Name: pulling membrane nanotubes from giant unilamellar vesicles
Uploaded: 2017-12-07T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles at JoVE.com

Yazarlar Benoit Sorre, Damien Cuvelier, Pierre Nassoy, François Quemeneur ve Gil Toombes önemli katkılarından dolayı nanotüp yöntemi grupta kurmak için teşekkür ederiz. P.B. grup CNRS Konsorsiyumu CellTiss, Labex CelTisPhyBio (ANR-11-LABX0038) ve Paris Bilimler ait et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02). F. C. Tsai EMBO uzun süreli arkadaş grubu (ALTF 1527-2014) ve Marie Curie eylemleri (H2020-MSCA-Eğer-2014, proje membran-ezrin-aktin) tarafından finanse edildi. M.S. Simons arkadaşlarının toplum Junior biri.

1. GUVs Electroformation Pt-telleri üzerinde tarafından hazırlanması
<ol><li>Electroformation odası temiz (bkz: giriş ve şekil 1A) ve Pt-tuz silsin için telleri ile etanol veya lipidler silsin için aseton gibi organik bir çözücü ve su ile. Not: Biz iyice uzağa kalıntı etanol bulanmış doku ile silinerek sonra aseton, etanol, o zaman su, her biri için 5 dk sonicating öneririz.</li>
	<li>1 mg/mL kloroform bir istenen lipid bileşimi lipid karışımı h...

Tüpler GUVs çekme yöntemi yalnızca membran temel mekanik özelliği ölçmenin anlamına gelir değil ama protein ve membran arasında bağlantı ışık tutacak yardımcı olur gibi membran protein sistemi hakkında zengin bilgi verir eğriliği. Giriş bölümünde açıklandığı gibi alt mikron lipozomlar yüzey düzgünleştirilecek18,19 ' a hayvan zinciri ile proteinler kuluçka veya gözlemleyerek proteinler membran eğme, etkilerini ölçmek için ba...

Kaçakçılığı, endositoz, filopodia, enfeksiyon, vb, oluşumu gibi birçok hücresel süreçler hücre zarları1,2şeklinde dramatik bir değişim eşlik eder. Hücre içinde bir dizi proteinler membran için bağlama ve onların şekil değiştirerek bu işlemlerde katılmak. Özünde etki alanı3,4,5,6,7BAR kavisli bir özellik içeren depo gözü/Amphiphysin/Rvs (BAR) protein ailesi üyeleri en önemli örneklerdir. Tipik olarak, onlar BAR etki alanı yüzeye ve birçok durumda, aynı zamanda derin bilayer amfipatik sarmal ekleme kalarak tarafından membran ile etkileşim. Şekli, boyutu ve şarj amfipatik sarmal sayısı ile birlikte BAR etki alanının belirler: (1) membran eğriliği yönünü (Yani, invaginations ya da çıkıntılar neden) ve (2) membran büyüklüğü eğrilik5,8. Belirtmek gerekirse burada dışbükey tarafı eğri membran, Yani, çıkıntı etkileşen parçacık doğru ve negatif olarak aksi takdirde olumlu eğriliği tanımlanır. Ayrıca, membran üzerindeki etkileri fiziksel parametreleri bir dizi bağlıdır protein BAR nicel çalışmalar ortaya: yüzey proteinleri, membran gerginlik ve membran şekli (düz karşı borulu karşı küresel yoğunluğu şekil)7. Bu parametreler protein BAR bağlı olabilir: (1) hareket sensörleri membran kavisi, (2) membranlar viraj veya (3) neden membran scission7.
Bileşenleri membran hücre, endositoz gibi olayları niceliksel yönlerini eğitim yeniden şekillendirilmesi olarak yer sayısının çokluğu nedeniyle vivo içinde son derece zordur. Vitro sulandırma eğri membranlar hücrenin taklit eden en az bileşenlerinin nasıl membran eğri proteinlerin faaliyet mekanik bir anlayış kazanmak için sağlar. Bu makalede membran nanotüp vitro Embriyolardan, confocal mikroskobu ve optik cımbız kullanarak yeniden oluşturmak için bir iletişim kuralı. Yaklaşım, proteinler, lipidler veya küçük moleküller eğri membranlar ile etkileşimini nicel bir şekilde çalışmak için kullanılabilir. Lipid GUVs olan eğrilik etkileşen moleküllerin membran eğri boyuta göre önemsiz bir hücre membran modelleri olarak kullanılır. Onlar hangi veziküller lipid film nemlendirici ve GUVs bir alternatif akım (AC)10altında şişlik tarafından kurulan electroformation yöntemi9 kullanılarak hazırlanır. En yaygın yüzeyler üzerinde GUVs yetiştirilen indiyum kalay oksit (ITO) ile kaplı ya da yarı iletken tabaklara veya Platin (Pt-telleri)11teller. Bu yöntem tuzları arabellek12huzurunda GUVs yapımında alternatif daha iyi çalışması için gösterildiği gibi Bu eser, GUVs Pt-telleri üzerinde yetiştirilmektedir. Electroformation Protokolü burada onu çoğaltmak yeterince ayrıntılı bir biçimde anlatılan rağmen biz okuyucu içinde ayrıntı13,14' GUVs yapma ve diğer benzer yöntemleri tarif edilmiştir önceki makalelerine bakın. Bizim ellerde electroformation Pt-telleri üzerinde başarıyla GUVs sentetik yağlar karışımı veya doğal lipid ~ 100 mM NaCl içeren bir arabellek özler vermiştir. Ayrıca, büyüme sırasında proteinler GUVs içinde kapsüllemek mümkündü. Bir örnek electroformation odası şekil 1A' gösterilir; iki ~ 10 cm uzunluğunda Pt-tel her iki cam coverslips ile mühürlenmiş politetrafloroetilin (PTFE) yapılmış bir tutucu eklenen oluşur ~ 1-2 cm arayla (şekil 1A).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56086/56086fig1.jpg"> Şekil 1: deneysel Kur. (A) Şef electroformation odası ile elektrik konektörleri Pt-telleri için bağlı. (B) sol: mikroskop gösterilen deneysel sistem objektif ve iki MİKROPİPETLER (sol ve sağ) yukarıda deneysel odası için micromanipulators bağlı ve tüp çekerek ve protein için deneysel odasına eklenmiş enjeksiyon. Sağ: deneysel odası yakından görmek aspirasyon ve eklenen enjeksiyon MİKROPİPETLER gösterilen amaç monte. (C) A tenkıye arka tarafında bir micropipette takılan ince bir dağıtıcı ile donatılmıştır. Alt micropipette özetleyen mavi noktalı çizgi ile micropipette içinde dağıtıcı yakın çekim görülmektedir. Bu sistem micropipette kazein cam yüzey passivate ve mineral gerektiğinde yağ ile doldurun yedeklenmeyeceğini doldurmak için kullanılır. (D) A sistem protein çözüm miktarlarda µL Aspire eskiden. İğne bir şırınga ve iğne micropipette bağlı boru bağlıdır. Micropipette ipucu dikkatle protein çözüm içine dalmış ve çok micropipette ipucu doldurmak için Aspire. Micropipette sonra geri mineral panel C. gösterilen sistem kullanarak yağ ile dolu <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56086/56086fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
RADIUS 7 arasında değişen membran Nanotüpün nm için birkaç yüz nm, bir şef bir dış kuvvet tarafından çıkardı. Bu yöntem ilk hücre zarlarında ve veziküller, bükme sertlik15,16gibi elastik özelliklerini ölçmek için tasarlanmıştır. En son eserlerinde yöntemi proteinler çekti nanotüp7,17yakınındaki microinjecting tarafından proteinler arasındaki etkileşimin eğri membranlar ile çalışmaya uzatıldı. Diğer yöntemlerle proteinler membran eğri eğitimi için geliştirilmiştir. Bir yöntem, proteinler farklı ölçekli lipozomlar passivated yüzeye hayvan zinciri ile inkübe. Confocal mikroskobu protein bağlayıcı eğriliği kaynaklı sıralama18,19belirtebilirsiniz lipozom çapı bir fonksiyonu olarak ölçmek için kullanılır. Başka bir yöntem, protein kendiliğinden tübüllerin20,21ikna etmek için yeteneklerini ölçmek için bir mikro-Aspire Şef enjekte edilir. Bu protokol için açıklanan yöntemi nerede çoğu proteinler genellikle ön şekillendirilmesi membran nanotüpler kargo içeren membran invagination ile bağlanma karşılaşma membran eğri proteinler endositoz içinde yer alan eğitim için benzersiz olarak uygundur temel düz plazma zarı. Ayrıca, Bu yöntemde farklı olarak tahlil ile gergin küçük lipozomlar, membran nanotüp sürekli membran için bağlı; Bu nedenle, Şef, beklenen durum içinde vivoile mekanik denge bulunmaktadır. Bu nedenle, temel membran fizik uygular ve mekanik özellikleri bir bolluk bizim ölçümleri22,23,24algılayın.
Bu yöntem tam uygulanması için gerekli ekipman confocal mikroskop, optik cımbız ve su deposu (şekil 1B) bağlı bir veya iki MİKROPİPETLER içerir. Üçü bir araya getirerek, aynı anda ölçmek membran gerginlik, membran eğriliği, proteinlerin yüzey yoğunluğu ve kuvvet25tüp mümkündür. Micropipette aspirasyon esastır ve kolayca içine aspirasyon basınç26hidrostatik basınç kontrol eden bir su deposu için bağlı bir tutucu bir cam micropipette ekleyerek oluşturulur. Micropipette ve tutucu bir micromanipulator tarafından ve ideal olarak, bir yönde bir piezo-aktüatör hassas hareket için tarafından kontrol edilir. Nanotüpün çekeceğim, Şef microaspirated kısa bir süre uzakta Nanotüpün oluşturma sonra çekti bir mikron büyüklüğünde boncuk için sıkıştı. Bu uygulama, boncuk bir yayımlanmış protokolü27takip ederek inşa optik cımbız tarafından düzenlenmektedir. Bu doğru kuvvet ölçümleri rağmen pahasına optik cımbız ve çekme nanotüpler farklı şekillerde dağıtmak mümkündür. Bir optik tuzak kurmak çok zor olması veya kuvvet ölçümleri bir sadece proteinler tercih için eğri membranlar, kontrol istiyorsa gerekli değil, gibi bir tüp ikinci bir micropipette28ucunda Aspire bir boncuk kullanarak çekilebilir. Yerçekimi kuvveti29 kullanarak tüpler çekme veya30,31akışı mümkündür. Ayrıca, confocal mikroskobu da önemli değil; Ancak, bu yüzden proteinler yüzey yoğunluğunu ölçmek için tercih edilir. Ayrıca nanotüp RADIUS floresan yoğunluğu lipidler tüp, böylece bağımsız olarak membran kuvvet ve gerginlik üzerinden ölçüm sağlar. Bu miktarları arasındaki ilişkiyi proteinler membran yapıştırılır25varlığı nedeniyle köklü denklemleri sapma üzerinden Floresan Tüp RADIUS çıkarım özellikle önemlidir. Tüp eğriliği ölçmek mümkün olmayacak gibi önemlisi, bir optik tuzak ve confocal mikroskobu dağıtmak değil.
Bu protokol için açıklanan yöntemi eğrilik kaynaklı çeşitli periferik membran proteinlerinin nanotüpler, çoğunlukla bu BAR aile25,32,33,34 üzerinde sıralanması eğitim için kullanılan . Bu aynı zamanda KvAP üzerinde zenginleştirilmiş conically şekilli transmembran potasyum kanal proteinler35gibi BAR aynı şekilde nanotüpler kavisli gösterilmiştir. Proteinler GUVs içinde kapsüllemek için yöntemini optimize ederek, proteinler arasındaki etkileşimin negatif eğriliği ile son zamanlarda iyi36araştırmış. Ayrıca, bu yöntem protein iskele25,37 oluşumu aydınlatmak için ve her iki satır gerginlik38, protein dynamin39, veya BAR membran scission mekanizması çalışmaya kullanılmıştır proteinler40,41. Ek olarak proteinler, küçük moleküllerin veya iyonların eğriliği de tetikleyebilir. Bu yöntemi kullanarak, kalsiyum iyonları pozitif eğriliği tuzsuz koşulları42altında ikna etmek için gösterilmiştir. İlginçtir, aynı zamanda lipidler bir demixing noktası43,44olan sadece besteleri rağmen için sıralama, eğrilik geçirmek için gösterilmiştir. Toplum olarak, yöntem araştırmacılar nasıl ya integral membran bileşenler (örneğin, lipitler veya transmembran proteinler) soruşturma baktılar tarafından kullanılabilir veya periferik molekülleri bağlama (ya içinde veya dışında GUVs) ile etkileşim cylindrically eğri membranlar, mekanik ve nicel Puan bakış. Ayrıca22,23,45membran kendisi mekanik özelliklerini ölçme ilgilenenler için amaçlanmıştır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DOPC)</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850375</td>
			<td>Example lipid used in data for Figure 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000] [DSPE-PEG(2000)-biotin]</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>880129</td>
			<td>biotinylated lipid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BODIPY-TR-C5-ceramide</td>
			<td>Molecular Probes (ThermoFisher)</td>
			<td>D7540</td>
			<td>fluorescent lipid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BODIPY- FLC5-hexadecanoyl phosphatidylcholine (HPC*)</td>
			<td>Molecular Probes (ThermoFisher)</td>
			<td></td>
			<td>fluorescent lipid for protein density calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>egg L-&#945;-phosphatidylcholine (eggPC)</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>840051</td>
			<td>used for calibrating the tube radius constant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-casein from bovine milk (&#62;99%)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C6905</td>
			<td>used for passivating the micropipette and the experimental chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+) glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10708976001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>osmometer</td>
			<td>Loser</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pt-wires, 0.5 mm diameter, 99.99% pure</td>
			<td>Goodfellow USA</td>
			<td>PT005139</td>
			<td>used for GUV electroformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>function generator</td>
			<td></td>
			<td>n/a</td>
			<td>used to create current for GUV electroformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>putty sealant</td>
			<td>Vitrex (from CML France)</td>
			<td>CRIT 140013</td>
			<td>used to seal the electroformation chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bath sonicator</td>
			<td></td>
			<td>n/a</td>
			<td>useful to clean the electroformation chamber, but not crucial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon TE2000 inverted microscope, eC1 confocal system (Nikon), with two laser lines (&#955; = 488 nm and 543 nm); optical tweezers induced by a 5 W ytterbium fiber continuous wave laser (&#955; &#62; 1070 nm; IPG GmBH Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>an example of a confocal microscopy system equipped with optical tweezers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulators</td>
			<td></td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosilicate capillaries (with internal and external radii of 0.78 mm and 1 mm, respectively)</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>30-0036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microforge</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MF-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>piezoelectric actuator</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polystyrene streptavidin coated beads (diameter 3.2 &#181;m)</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>SVP-30-5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pulling membrane nanotubes from giant unilamellar vesicles

Hücre membran yeniden şekillendirilmesi endositoz, kaçakçılık, filopodia, vboluşumu gibi birçok hücresel olayların ayrılmaz bir parçasıdır. Birçok farklı protein hissediyorum veya membran eğriliği ikna yeteneği nedeniyle eğri membranlar ile ilişkilendirin. Genellikle, bu onları hücreye kantitatif çalışmaya çok karmaşık hale proteinler çok sayıda ayrışmasını gerektirir. Biz bir eğri membran vitro, yeniden oluşturmak için bir protokol endositik boyun gibi kavisli bir hücresel yapısı taklit tanımlamak. Bir dev unilamellar vezikül (Şef) olan iç basınç ve yüzey gerilimi micropipette aspirasyon ile kontrol edilir bir hücre zarı modeli olarak kullanılır. Optik cımbız kullanarak Şef bir nokta çekerek güç uygulayarak Nanotüpün düz bir membran bağlı yüksek kavisi oluşturur. Bu yöntem, lipid membranlar, sertlik bükme gibi temel mekanik özelliği ölçmenin geleneksel olarak kullanılmıştır. Son yıllarda, proteinler membran eğriliği ve onlar şekli ve membranları mekanik etkiler yolu ile nasıl etkileşim kurduğu eğitim için genişletilmiştir. Embriyolardan, mikroenjeksiyon, optik cımbız ve confocal mikroskobu birleştiren bir sistem aynı anda ölçüm membran eğriliği, membran gerginlik ve proteinler, yüzey yoğunluğu sağlar. Bu ölçümler protein-membran sisteminin birçok önemli mekanik ve morfolojik özelliklerini anlaşılmaktadır olabilir. Buna ek olarak, biz fizyolojik tuz konsantrasyonu ve proteinler membran üzerinden Floresans yoğunluklarda etiketli proteinler ve yağlar üzerinde yüzey yoğunluğu miktarının bir yöntem GUVs oluşturma iletişim kuralı düzenleyin.

Tüp çekme deneyi membran hakkında hayati mekanik bilgi verebilir. Proteinler veya Çift zar eğriliği, membran ile kuvvet ve tüp RADIUS ile membran gerginlik Canham Helfrich Hamilton uygulayarak ilgili diğer moleküller yokluğunda bir şef50,51 bir tüp denkleme çekti 
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56086/56086eq3v6.jpg">(Denklem 1)...

Watch this Scientific Journal Video about Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles at JoVE.com

Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles

Çoğu protein hücredeki hissediyorum ve membran eğriliği neden. Membran nanotüpler lipid veziküller eğri membranlar içinde vitroetkileşim proteinler veya herhangi bir eğrilik aktif molekül çalışmaya üzerinden çekmek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Membran nanotüpler dev Unilamellar veziküller çekerek

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many ...

Research

JoVE Journal

Biology

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

Lipidik Mesophases kullanarak Yapı Tayini için Membran Proteinleri Kristalize

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

Büyük Unilamellar Veziküller Ölçme Peptid Translokasyon

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1.  Many of these are referred ...

Examining BCL-2 Family Function with Large Unilamellar Vesicles

Büyük ünilamellar Veziküller ile incelenmesi BCL-2 Aile Fonksiyonu

The BCL-2 (B cell CLL/Lymphoma) family is comprised of approximately twenty proteins that collaborate to either maintain cell survival or initiate ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Bir transmembran proteinin yeniden oluşturulması, Mikroskop ve yama kelepçe Çalışmaları Dev tek-katmanlı keseler içine Voltaj kapılı iyon kanalı, KvAP,

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Şekilde, mikro Tekniği Sıçan mezenter mikrodamar geçirgenliği Yönetmelik Araştırma

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Hücre şartına ortamdan hücre dışı veziküller sitometrik analizinde akışı

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies

Kardiyak ve Vasküler Düz Kas Hücrelerinin Elektrofizyolojik Çalışmalar İçin Yetişkin, Genç, Larva ve Embriyonik Zebra Balıklarından İzolasyonu

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the ...

Detection and Quantification of Tunneling Nanotubes Using 3D Volume View Images

3D Hacim Görünümü Görüntüleri Kullanarak Tünelleme Nanotüplerinin Tespiti ve Niceliği

Recent discoveries have revealed that cells perform direct, long-range, intercellular transfer via nano-scale, actin-membrane conduits, namely ...

Production and Imaging of Recombinant Protein-Filled Vesicles from E. coli

Optimized Production and Analysis of Recombinant Protein-Filled Vesicles from E. coli

The Production of Recombinant Proteins (Video) | JoVE

E. coli'den Rekombinant Protein Dolu Veziküllerin Optimize Edilmiş Üretimi ve Analizi

This innovative system, using a short peptide tag, that exports multiple recombinant proteins in membrane bound vesicles from E. coli, provides an ...

Cell Culture Techniques and Practices to Avoid Contamination by Fungi and Bacteria in the Research Cell Culture Laboratory

Araştırma Hücre Kültürü Laboratuvarında Mantar ve Bakterilerin Kontaminasyonunu Önlemek İçin Hücre Kültürü Teknikleri ve Uygulamaları

Cell culture is a delicate skill necessary for growing human, animal, and insect cells, or other tissues, in a controlled environment. The goal of the ...