt en we kunnen een overvloed aan mechanische eigenschappen afleiden uit onze metingen22,23,24.
Voor een volledige implementatie van deze methode omvat de benodigde apparatuur een confocal microscoop, optisch pincet en één of twee micropipetten, aangesloten op een waterreservoir (figuur 1B). Door de combinatie van alle drie, kan men meten membraan spanning, membraan kromming, oppervlakte dichtheid van eiwitten en tegelijkertijd tube kracht25. Micropipet aspiratie is essentieel en het gemakkelijk is gebouwd door het invoegen van een glazen micropipet in een houder die is aangesloten op een waterreservoir, dat via de hydrostatische druk, de aspiratie druk26 controleert. De micropipet en de houder worden gecontroleerd door een micromanipulator en, idealiter in één richting door een piezo-actuator voor precisie beweging. Te trekken een nanobuis, de GUV is kort vast aan een micron-en kleinbedrijf kraal vervolgens trok weg het creëren van een nanobuis microaspirated. In deze uitvoering, wordt de parel gehouden door optisch pincet, die kan worden geconstrueerd door het volgen van een gepubliceerde protocol27. Het is mogelijk af te zien van de optisch pincet en pull nanotubes op verschillende manieren, hoewel ten koste van nauwkeurige kracht metingen. Als het is ook uitdagend om te bouwen van een optische trap of als kracht metingen zijn niet onontbeerlijk, zoals men wil gewoon om te controleren de voorkeur van eiwitten voor gebogen membranen, een buis kan worden getrokken met behulp van een kraal aanzuiging op het puntje van een tweede micropipet28. Het is ook mogelijk voor het trekken van buizen met behulp van de zwaartekracht29 of30,31te stromen. Bovendien is confocale microscopie niet noodzakelijk echter bij voorkeur wordt dus voor het meten van de oppervlakte dichtheid van eiwitten. Het maakt het ook mogelijk de nanobuis straal van intensiteit van de fluorescentie van lipiden in de buis, dus onafhankelijk van de membraan kracht en spanning te meten. Afgeleid van buis straal van fluorescentie is vooral belangrijk als de relatie tussen deze hoeveelheden van de gevestigde vergelijkingen als gevolg van de aanwezigheid van eiwitten membraan-nageleefd25 afwijkt. Nog belangrijker is, kan niet een afzien van zowel de optische val en confocale microscopie, zoals het zal niet mogelijk zijn om te meten de kromming van de buis.
De methode zoals beschreven in dit protocol is gebruikt voor het bestuderen van de kromming-geïnduceerde sorteren van verschillende perifere membraaneiwitten op nanobuisjes, vooral degenen uit de BAR familie25,32,33,34 . Het was ook te zien dat het kanaal van de conically gevormde transmembraan kalium dat kvap wordt verrijkt op gebogen nanotubes op dezelfde manier als BAR eiwitten35. Door het optimaliseren van de methode voor het inkapselen van eiwitten binnen GUVs, is de interactie van eiwitten met negatieve kromming onlangs onderzocht als goed36. Bovendien, deze methode is gebruikt te verhelderen van de vorming van eiwitten steigers25,37 en te bestuderen van het mechanisme van membraan splitsing door ofwel lijn spanning38, eiwit dynamin39, of door BAR eiwitten40,41. Naast eiwitten, kunnen kleine moleculen of ionen ook veroorzaken kromming. Met deze methode werden calciumionen getoond voor het opwekken van positieve kromming onder voorwaarden zoutloos42. Interessant, is het ook aangetoond dat lipiden kromming sorteren, hoewel alleen voor composities die in de buurt van een demixing punt43,44 zijnkunnen ondergaan. Kortom, de methode kan worden gebruikt door onderzoekers kochten onderzoeken hoe beide integraal membraan componenten (bv, lipiden of transmembraan eiwitten) of ook bindende moleculen (hetzij binnen of buiten GUVs) ermee cilindrische gebogen membranen, uit oogpunt van mechanische en kwantitatieve. Het is ook bedoeld voor diegenen die geïnteresseerd zijn in het meten van de mechanische eigenschappen van het membraan zich22,23,45.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DOPC)</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850375</td>
			<td>Example lipid used in data for Figure 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000] [DSPE-PEG(2000)-biotin]</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>880129</td>
			<td>biotinylated lipid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BODIPY-TR-C5-ceramide</td>
			<td>Molecular Probes (ThermoFisher)</td>
			<td>D7540</td>
			<td>fluorescent lipid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BODIPY- FLC5-hexadecanoyl phosphatidylcholine (HPC*)</td>
			<td>Molecular Probes (ThermoFisher)</td>
			<td></td>
			<td>fluorescent lipid for protein density calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>egg L-&#945;-phosphatidylcholine (eggPC)</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>840051</td>
			<td>used for calibrating the tube radius constant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-casein from bovine milk (&#62;99%)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C6905</td>
			<td>used for passivating the micropipette and the experimental chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+) glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10708976001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>osmometer</td>
			<td>Loser</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pt-wires, 0.5 mm diameter, 99.99% pure</td>
			<td>Goodfellow USA</td>
			<td>PT005139</td>
			<td>used for GUV electroformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>function generator</td>
			<td></td>
			<td>n/a</td>
			<td>used to create current for GUV electroformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>putty sealant</td>
			<td>Vitrex (from CML France)</td>
			<td>CRIT 140013</td>
			<td>used to seal the electroformation chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bath sonicator</td>
			<td></td>
			<td>n/a</td>
			<td>useful to clean the electroformation chamber, but not crucial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon TE2000 inverted microscope, eC1 confocal system (Nikon), with two laser lines (&#955; = 488 nm and 543 nm); optical tweezers induced by a 5 W ytterbium fiber continuous wave laser (&#955; &#62; 1070 nm; IPG GmBH Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>an example of a confocal microscopy system equipped with optical tweezers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulators</td>
			<td></td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosilicate capillaries (with internal and external radii of 0.78 mm and 1 mm, respectively)</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>30-0036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microforge</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MF-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>piezoelectric actuator</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polystyrene streptavidin coated beads (diameter 3.2 &#181;m)</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>SVP-30-5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pulling membrane nanotubes from giant unilamellar vesicles

De hervorming van het celmembraan is een integraal onderdeel van vele cellulaire fenomenen, zoals endocytose, mensenhandel, de vorming van filopodia, enz. Veel verschillende eiwitten associëren met een gebogen membraan omwille van hun vermogen om zin of induceren membraan kromming. Deze processen zijn gewoonlijk een veelheid aan eiwitten waardoor ze te ingewikkeld om te studeren kwantitatief in de cel. We beschrijven een protocol om te reconstrueren een gebogen membraan in vitro, het nabootsen van een gebogen cellulaire structuur, zoals de endocytotische nek. Een gigantische unilamellar blaasje (GUV) wordt gebruikt als een model van een celmembraan, waarvan de interne druk en oppervlaktespanning worden geregeld met micropipet streven. Een punt trekken kracht toe te passen op de GUV met optisch pincet creëert een nanobuis hoge kromtestraal verbonden met een platte membraan. Deze methode heeft van oudsher gebruikt voor het meten van de fundamentele mechanische eigenschappen van lipide membranen, zoals het buigen van stijfheid. In de afgelopen jaren heeft het uitgebreid bestuderen hoe eiwitten interactie met membraan kromming en de manier waarop zij invloed op de vorm en de mechanica van membranen. Een combinatie van micromanipulation, microinjection, optisch pincet en confocale microscopie systeem maakt meting van membraan kromming, membraan spanning, en de oppervlakte dichtheid van eiwitten, gelijktijdig. Uit deze metingen, kunnen vele belangrijke mechanische en morfologische eigenschappen van de eiwit-membraan systeem worden afgeleid. Bovendien, lay we-out een protocol voor het maken van GUVs in aanwezigheid van fysiologische zoute concentratie en een methode voor de kwantificering van de oppervlakte dichtheid van eiwitten op het membraan van de intensiteit van de fluorescentie van gelabelde proteïnen en lipiden.

Het experiment van buis-pulling kan geven essentiële mechanische informatie over het membraan. Bij gebrek aan eiwitten of andere moleculen die paar met membraan kromming, het membraan dwingen en straal van de buis kan worden gerelateerd met membraan spanning door het toepassen van de Hamiltoniaan boekje-Helfrich vergelijking tot een koker getrokken uit een GUV50,51 
<im...

Watch this Scientific Journal Video about Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles at JoVE.com

Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles

Veel proteïnen in de cel zin en membraan kromming veroorzaken. Beschrijven we een methode om te halen membraan nanotubes van lipide blaasjes te bestuderen de interactie van proteïnen of elke kromming-actieve molecuul met gebogen membranen in vitro.

Membraan Nanotubes trekken van Giant Unilamellar blaasjes

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many ...

Research

JoVE Journal

Biology

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

Kristalliseren membraaneiwitten voor structuurbepaling met behulp van lipide mesofasen

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

Het meten van Peptide Translocatie in grote unilamellaire Blaasjes

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1.  Many of these are referred ...

Examining BCL-2 Family Function with Large Unilamellar Vesicles

Het onderzoeken van Bcl-2 familie functie met grote unilamellaire blaasjes

The BCL-2 (B cell CLL/Lymphoma) family is comprised of approximately twenty proteins that collaborate to either maintain cell survival or initiate ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Reconstructie van een transmembraaneiwit, de Voltage-gated ionkanalen, KvAP, in Giant Unilamellaire Blaasjes voor Microscopie en Patch Clamp Studies

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Microperfusion techniek te onderzoeken verordening van microvessel permeabiliteit in Rat Mesenterium

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Cytometrische analyse van extracellulaire blaasjes van cel-geconditioneerd Media stromen

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies

Isolatie van cardiale en vasculaire gladde spiercellen van volwassen, juveniele, larvale en embryonale zebravissen voor elektrofysiologische studies

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the ...

Detection and Quantification of Tunneling Nanotubes Using 3D Volume View Images

Detectie en kwantificering van tunnelende nanobuizen met behulp van 3D-volumeweergaveafbeeldingen

Recent discoveries have revealed that cells perform direct, long-range, intercellular transfer via nano-scale, actin-membrane conduits, namely ...

Production and Imaging of Recombinant Protein-Filled Vesicles from E. coli

Optimized Production and Analysis of Recombinant Protein-Filled Vesicles from E. coli

The Production of Recombinant Proteins (Video) | JoVE

Geoptimaliseerde productie en analyse van recombinante met eiwitten gevulde blaasjes van E. coli

This innovative system, using a short peptide tag, that exports multiple recombinant proteins in membrane bound vesicles from E. coli, provides an ...

Cell Culture Techniques and Practices to Avoid Contamination by Fungi and Bacteria in the Research Cell Culture Laboratory

Celkweektechnieken en -praktijken om besmetting door schimmels en bacteriën in het laboratorium voor onderzoekscelkweek te voorkomen

Cell culture is a delicate skill necessary for growing human, animal, and insect cells, or other tissues, in a controlled environment. The goal of the ...