Name: pulling membrane nanotubes from giant unilamellar vesicles
Uploaded: 2017-12-07T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles at JoVE.com

Författarna vill tacka Benoit Sorre, Damien Cuvelier, Pierre Nassoy, François Quemeneur, och Gil Toombes för deras väsentliga bidrag för att etablera metoden nanotube i gruppen. P.B. gruppen tillhör CNRS konsortiet CellTiss, att den Labex CelTisPhyBio (ANR-11-LABX0038), och till Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02). F.-C. Tsai finansierades av EMBO långsiktiga fellowship (ALTF 1527-2014) och Marie Curie-åtgärderna (H2020-behöriga myndigheters-om-2014, projektet membran-ezrin-aktin). M.S. är Junior Fellow Simons samhället av stipendiaterna.

1. beredning av GUVs av Electroformation på Pt-trådar
<ol><li>Rengör electroformation kammaren (se Inledning och figur 1A) och Pt-kablarna med ett organiskt lösningsmedel som etanol eller aceton till att tvätta bort lipider och vatten att tvätta bort salter. Obs: Vi föreslår noggrant torka bort återstoden med etanol-indränkt vävnad och sonicating i aceton, etanol, vatten, var och en för 5 min sedan.</li>
	<li>Förbereda en lipid blandning av en önskad lipid...

Metoden för att dra rör från GUVs ger rik information om membranprotein systemet, det är inte bara medel för att mäta de grundläggande mekaniska egenskaperna av membranet, men den hjälper till att belysa kopplingen mellan proteiner och membran krökning. Som diskuterats i inledningen, finns andra tekniker för att mäta effekterna av membran-svängda proteiner, antingen genom ruvning proteinerna med sub micron liposomer bundna till en passiverad yta18,19 ...

Många cellulära processer, såsom endocytos, människohandel, bildandet av filopodia, infektion, etc., åtföljs av en dramatisk förändring i form av cellmembran1,2. I cellen delta ett antal proteiner i dessa processer genom att binda till membranet och att ändra sin form. De mest kända exemplen är medlemmar av proteinfamiljen Bin/Amphiphysin/Rvs (BAR), som innehåller en egenskap som egensäkra böjd BAR domän3,4,5,6,7. Vanligtvis interagerar de med membranet genom att följa BAR domänen till ytan och, i många fall också grunt infoga amfipatiska spiraler i lipidens. Form, storlek och kostnad av domänen BAR tillsammans med antalet amfipatiska spiraler avgör: (1) riktningen av membran krökning (dvs.om de kommer att framkalla invaginations eller utskjutande delar), och (2) omfattningen av membran krökning5,8. Notera definieras här positiva krökning som den konvexa sidan av böjda membranet, dvs, bucklan mot samverkande partikeln, och negativa annars. Kvantitativa studier av BAR proteiner visade dessutom att deras effekt på membranet är beroende av en uppsättning fysiska parametrar: surface täthet av proteiner, membran spänning och membran form (platta kontra tubulär kontra sfäriska form)7. Beroende på dessa parametrar BAR proteiner kan: (1) fungerar som sensorer av membran krökning, (2) böja membran eller (3) inducera membran scission7.
På grund av det stora antalet komponenter inblandade i membran omforma i cellen, studera de kvantitativa aspekterna av fenomen, såsom endocytos, är i vivo extremt utmanande. In vitro beredning av minimal komponenter härma böjda membran i cellen ger möjlighet att få en mekanistisk förståelse av hur membran-svängda proteiner fungerar. I artikeln beskrivs ett protokoll för att rekonstituera en membran nanotube i vitro med mikromanipulation, konfokalmikroskopi, och optisk pincett. Metoden kan användas för att studera, på ett kvantitativt sätt, hur proteiner, lipider eller små molekyler interagerar med böjda membran. Lipid GUVs används som modeller för ett cellmembran, vars krökning är försumbar jämfört med storleken på samverkande membran-svängda molekyler. De är beredda med electroformation metod9 där blåsor bildas av återfuktande en lipid film och svullnad det in GUVs under en växelström (AC)10. Vanligaste substrat som GUVs odlas är antingen halvledande plattor belagda med indium tinoxiden (ITO) eller platinum ledningar (Pt-trådarna)11. I detta arbete odlas GUVs på Pt-trådar som denna metod har visat sig fungera mycket bättre än alternativet att göra GUVs i närvaro av salter i buffert12. Även om protokollet electroformation beskrivs här utförligt återge det, hänvisar vi läsaren till tidigare artiklar där liknande och andra metoder för att göra GUVs har beskrivits i detalj13,14. I våra händer, har electroformation på Pt-trådar framgångsrikt gett GUVs från en blandning av syntetiska lipider eller naturliga lipid extrakt i en buffert som innehåller ~ 100 mM NaCl. Dessutom var det också möjligt att kapsla in proteiner inuti GUVs under tillväxt. En exempel electroformation kammare visas i figur 1A; Den består av två ~ 10-cm-lång Pt-trådarna infogats i en hållare tillverkad av polytetrafluoreten (PTFE) som kan förseglas på båda sidor med glas coverslips ~ 1-2 cm mellanrum (figur 1A).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56086/56086fig1.jpg"> Figur 1: Experimental setup. (A) den GUV electroformation kammare med elektriska kontakter knutna till Pt-trådar. (B) vänster: experimentell systemet visar mikroskopet, experimentell kammare ovanför målet och två Mikropipetter (vänster och höger) bifogas micromanipulators och infogas i den experimentella avdelningen för röret att dra och protein injektion. Höger: en närbild på experimentella avdelningen monterade ovanför målet visar tips av strävan och de injektion Mikropipetter införas. (C), en spruta försedd med en tunn dispenser som infogas i en mikropipett på dess bakre änden. Botten är en närbild av dispensern inuti mikropipett med den blå streckade linjen beskriver mikropipett. Detta system används för att fylla mikropipett med kasein passiverande glasytan och även tillbaka fyllning med mineralolja när det behövs. (D) ett system används för att aspirera µL mängder protein lösningen. Nålen är ansluten till en spruta och slang som är ansluten till den injektion mikropipett. Mikropipett spetsen är noggrant nedsänkt i protein lösningen och aspirerade så för att fylla mikropipett spetsen. Mikropipett fylls sedan tillbaka med mineralolja använder systemet visas i panelen C. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56086/56086fig1large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>
En membran nanotube, varierar i radie från 7 nm till flera hundra nm, kan dras från en chef av en extern kraft. Denna metod var ursprungligen avsedd att mäta de elastiska egenskaperna hos cellmembran och blåsor, såsom den böjande styvhet15,16. I den senaste verk förlängdes metoden för att studera samspelet mellan proteiner med böjda membran av microinjecting proteiner nära den drog nanotube7,17. Andra metoder har utvecklats för att studera membran-svängda proteiner. I en metod inkuberas proteiner med olika stora liposomer bundna till en passiverad yta. Konfokalmikroskopi används för att mäta bindningen som en funktion av Liposom diameter, vilket kan indikera krökning-inducerad sortering18,19. I en annan metod injiceras proteiner nära en mikro-aspirerade GUV att mäta sin förmåga att spontant framkalla tubuli20,21. Den metod som beskrivs i detta protokoll är unikt lämpade att studera membran-svängda proteinerna som är inblandade i endocytos, där de flesta proteiner normalt möter förformade membran nanorör ansluta den last-innehållande membran invagination med den underliggande platt plasma membran. Dessutom i denna metod ansluten till skillnad från i analysen med uppbundna små liposomer, den membran nanotube kontinuerligt till membranet; Därför är det i mekaniska jämvikt med GUV, en situation som förväntat i vivo. Därför grundläggande membran fysik gäller och vi kan härleda en uppsjö av mekaniska egenskaper från våra mätningar22,23,24.
För en fullständig implementering av denna metod inkluderar nödvändig utrustning confocal Mikroskop, optisk pincett och en eller två Mikropipetter ansluten till en vattentank (figur 1B). Genom att kombinera alla tre, är det möjligt att samtidigt mäta spänning membran, membran krökning, Ytors av proteiner och tube kraft25. Mikropipett aspiration är viktigt och den är enkelt uppbyggd genom att infoga en glas mikropipett i en hållare som är ansluten till en vattentank, som, via hydrostatiskt tryck, kontrollerar den aspiration tryck26. Mikropipett och innehavaren styrs av en micromanipulator och helst i en riktning av en piezo-ställdon för precision rörelse. Att dra en nanotube, den microaspirated GUV kort fastnar till en micron stora pärla sedan drog bort skapar en nanotube. I detta genomförande hålls kornet av optisk pincett, som kan konstrueras genom att följa en publicerade protokoll27. Det är möjligt att avstå från optisk pincett och pull nanorör på olika sätt, men på bekostnad av korrekt kraft mätningar. Om det är alltför utmanande att bygga en optisk fälla eller om kraft mätningar är inte nödvändiga, såsom om man bara vill kontrollera inställningen av proteiner för böjda membran, en tub kan dras med en pärla som aspirerade på spetsen av en andra mikropipett28. Det är också möjligt att dra rören med hjälp av gravitationskraften29 eller flöde30,31. Konfokalmikroskopi är dessutom inte nödvändigt heller; dock är det att föredra så att mäta Ytors av proteiner. Det gör också mäta nanotube radien från fluorescensintensiteten hos lipider i röret, således oberoende av membran kraft och spänning. Inferring tube radie från fluorescens är särskilt viktigt om förhållandet mellan dessa kvantiteter avviker från väletablerade ekvationer på grund av förekomsten av membran-följs proteiner25. Ännu viktigare, en kan inte avstå från både optisk fälla och konfokalmikroskopi, eftersom det inte är möjligt att mäta tube krökning.
Metoden som beskrivs i detta protokoll har använts för att studera krökning-inducerad sortering av olika perifera membranproteiner på nanorör, främst de från BAR familj25,32,33,34 . Det visade också att den koniskt formade transmembrana kaliumkanal som KvAP är berikad på böjda nanorör på samma sätt som BAR proteiner35. Genom att optimera metoden för att kapsla in proteiner inuti GUVs, har samspelet mellan proteiner med negativ krökning nyligen undersökts som väl36. Dessutom, denna metod har använts att belysa bildandet av protein ställningar25,37 och att studera mekanismen av membran scissionen av antingen linje spänning38, protein dynamin39, eller BAR proteiner40,41. Förutom proteiner, kan små molekyler eller joner också inducera krökning. Med den här metoden visades kalciumjoner att framkalla positiva krökning enligt saltfri villkor42. Intressant, har det också visat att lipider kan genomgå krökning sortering, men endast för kompositioner som är nära en demixing punkt43,44. Sammanfattningsvis metoden kan användas av forskare som är intresserade av att undersöka hur antingen integrerad membran komponenter (t.ex., lipider eller transmembrana proteiner) eller perifert bindande molekyler (antingen inuti eller utanför GUVs) samverkar med cylindriskt böjda membran, mekaniska och kvantitativ synvinkel. Det är också avsett för dem som är intresserade av att mäta de mekaniska egenskaperna av membranet sig22,23,45.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DOPC)</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850375</td>
			<td>Example lipid used in data for Figure 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000] [DSPE-PEG(2000)-biotin]</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>880129</td>
			<td>biotinylated lipid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BODIPY-TR-C5-ceramide</td>
			<td>Molecular Probes (ThermoFisher)</td>
			<td>D7540</td>
			<td>fluorescent lipid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BODIPY- FLC5-hexadecanoyl phosphatidylcholine (HPC*)</td>
			<td>Molecular Probes (ThermoFisher)</td>
			<td></td>
			<td>fluorescent lipid for protein density calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>egg L-&#945;-phosphatidylcholine (eggPC)</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>840051</td>
			<td>used for calibrating the tube radius constant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-casein from bovine milk (&#62;99%)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C6905</td>
			<td>used for passivating the micropipette and the experimental chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+) glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10708976001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>osmometer</td>
			<td>Loser</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pt-wires, 0.5 mm diameter, 99.99% pure</td>
			<td>Goodfellow USA</td>
			<td>PT005139</td>
			<td>used for GUV electroformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>function generator</td>
			<td></td>
			<td>n/a</td>
			<td>used to create current for GUV electroformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>putty sealant</td>
			<td>Vitrex (from CML France)</td>
			<td>CRIT 140013</td>
			<td>used to seal the electroformation chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bath sonicator</td>
			<td></td>
			<td>n/a</td>
			<td>useful to clean the electroformation chamber, but not crucial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon TE2000 inverted microscope, eC1 confocal system (Nikon), with two laser lines (&#955; = 488 nm and 543 nm); optical tweezers induced by a 5 W ytterbium fiber continuous wave laser (&#955; &#62; 1070 nm; IPG GmBH Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>an example of a confocal microscopy system equipped with optical tweezers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulators</td>
			<td></td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosilicate capillaries (with internal and external radii of 0.78 mm and 1 mm, respectively)</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>30-0036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microforge</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MF-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>piezoelectric actuator</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polystyrene streptavidin coated beads (diameter 3.2 &#181;m)</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>SVP-30-5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pulling membrane nanotubes from giant unilamellar vesicles

En ny utformning av cellmembranet är en integrerad del av många cellulära fenomen, såsom endocytos, människohandel, bildandet av filopodia, etc. Många olika proteiner associera med böjda membran på grund av deras förmåga att känna eller framkalla membran krökning. Vanligtvis, dessa processer omfattar en mängd proteiner att göra dem alltför komplex för att studera kvantitativt i cellen. Här beskriver vi ett protokoll för att rekonstituera en böjd membran i vitro, härma en böjd cellstruktur, såsom endocytic halsen. En jätte unilamellar vesikler (GUV) används som en modell av ett cellmembran, vars inre tryck och ytspänning kontrolleras med mikropipett aspiration. Tillämpa en punkt dragkraft på GUV använder optisk pincett skapar en nanotube av hög krökning ansluten till en platt membran. Denna metod har traditionellt använts för att mäta de grundläggande mekaniska egenskaperna av lipid membran, såsom bockning styvhet. Under de senaste åren har det utökats för att studera hur proteiner interagerar med membran krökning och hur de påverkar formen och mekanik av membran. Ett system som kombinerar mikromanipulation, Mikroskop, optisk pincett och konfokalmikroskopi tillåter mätning av membran krökning, membran spänning och Ytors av proteiner, samtidigt. Från dessa mätningar, kan många viktiga mekaniska och morfologiska egenskaper av protein-membran systemet utläsas. Dessutom lägger vi ut ett protokoll för att skapa GUVs i närvaro av fysiologiska salt koncentration, och en metod för att kvantifiera Ytors av proteiner på membranet från fluorescens stödnivåer märkta proteiner och lipider.

Tube-pulling experimentet kan ge viktig mekanisk information om membranet. I avsaknad av proteiner eller andra molekyler som par med membran krökning, membranet kraft och tube radie kan relateras med membran spänning genom att tillämpa den Canham-Helfrich Hamiltonsk drog ekvationen till ett rör från en GUV50,51 
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56086/560...

Watch this Scientific Journal Video about Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles at JoVE.com

Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles

Många proteiner i cellen känsla och inducera membran krökning. Vi beskriver en metod för att dra membranet nanorör från lipid blåsor att studera samspelet mellan proteiner eller någon krökning-aktiva molekylen med böjda membran in vitro.

Dra membranet nanorör från Giant Unilamellar blåsor

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many ...

Research

JoVE Journal

Biology

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

Kristalliserande Membrane proteiner för strukturbestämning med Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

Mätning Peptide Translokation i stora Unilamellar Blåsor

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1.  Many of these are referred ...

Examining BCL-2 Family Function with Large Unilamellar Vesicles

Undersöka BCL-2 Familj Funktion med stora unilamellära vesiklar

The BCL-2 (B cell CLL/Lymphoma) family is comprised of approximately twenty proteins that collaborate to either maintain cell survival or initiate ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Beredning av ett transmembranprotein, den spänningskänsliga jonkanaler, KvAP, in Giant enlamellvesiklar för mikroskopi och Patch Clamp Studies

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Mikroperfusionskammarens Teknik för att undersöka Reglering av mikrokärls permeabilitet i Rat krös

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Flow flödescytometrisk analys av extracellulära blåsor från Cell-villkorade Media

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies

Isolering av hjärt- och vaskulära glattmuskelceller från vuxna, juvenila, larviga och embryonala zebrafiskar för elektrofysiologiska studier

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the ...

Detection and Quantification of Tunneling Nanotubes Using 3D Volume View Images

Detektion och kvantifiering av tunnelnanorör med hjälp av 3D-volymvybilder

Recent discoveries have revealed that cells perform direct, long-range, intercellular transfer via nano-scale, actin-membrane conduits, namely ...

Production and Imaging of Recombinant Protein-Filled Vesicles from E. coli

Optimized Production and Analysis of Recombinant Protein-Filled Vesicles from E. coli

The Production of Recombinant Proteins (Video) | JoVE

Optimerad produktion och analys av rekombinanta proteinfyllda vesiklar från E. coli

This innovative system, using a short peptide tag, that exports multiple recombinant proteins in membrane bound vesicles from E. coli, provides an ...

Cell Culture Techniques and Practices to Avoid Contamination by Fungi and Bacteria in the Research Cell Culture Laboratory

Cellodlingstekniker och -metoder för att undvika kontaminering av svampar och bakterier i forskningscellodlingslaboratoriet

Cell culture is a delicate skill necessary for growing human, animal, and insect cells, or other tissues, in a controlled environment. The goal of the ...