Name: pulling membrane nanotubes from giant unilamellar vesicles
Uploaded: 2017-12-07T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles at JoVE.com

Авторы благодарят Benoit Sorre, Дамьен Кувелье, Пьер Nassoy, Франсуа Quemeneur и Gil Toombes за их важный вклад установить метод нанотрубок в группе. П.б. Группа принадлежит консорциуму CNRS CellTiss, Labex CelTisPhyBio (АНР-11-LABX0038) и Париж наук и литературы (АНР-10-IDEX-0001-02). F. C. Tsai финансировался EMBO долгосрочных стипендий (ALTF 1527-2014) и Мари Кюри действия (H2020-МСКА-если-2014, проект мембраны Эзрин миозина). М.с. – младший научный Симонс общества стипендиатов.

1. Подготовка GUVs, Electroformation на Pt провода
<ol><li>Electroformation отсек (см. Введение и рис. 1A) и Pt провода с органического растворителя, например этанол или ацетон, чтобы смыть липиды и с водой смыть соли. Примечание: Мы рекомендуем тщательно вытирая остатков с этанола, проп...

Метод потянув трубы с GUVs дает богатую информацию о системе мембрана белка, как это не только средство для измерения основных механических свойств мембраны, но он помогает пролить свет на связи между белками и мембраны кривизны. Как указывалось во введении, другие методы существуют для ?...

Многих клеточных процессах, таких как эндоцитоза, торговля, образование filopodia, инфекции, и т.п., сопровождаются драматические изменения в форме клеточной мембраны1,2. В ячейке количество белков, участвовать в этих процессах путем привязки к мембране и изменяя их форму. Наиболее яркими примерами являются членами семьи протеина Bin/Amphiphysin/Rvs (бар), содержащий характеристику неразрывно изогнутый бар домена3,4,5,6,7. Как правило они взаимодействуют с мембраной путем присоединения домена бар на поверхность и, во многих случаях, также неглубоко Вставка амфифильными спиралей в бислой. Форма, размер и заряд бар домена вместе с количество спиралей амфифильными определяет: (1) направление мембранных кривизны (т.е., ли они будут побуждать кариолеммы или выступы) и (2) масштаб мембраны кривизны5,8. Здесь следует отметить, положительной кривизны определяется как выпуклой стороне изогнутые мембраны, т.е., выпуклость к взаимодействующих частиц и отрицательные иначе. Кроме того, количественные исследования бар белки показали, что их влияние на мембране зависит от набора физических параметров: поверхностная плотность белков, напряжение мембраны и мембраны формы (плоский против трубчатых против сферических 7форма). В зависимости от этих параметров бар белков может: (1) выступать в качестве датчиков мембраны кривизны, (2) согните мембраны или (3) побуждать мембраны scission7.
Из-за огромного числа компонентов, вовлеченных в мембраны реорганизация в ячейке, изучая количественные аспекты явления, такие как эндоцитоза в естественных условиях является чрезвычайно сложной задачей. В vitro воссоздание минимальным компонентов, подражая изогнутые мембраны в ячейке предоставляет средства механистического понимания как мембрана изгибая белков работают. Эта статья описывает протокол для воссоздания мембраны нанотрубок в пробирке с помощью микроманипуляции, конфокальная микроскопия и Оптический пинцет. Этот подход может использоваться для изучения, количественным способом, как белки, липиды или малые молекулы взаимодействуют с изогнутой мембраны. Липидные GUVs используются в качестве модели клеточной мембраны, чьи кривизны является незначительным по сравнению с размером взаимодействующих молекул, изгибая мембраны. Они были подготовлены с помощью метода electroformation9 , в котором везикулы образуются увлажняющий липидной пленки и опухоль в GUVs под переменный ток (AC)10. Наиболее распространенными субстратов, на которых выращиваются GUVs являются либо полупроводящей плиты, покрытые Индий оксид олова (ITO) или провода платины (Pt провода)11. В этой работе GUVs выращивается на Pt провода, как было показано, что этот метод работать гораздо лучше, чем альтернатива в принятии GUVs в присутствии солей в буфер12. Хотя протокол electroformation здесь описан достаточно подробно, чтобы воспроизвести его, мы отсылаем читателя к предыдущей статьи, в которых подобные и другие методы изготовления GUVs были описаны в деталях13,14. В наших руках electroformation на Pt провода успешно принесло GUVs из смеси синтетических липидов или от природных липидов экстрактов в буфер, содержащий ~ 100 мм NaCl. Кроме того было также можно инкапсулировать белков внутри GUVs во время роста. Камеру electroformation пример показан на рисунке 1A; Она состоит из двух ~ 10-cm долго Pt проводов вставляются в держатель из политетрафторэтилена (ПТФЭ), которые могут быть закрыты с обеих сторон стекла coverslips ~ 1-2 см друг от друга (рис. 1A).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56086/56086fig1.jpg"> Рисунок 1: экспериментальная установка. (A) GUV electroformation камера с электрическими разъемами, придает Pt провода. (B) слева: экспериментальная система, показаны в Микроскоп, экспериментальной камеры выше цели и двух micropipettes (левый и правый) придает микроманипуляторов и вставляется в экспериментальной камеры для трубки потянув и белка инъекции. Справа: в увеличенном экспериментальной камеры смонтированы выше цели показаны советы стремление и инъекций micropipettes вставлены. (C) A шприц с тонкой распылитель, вставляется в микропипеткой на его задней части. В нижней является в увеличенном колонки внутри микропипеткой с изложением микропипеткой синей пунктирной линией. Эта система используется для заполнения микропипеткой с казеином пассивации поверхности стекла, а также обратно заливки с минеральным маслом при необходимости. (D) A система, используемая для аспирационная количествах мкл раствора белка. Игла подключен шприц и трубопровод, который подключен к микропипеткой инъекций. Кончик микропипеткой тщательно погружен в раствор белка и наддува так чтобы заполнить микропипеткой кончик. Микропипеткой затем обратно заполнены с минеральным маслом, с использованием системы, отображаемые в панели C. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56086/56086fig1large.jpg" target="_blank">пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
Нанотрубки мембраны, начиная в радиусе 7 Нм до нескольких сотен Нм, могут быть выведены из GUV внешней силой. Этот метод был первоначально предназначен для измерения упругих свойств клеточных мембран и везикулы, таких как изгиб жесткость15,16. В последних работах метод был продлен для изучения взаимодействия белков с изогнутой мембраны, microinjecting белки вблизи вытащил нанотрубок7,17. Другие методы были разработаны для изучения мембраны изгибая белков. В одном методе белки инкубируют с по-разному размера липосомы, привязанный к пассивированы поверхности. Конфокальная микроскопия используется для измерения связывания белков как функция липосом диаметра, который может указывать кривизны индуцированной сортировки19,18,. В другом методе белки вводят вблизи микро безнаддувных GUV измерить их способность спонтанно побудить трубочки20,21. Метод, описанный в настоящем Протоколе однозначно подходит для изучения мембраны изгибая белков, участвующих в эндоцитоза, где большинство белков, как правило, встречаются преформированных мембраны нанотрубок, соединяющий груза содержащих мембраны invagination с лежащие в основе плоской плазматической мембраны. Кроме того в этом методе, в отличие от в assay с привязи малых липосомы, мембраны нанотрубок постоянно подключен к мембраны; Таким образом это в Механическое равновесие с GUV, ситуация ожидается в естественных условиях. Следовательно физику фундаментальных мембраны относится и множество механических свойств можно заключить из нашего измерения по22,23,24.
Для полной реализации этого метода необходимое оборудование включает в себя Конфокальный микроскоп оптический пинцет и один или два micropipettes, подключенных к резервуар для воды (рис. 1B). Объединив все три, это позволяет одновременно измерять напряжение мембраны, мембраны кривизны, поверхностная плотность белков и трубки силу25. Микропипеткой стремление имеет важное значение, и он легко построен, вставив микропипеткой стекла в держатель, подключенных к резервуар с водой, которая, через гидростатическое давление, контролирует давление стремление26. Микропипеткой и держатель находятся под контролем микроманипулятор и, в идеале, в одном направлении пьезо привода для точности движения. Чтобы вытащить нанотрубки, microaspirated GUV кратко застрял микронных размеров бисера затем вытащил прочь создание нанотрубки. В этой реализации шарик проводится Оптический пинцет, которая может быть построена, следуя опубликованный протокол27. Это позволяет обойтись Оптический пинцет и тянуть нанотрубок различными способами, хотя за счет измерения точные силы. Если это слишком сложно построить оптические ловушки или измерения силы не существенно, такие как если один просто хочет проверить предпочтение белков изогнутые мембраны, трубка может быть вытащил с использованием бисера, наддува на кончике второй микропипеткой28. Это также можно тянуть труб с использованием гравитационных сил29 или потока30,31. Кроме того конфокальная микроскопия важно не либо; Однако желательно так чтобы измерить плотность поверхности белков. Она также позволяет, измерения нанотрубок радиуса от интенсивности флуоресценции липидов в трубки, таким образом независимо от силы мембраны и напряженности. Подразумеваемых радиус трубы от флуоресценции особенно важно, если отношения между этими количествами отклоняется от устоявшихся уравнений вследствие наличия придерживается мембранных белков25. Важно отметить, что нельзя обойтись оптические ловушки и confocal микроскопии, как это не будет возможно измерить кривизны трубы.
Метод, как описано в настоящем протоколе был использован для изучения кривизны индуцированной сортировки различных периферийных мембранных белков на нанотрубках, главным образом те из бар семьи25,,3233,34 . Было также показано, что конически форме калия трансмембранный канал, который KvAP обогащено на изогнутые нанотрубок таким же образом как бар белки35. Путем оптимизации метода инкапсуляции белков внутри GUVs, как хорошо36недавно исследовано взаимодействия белков с отрицательной кривизны. Кроме того этот метод был использован для выяснения формирования белков подмостей25,37 и изучить механизм мембраны scission либо линии напряженности38, белок Динамин39, или бар белки40,41. Помимо белков малых молекул или ионов может также вызвать кривизны. С помощью этого метода, ионов кальция показали побудить положительной кривизны под соль свободные условия42. Интересно, что также было показано, что липиды могут пройти кривизны сортировки, хотя только для композиций, которые вблизи demixing пункт43,44. В целом этот метод может использоваться исследователями заинтересованы в расследовании как либо интегральный мембранный компонентов (например, липидов или трансмембранные белки) или периферийно привязки молекул (либо внутри или вне GUVs) взаимодействуют с цилиндрически изогнутые мембраны, от механических и количественной точек зрения. Он также предназначен для тех, кто заинтересован в измерения механических свойств мембраны себя22,23,45.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DOPC)</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850375</td>
			<td>Example lipid used in data for Figure 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000] [DSPE-PEG(2000)-biotin]</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>880129</td>
			<td>biotinylated lipid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BODIPY-TR-C5-ceramide</td>
			<td>Molecular Probes (ThermoFisher)</td>
			<td>D7540</td>
			<td>fluorescent lipid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BODIPY- FLC5-hexadecanoyl phosphatidylcholine (HPC*)</td>
			<td>Molecular Probes (ThermoFisher)</td>
			<td></td>
			<td>fluorescent lipid for protein density calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>egg L-&#945;-phosphatidylcholine (eggPC)</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>840051</td>
			<td>used for calibrating the tube radius constant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-casein from bovine milk (&#62;99%)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C6905</td>
			<td>used for passivating the micropipette and the experimental chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+) glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10708976001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>osmometer</td>
			<td>Loser</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pt-wires, 0.5 mm diameter, 99.99% pure</td>
			<td>Goodfellow USA</td>
			<td>PT005139</td>
			<td>used for GUV electroformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>function generator</td>
			<td></td>
			<td>n/a</td>
			<td>used to create current for GUV electroformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>putty sealant</td>
			<td>Vitrex (from CML France)</td>
			<td>CRIT 140013</td>
			<td>used to seal the electroformation chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bath sonicator</td>
			<td></td>
			<td>n/a</td>
			<td>useful to clean the electroformation chamber, but not crucial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon TE2000 inverted microscope, eC1 confocal system (Nikon), with two laser lines (&#955; = 488 nm and 543 nm); optical tweezers induced by a 5 W ytterbium fiber continuous wave laser (&#955; &#62; 1070 nm; IPG GmBH Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>an example of a confocal microscopy system equipped with optical tweezers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulators</td>
			<td></td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosilicate capillaries (with internal and external radii of 0.78 mm and 1 mm, respectively)</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>30-0036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microforge</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MF-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>piezoelectric actuator</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polystyrene streptavidin coated beads (diameter 3.2 &#181;m)</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>SVP-30-5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pulling membrane nanotubes from giant unilamellar vesicles

Реорганизация клеточной мембраны является неотъемлемой частью многих клеточных явлений, таких как эндоцитоза, людьми, формирование filopodia, и т.д. Многие различные белки связывают с изогнутой мембраны из-за их способности смысл или побудить мембраны кривизны. Как правило эти процессы включают в себя множество белков, что делает их слишком сложными для изучения количественно в ячейке. Мы описываем протокол для воссоздания изогнутые мембраны в пробирке, подражая изогнутые сотовой структуры, например endocytic шею. Гигантский однослойных везикул (GUV) используется как модель клеточной мембраны, внутреннее давление и поверхностное натяжение которого контролируются с микропипеткой аспирации. Применение точки тяговое усилие на GUV, используя Оптический пинцет создает нанотрубки высокой кривизны, подключенных к плоской мембраны. Этот метод традиционно используется для измерения основных механических свойств липидов мембран, таких как жесткость на изгиб. В последние годы она была расширена для изучения взаимодействия белков с мембраны кривизны и то, как они влияют на форму и механики мембран. Система, сочетая микроманипуляции, микроинъекции, Оптический пинцет и confocal микроскопии позволяет измерение кривизны мембраны, мембраны напряженности и поверхностная плотность белков, одновременно. Из этих измерений может быть выведено много важных механические и Морфологические свойства белка мембранные системы. Кроме того мы выложить протокол о создании GUVs присутствии физиологические концентрации соли и метод количественного определения поверхностная плотность белка на мембране от интенсивности флуоресценции помечены белков и липидов.

Трубка потянув эксперимент могут дать жизненно механические информацию о мембраны. В отсутствие белков и других молекул, которые силы пара с мембраной кривизны, мембраны и радиус трубы могут быть связаны с мембраной напряженности путем применения Канхем-Хелфрих Гами...

Watch this Scientific Journal Video about Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles at JoVE.com

Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles

Многие белки в ячейке смысла и побудить мембраны кривизны. Мы описываем метод тянуть нанотрубок мембраны из липидов пузырьки для изучения взаимодействия белков или любой кривизны активные молекулы с изогнутой мембраны в пробирке.

Потянув нанотрубок мембраны из гигантских однослойных везикул

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many ...

Research

JoVE Journal

Biology

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

Кристаллизующихся мембранных белков для определения структуры использования липидный Мезофазы

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

Измерение пептида транслокации в Большой однослойные везикулы

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1.  Many of these are referred ...

Examining BCL-2 Family Function with Large Unilamellar Vesicles

Экспертиза BCL-2 Семья функции с большим однослойные везикулы

The BCL-2 (B cell CLL/Lymphoma) family is comprised of approximately twenty proteins that collaborate to either maintain cell survival or initiate ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Восстановление трансмембранный белок, напряжения закрытого ионного канала, KvAP, в гигантском однослойные везикулы для микроскопии и локальной фиксации исследований

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Microperfusion Техника по расследованию Правила микрососудов проницаемость у крыс брыжейки

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Гранулярных анализ внеклеточного Vesicles из клеток кондиционером СМИ потока

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies

Выделение сердечных и сосудистых гладкомышечных клеток из взрослых, ювенильных, личиночных и эмбриональных рыбок данио для электрофизиологических исследований

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the ...

Detection and Quantification of Tunneling Nanotubes Using 3D Volume View Images

Обнаружение и количественная оценка туннельных нанотрубок с использованием изображений 3D Volume View

Recent discoveries have revealed that cells perform direct, long-range, intercellular transfer via nano-scale, actin-membrane conduits, namely ...

Production and Imaging of Recombinant Protein-Filled Vesicles from E. coli

Optimized Production and Analysis of Recombinant Protein-Filled Vesicles from E. coli

The Production of Recombinant Proteins (Video) | JoVE

Оптимизированное производство и анализ рекомбинантных везикул, заполненных белком, из E. coli

This innovative system, using a short peptide tag, that exports multiple recombinant proteins in membrane bound vesicles from E. coli, provides an ...

Cell Culture Techniques and Practices to Avoid Contamination by Fungi and Bacteria in the Research Cell Culture Laboratory

Методы и методы культивирования клеток для предотвращения загрязнения грибами и бактериями в исследовательской лаборатории клеточных культур

Cell culture is a delicate skill necessary for growing human, animal, and insect cells, or other tissues, in a controlled environment. The goal of the ...