Name: confocal imaging of neuropeptide y-phluorin: a technique to visualize insulin granule exocytosis in intact murine and human islets
Uploaded: 2017-09-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Confocal Imaging of Neuropeptide Y-pHluorin: A Technique to Visualize Insulin Granule Exocytosis in Intact Murine and Human Islets at JoVE.com

המחברים תודה מרשה Boulina מ- DRI הדמיה מתקן הליבה לעזרה עם המיקרוסקופים. עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענקים 1K01DK111757-01 (יא), F31668418 (מ מ), R01 DK111538, R33 ES025673, R56 DK084321 (AC).

ועדת האתיקה בעלי חיים של אוניברסיטת מיאמי אישר את כל הניסויים.
 1. נגיפי זיהום של שלם מבודד אנושית או העכבר לנגרהנס <ol><li>איון תרבות: להכין את המדיה תרבות איון: קונוט רפואי מחקר מעבדות (CMRL) 1066, 10% (v/v) FBS ו 2 מ מגלוטמין.
	<ol><li>האדם לנגרהנס מתקבלים מתוכנית משולב איון הפצה (NIDDK, NIH). עם ה?...

<ol>
	<li>Roder, P. V., Wong, X., Hong, W., Han, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulation+of+insulin+granule+biogenesis+and+exocytosis.">Molecular regulation of insulin granule biogenesis and exocytosis.</a> Biochem J. 473 (18), 2737-2756 (2016).</li><li>Rutter, G. A., Pullen, T. J., Hodson, D. J., Martinez-Sanchez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+beta-cell+identity,+glucose+sensing+and+the+control+of+insulin+secretion.">Pancreatic beta-cell identity, glucose sensing and the control of insulin secretion.</a> Biochem J. 466 (2), 203-218 (2015).</li><li>Rorsman, P., Renstrom, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+granule+dynamics+in+pancreatic+beta+cells.">Insulin granule dynamics in pancreatic beta cells.</a> Diabetologia. 46 (8), 1029-1045 (2003).</li><li>Takahashi, N., Kishimoto, T., Nemoto, T., Kadowaki, T., Kasai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+pore+dynamics+and+insulin+granule+exocytosis+in+the+pancreatic+islet.">Fusion pore dynamics and insulin granule exocytosis in the pancreatic islet.</a> Science. 297 (5585), 1349-1352 (2002).</li><li>Ramirez, D. M., Khvotchev, M., Trauterman, B., Kavalali, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vti1a+identifies+a+vesicle+pool+that+preferentially+recycles+at+rest+and+maintains+spontaneous+neurotransmission.">Vti1a identifies a vesicle pool that preferentially recycles at rest and maintains spontaneous neurotransmission.</a> Neuron. 73 (1), 121-134 (2012).</li><li>Michael, D. J., Xiong, W., Geng, X., Drain, P., Chow, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+insulin+vesicle+dynamics+during+pulsatile+secretion.">Human insulin vesicle dynamics during pulsatile secretion.</a> Diabetes. 56 (5), 1277-1288 (2007).</li><li>Ohara-Imaizumi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+exocytosis+and+endocytosis+of+insulin+secretory+granules+in+the+pancreatic+beta-cell+line+MIN6+using+pH-sensitive+green+fluorescent+protein+(pHluorin)+and+confocal+laser+microscopy.">Monitoring of exocytosis and endocytosis of insulin secretory granules in the pancreatic beta-cell line MIN6 using pH-sensitive green fluorescent protein (pHluorin) and confocal laser microscopy.</a> Biochem J. 363 (Pt 1), 73-80 (2002).</li><li>Whim, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+beta+cells+synthesize+neuropeptide+Y+and+can+rapidly+release+peptide+co-transmitters.">Pancreatic beta cells synthesize neuropeptide Y and can rapidly release peptide co-transmitters.</a> PLoS One. 6 (4), e19478 (2011).</li><li>Tsuboi, T., Rutter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+forms+of+&amp;#34;kiss-and-run&amp;#34;+exocytosis+revealed+by+evanescent+wave+microscopy.">Multiple forms of &amp;#34;kiss-and-run&amp;#34; exocytosis revealed by evanescent wave microscopy.</a> Curr Biol. 13 (7), 563-567 (2003).</li><li>Zhu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptotagmin+I+and+IX+function+redundantly+in+controlling+fusion+pore+of+large+dense+core+vesicles.">Synaptotagmin I and IX function redundantly in controlling fusion pore of large dense core vesicles.</a> Biochem Biophys Res Commun. 361 (4), 922-927 (2007).</li><li>Aoki, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duration+of+fusion+pore+opening+and+the+amount+of+hormone+released+are+regulated+by+myosin+II+during+kiss-and-run+exocytosis.">Duration of fusion pore opening and the amount of hormone released are regulated by myosin II during kiss-and-run exocytosis.</a> Biochem J. 429 (3), 497-504 (2010).</li><li>Felmy, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+cargo+release+from+dense+core+granules+by+size+and+actin+network.">Modulation of cargo release from dense core granules by size and actin network.</a> Traffic. 8 (8), 983-997 (2007).</li><li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li><li>Gandasi, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survey+of+Red+Fluorescence+Proteins+as+Markers+for+Secretory+Granule+Exocytosis.">Survey of Red Fluorescence Proteins as Markers for Secretory Granule Exocytosis.</a> PLoS One. 10 (6), e0127801 (2015).</li><li>Almaca, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+coordination+of+insulin+granule+exocytosis+in+intact+human+pancreatic+islets.">Spatial and temporal coordination of insulin granule exocytosis in intact human pancreatic islets.</a> Diabetologia. 58 (12), 2810-2818 (2015).</li><li>Do, O. H., Low, J. T., Thorn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lepr(db)+mouse+model+of+type+2+diabetes:+pancreatic+islet+isolation+and+live-cell+2-photon+imaging+of+intact+islets.">Lepr(db) mouse model of type 2 diabetes: pancreatic islet isolation and live-cell 2-photon imaging of intact islets.</a> J Vis Exp. (99), e52632 (2015).</li><li>Hanna, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kiss-and-run+exocytosis+and+fusion+pores+of+secretory+vesicles+in+human+beta-cells.">Kiss-and-run exocytosis and fusion pores of secretory vesicles in human beta-cells.</a> Pflugers Arch. 457 (6), 1343-1350 (2009).</li><li>Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+rodent+islet+isolation+and+assessment.">A practical guide to rodent islet isolation and assessment.</a> Biol Proced Online. 11, 3-31 (2009).</li><li>Weber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenoviral+transfection+of+isolated+pancreatic+islets:+a+study+of+programmed+cell+death+(apoptosis)+and+islet+function.">Adenoviral transfection of isolated pancreatic islets: a study of programmed cell death (apoptosis) and islet function.</a> J Surg Res. 69 (1), 23-32 (1997).</li><li>Michael, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+cargo+proteins+in+pancreatic+beta-cells:+design+determines+secretion+kinetics+at+exocytosis.">Fluorescent cargo proteins in pancreatic beta-cells: design determines secretion kinetics at exocytosis.</a> Biophys J. 87 (6), L03-L05 (2004).</li><li>Serre-Beinier, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cx36+makes+channels+coupling+human+pancreatic+beta-cells,+and+correlates+with+insulin+expression.">Cx36 makes channels coupling human pancreatic beta-cells, and correlates with insulin expression.</a> Hum Mol Genet. 18 (3), 428-439 (2009).</li><li>Rutter, G. A., Hodson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+cell+connectivity+in+pancreatic+islets:+a+type+2+diabetes+target?.">Beta cell connectivity in pancreatic islets: a type 2 diabetes target?.</a> Cell Mol Life Sci. 72 (3), 453-467 (2015).</li><li>Shen, Y., Rosendale, M., Campbell, R. E., Perrais, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pHuji,+a+pH-sensitive+red+fluorescent+protein+for+imaging+of+exo-+and+endocytosis.">pHuji, a pH-sensitive red fluorescent protein for imaging of exo- and endocytosis.</a> J Cell Biol. 207 (3), 419-432 (2014).</li><li>Speier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+in+vivo+imaging+of+pancreatic+islet+cell+biology.">Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology.</a> Nat Med. 14 (5), 574-578 (2008).</li><li>Low, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+secretion+from+beta+cells+in+intact+mouse+islets+is+targeted+towards+the+vasculature.">Insulin secretion from beta cells in intact mouse islets is targeted towards the vasculature.</a> Diabetologia. 57 (8), 1655-1663 (2014).</li></ol>

כתב יד זה מתאר טכניקה יכול לשמש כדי להמחיש אקסוציטוזה של גרגרי אינסולין בתאי בטא בתוך לנגרהנס ללא פגע על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. היא משתמשת NPY-pHluorin כמו הכתבת פלורסנט משובטים לתוך אדנו כדי להבטיח יעילות של תרביות תאים גבוהה.
למרות השיטה היה יעיל ביותר בידיים שלנו, זה עשוי ?...

האינסולין המיוצר על ידי תאי ביתא הלבלב איון, וזה המפתח מווסת של מטבוליזם של גלוקוז1. מוות או תפקוד לקוי של תאי הבטא מפריע גלוקוז הומאוסטזיס ומוביל סוכרת2. אינסולין ארוזה בגרגרים ליבה צפופה שפורסמו ב Ca2 +-אופן התלויים3. שחקרתי כמה אינסולין גרגר אקסוציטוזה מוסדר חיוני להבין באופן מלא את מה קובע את הפרשת האינסולין, פותח דרכים חדשות לזיהוי מטרות טיפולית חדשנית לטיפול בסוכרת.
אינסולין אקסוציטוזה נחקרה בהרחבה שימוש בגישות אלקטרופיזיולוגיות, כגון מידות קיבול הממברנה, וגישות מיקרוסקופיים בשילוב עם מולקולות פלורסנט. מידות קיבול הממברנה יש רזולוציה טמפורלית טובים ומאפשרים הקלטות תא בודד. עם זאת, שינויים קיבוליות שישקפו את השינוי השטח נטו של התא ולא ללכוד אירועים בודדים פיוז'ן או להבדיל אינסולין פיוז'ן גרגר אחרים שלפוחית הפרשה ללא אינסולין3. גישות מיקרוסקופיים, כגון השתקפות פנימית שני הפוטונים או סכום מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית (TIRF) בשילוב עם הגששים פלורסנט וחלבונים מטען שלפוחית, לספק פרטים נוספים. טכניקות אלה ללכוד אירועים exocytotic יחיד, גם בשלבים שלפני, פוסט-exocytotic והוא יכול לשמש ללימוד דפוסי exocytotic באוכלוסיות של תאים3.
כתבים פלורסנט יכולה להיות משלושה סוגים: 1) חוץ-תאית, cytoplasmic 2) או 3) vesicular. 1) הכתבים חוץ-תאית, המשדרים קוטבי (למשל, dextrans, sulforhodamine B (SRB), לוציפר צהוב, pyranine) זה יכול להיות מוצג דרך חצרו חוץ-תאית4. השימוש של המשדרים קוטבי מאפשר החקירה של הנקבובית פיוז'ן בקרב אוכלוסיה של תאים ו לוכדת מבנים המערכת שונים כגון כלי דם. עם זאת, הם אינם מדווחים על התנהגות מטען שלפוחית. 2) הכתבים cytoplasmic, פלורסנט הגששים מצמידים חלבוני ממברנה-הקשורים פנים הציטופלסמה, מעורבים עגינה והוצאה אקסוציטוזה. דוגמאות כוללות את בני מסיסים N- ethylmaleimide רגיש גורם מצורף חלבון קולטן (מוקש) משפחת בהן השתמשו בהצלחה במדעי המוח ללמוד שחרור נוירוטרנסמיטר5. חלבונים כאלה יש שותפים איגוד מרובים ואינם אינסולין-גרגר ספציפיים. 3) הכתבים vesicular, פלורסנט הגששים התמזגו חלבונים מטען vesicular לאפשר חקירת התנהגות ספציפית מטען שלפוחית. אינסולין-גרגר מטען מסוים חלבונים כוללים אינסולין, c-פפטיד, איון מפוליפפטיד עמילואיד NPY בין היתר6,7. NPY רק נוכח אינסולין המכיל גרגירים, שיתוף שוחרר עם אינסולין, שהופך אותו שותף מצוין כתב פלורסנט8.
היתוך גרעיני של שונה פלורסנט חלבונים כדי NPY כבר מועסקים בעבר לחקור היבטים שונים של אקסוציטוזה תאים נוירואנדוקריניים, כגון הדרישה של synaptotagmin ספציפיים איזופורמים9,10 וכיצד זמן-קורס של שחרור תלוי על שלד התא של אקטין צולבות הקישור חוטים שרירן II11,12. במחקר זה, בחרנו pHluorin כמו הכתבת פלורסנט, אשר GFP ששונה זה הלא-פלורסנט-רמת ה-pH חומצי בתוך ליבה צפופה בגרגרים אך הופך פלורסנט במאור פנים עם חשיפה ה-pH נייטרלי חוץ-תאית13. אינסולין בוגרת בגרגרים יש pH חומצי של מתחת 5.5. ברגע גרגר ולספות עם קרום פלזמה, פותח, את מטענה חשופים חוץ-תאי ה-pH נייטרלי של 7.4, המאפשר השימוש pHluorin ה-pH רגיש חלבונים בתור כתבת7,14.
לאור האופי הרגיש pH של pHluorin ואת הביטוי סלקטיבי של NPY ב אינסולין בגרגרים, הבונה פיוז'ן NPY-pHluorin ניתן ללמוד מאפיינים שונים של אינסולין גרגר אקסוציטוזה. מסירה ויראלי של הבונה פיוז'ן מבטיחה יעילות גבוהה תרביות תאים ועובד על ראשי תאי הבטא או שורות תאים, כמו גם על איים מבודדים. שיטה זו יכולה לשמש גם כקו מנחה ללמוד אקסוציטוזה בכל סוג תא אחר עם שלפוחית המכילה NPY. זה יכול גם להיות משולב עם כל דגם העכבר מהונדס ללמוד על ההשפעות של תנאים מסוימים (נפילות, ביטוי, וכו ') על אקסוציטוזה. טכניקה זו שימש בעבר כדי לאפיין יכולות דפוסי הפרשת האינסולין גרגר באוכלוסיות תאי בטא אנושיים איונים15.

<table width="845">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="width:280px;height:63px;">Upright laser-scanning confocal microscope</td>
			<td style="width:232px;">Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td style="width:167px;">TCS-SP5</td>
			<td style="width:167px;">includes LAS AF, the image acquisition software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:280px;height:21px;">Imaging chamber</td>
			<td style="width:232px;">Warner instruments</td>
			<td style="width:167px;">RC-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:280px;height:21px;">Imaging chamber platform</td>
			<td style="width:232px;">Warner instruments</td>
			<td style="width:167px;">PH-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:280px;height:21px;">22x40 glass coverslips</td>
			<td style="width:232px;">Daiggerbrand</td>
			<td style="width:167px;">G15972H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:280px;height:21px;">Vacuum silicone grease</td>
			<td style="width:232px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">Z273554-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:280px;height:21px;">Multichannel perfusion system</td>
			<td style="width:232px;">Warner instruments</td>
			<td style="width:167px;">VC-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:280px;height:21px;">Single inline solution heater</td>
			<td style="width:232px;">Warner instruments</td>
			<td style="width:167px;">SH-27B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:280px;height:21px;">Temperature controller</td>
			<td style="width:232px;">Warner instruments</td>
			<td style="width:167px;">TC-324C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:280px;height:21px;">Peristaltic Suction pump</td>
			<td style="width:232px;">Pharmacia</td>
			<td style="width:167px;">P-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:280px;height:42px;">35 mm Petri dish, non-tissue culture treated</td>
			<td style="width:232px;">VWR</td>
			<td style="width:167px;">10861-586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:280px;height:21px;">CMRL Medium, no glutamine</td>
			<td style="width:232px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">11530037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:280px;height:21px;">FBS, heat inactivated</td>
			<td style="width:232px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">16140071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:280px;height:21px;">L-Glutamine 200mM</td>
			<td style="width:232px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:280px;height:21px;">5M NaCl solution</td>
			<td style="width:232px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">S5150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:280px;height:21px;">3M KCl solution</td>
			<td style="width:232px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">60135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="width:280px;height:25px;">1M CaCl2 solution</td>
			<td style="width:232px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">21115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="width:280px;height:25px;">1M MgCl2 solution</td>
			<td style="width:232px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:280px;height:21px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:232px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:280px;height:21px;">1M HEPES solution</td>
			<td style="width:232px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">H0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:280px;height:21px;">Vacuum filter</td>
			<td style="width:232px;">VWR</td>
			<td style="width:167px;">431098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:280px;height:21px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:232px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:280px;height:21px;">Poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td style="width:232px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:167px;">P6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:280px;height:21px;">Di-8-ANNEP</td>
			<td style="width:232px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">D3167</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:280px;height:21px;">3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)</td>
			<td style="width:232px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">I5879</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:280px;height:21px;">Forskolin</td>
			<td style="width:232px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">F3917</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

confocal imaging of neuropeptide y-phluorin: a technique to visualize insulin granule exocytosis in intact murine and human islets

הפרשת אינסולין ממלא תפקיד מרכזי הומאוסטזיס גלוקוז בתנאים רגילים פיזיולוגיים כמו גם כמו מחלה. לגישות ללמוד אקסוציטוזה גרגר אינסולין שאו להשתמש אלקטרופיזיולוגיה או מיקרוסקופ מצמידים את הביטוי של עיתונאים פלורסנט. עם זאת רוב שיטות אלה מוטבו עבור שורות תאים המשובטים או לדרוש בריא לנגרהנס. לעומת זאת, השיטה המובאת כאן מאפשר הדמיה בזמן אמת של אינסולין אקסוציטוזה גרגר ב לנגרהנס ללא פגע. ב פרוטוקול זה, נתאר תחילה זיהום נגיפי של איים מבודדים הלבלב עם אדנו מקודד רגיש pH חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), pHluorin, מצמידים neuropeptide Y (NPY). שנית, אנו מתארים את קונאפוקלית הדמיה של איים קטנים חמישה ימים לאחר זיהום נגיפי, וכיצד לעקוב גרגר הפרשת אינסולין. בקצרה, איים נגועים מונחת על coverslip על חדר הדמיה, עם תמונה תחת זקוף לסריקת לייזר קונפוקלי במיקרוסקופ תוך כדי להיות perfused ללא הרף עם פתרון חוץ-תאית שמכילה גירויים שונים. תמונות קונאפוקלית פורש 50 מיקרומטר של איון נרכשים כמו בצילום מואץ הקלטות באמצעות סורק מהיר-תהודה. היתוך גרעיני של אינסולין בגרגרים עם קרום פלזמה ניתן בעקבות לאורך זמן. הליך זה גם מאפשר בדיקה סוללה של גירויים בניסוי יחיד תואם גם העכבר וגם איונים האנושית, יכול להיות משולב עם צבעים שונים עבור הדמיה תפקודית (למשל, ממברנה סידן פוטנציאליים או cytosolic צבע).

זרימת העבודה כולו של הטכניקה מוצג באיור1. בקצרה, עכבר או איונים האנושי להיות נגוע אדנו קידוד NPY-pHluorin, עם תמונה, לאחר כמה ימים בתרבות, תחת מיקרוסקופ קונפוקלי. כמו גרגרי נתיך עם קרום פלזמה, פתוח, עלייה פלורסצנטיות נצפית, ניתן לכמת (איור 1). כדי לק...

Watch this Scientific Journal Video about Confocal Imaging of Neuropeptide Y-pHluorin: A Technique to Visualize Insulin Granule Exocytosis in Intact Murine and Human Islets at JoVE.com

Confocal Imaging of Neuropeptide Y-pHluorin: A Technique to Visualize Insulin Granule Exocytosis in Intact Murine and Human Islets

אנו מתארים פרוטוקול עבור ויזואליזציה של אינסולין אקסוציטוזה ב איים שלמים באמצעות pHluorin, חלבון פלואורסצנטי ירוק pH-רגיש. איים מבודדים נגועים עם אדנו קידוד pHluorin מצמידים את שלפוחית מטען neuropeptide Y. דבר זה מאפשר הזיהוי של אינסולין גרגר פיוז'ן אירועים על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית.

קונאפוקלית הדמיה של Neuropeptide Y-pHluorin: טכניקה להמחיש אינסולין אקסוציטוזה גרגר ב איונים מאתר ואנושי ללא פגע

Insulin secretion plays a central role in glucose homeostasis under normal physiological conditions as well as in disease. Current approaches to study ...

Research

JoVE Journal

Biology

Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

הדמיה Exocytosis בתאים עם הפרעה דו רשתית מיקרוסקופית TIRF

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective ...

Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets

הלבלב האנושי בידוד איילט: חלק ב: טיהור והתרבות של איי האדם

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

טכניקה במקביל דמיינו ספציפיות וירוס CD8 + T ו-תאים הנגועים בווירוס תאים באתרו</em

The numbers and locations of virus-specific CD8+ T cells relative to the numbers and locations of their infected cell targets is thought to be critical in ...

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

הזרקת אינסולין ו Extraction Hemolymph כדי למדוד את הרגישות לאינסולין אצל מבוגרים תסיסנית melanogaster</em

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

הקרינה מבוסס מדידה הכניסה חנות המופעל הסידן בתאים חיים: מתא הסרטן תרבותי כדי סיב שריר שלד

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

ההדמיה confocal של הבזקים בודדים מיטוכונדריאלי Superoxide בלב שלם או<em&gt; בVivo</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

הפקה וטיהור יעילה של רקומביננטי Murine Kindlin-3 מתאי חרקים לBiophysical לימודים

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

זמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח אוטומטי של Dynamics microtubule In Living האדם טבורי וריד לתאי אנדותל

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

גלוקוז ספיגה מדידה ותגובה גירוי אינסולין ב<em&gt; במבחנה</em&gt; מיוטובים ראשוניים אדם מתורבת

Skeletal muscle is the largest glucose deposit in mammals and largely contributes to glucose homeostasis. Assessment of insulin sensitivity of muscle ...