Name: in vitro characterization of the electrophysiological properties of colonic afferent fibers in rats
Uploaded: 2017-09-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats at JoVE.com

Este protocolo fue apoyado por becas de investigación de la Ciencia Natural la Fundación de China nacional (#31171066, #81270464) y el centro de Ciencias de China-alemán (GZ919).

el protocolo experimental divulgado aquí ha sido aprobado por el Animal ético Comité de Shangai Jiaotong University School of Medicine (# SYXK2013-0050). la disección del colon con intacto ganglio y el nervio tronco tiene un mínimo de 15 minutos para una persona de bastante experiencia en esta técnica. Por lo tanto es necesario mantener el animal vivo pero bajo anestesia profunda y realizar disecciones, para asegurar la viabilidad del tejido para posterior grabación electrofisiológica.
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	<li>Al-Chaer, E. D., Traub, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+basis+of+visceral+pain:+recent+developments.">Biological basis of visceral pain: recent developments.</a> Pain. 96 (3), 221-225 (2002).</li><li>Christianson, J. A., Traub, R. J., Davis, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+spinal+distribution+and+neurochemical+phenotype+of+colonic+afferents+in+mouse+and+rat.">Differences in spinal distribution and neurochemical phenotype of colonic afferents in mouse and rat.</a> J Comp Neurol. 494 (2), 246-259 (2006).</li><li>Wynn, G., Rong, W., Xiang, Z., Burnstock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+mechanisms+contribute+to+mechanosensory+transduction+in+the+rat+colorectum.">Purinergic mechanisms contribute to mechanosensory transduction in the rat colorectum.</a> Gastroenterology. 125 (5), 1398-1409 (2003).</li><li>Dong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairments+of+the+Primary+Afferent+Nerves+in+a+Rat+Model+of+Diabetic+Visceral+Hyposensitivity.">Impairments of the Primary Afferent Nerves in a Rat Model of Diabetic Visceral Hyposensitivity.</a> Mol Pain. 11, (2016).</li><li>Lynn, P. A., Blackshaw, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+recordings+of+afferent+fibres+with+receptive+fields+in+the+serosa,+muscle+and+mucosa+of+rat+colon.">In vitro recordings of afferent fibres with receptive fields in the serosa, muscle and mucosa of rat colon.</a> J Physiol. 518 (Pt 1), 271-282 (1999).</li><li>Page, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+contributions+of+ASIC+channels+1a,+2,+and+3+in+gastrointestinal+mechanosensory+function.">Different contributions of ASIC channels 1a, 2, and 3 in gastrointestinal mechanosensory function.</a> Gut. 54 (10), 1408-1415 (2005).</li><li>Hockley, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2Y+Receptors+Sensitize+Mouse+and+Human+Colonic+Nociceptors.">P2Y Receptors Sensitize Mouse and Human Colonic Nociceptors.</a> J Neurosci. 36 (8), 2364-2376 (2016).</li><li>Peiris, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+visceral+afferent+recordings:+preliminary+report.">Human visceral afferent recordings: preliminary report.</a> Gut. 60 (2), 204-208 (2011).</li><li>Feng, B., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+silent+afferents+in+the+pelvic+and+splanchnic+innervations+of+the+mouse+colorectum.">Characterization of silent afferents in the pelvic and splanchnic innervations of the mouse colorectum.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300 (1), G170-G180 (2011).</li><li>Feng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+guanylate+cyclase-C+attenuates+stretch+responses+and+sensitization+of+mouse+colorectal+afferents.">Activation of guanylate cyclase-C attenuates stretch responses and sensitization of mouse colorectal afferents.</a> J Neurosci. 33 (23), 9831-9839 (2013).</li><li>Feng, B., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Functional+Characterization+of+Mouse+Colorectal+Afferent+Endings.">In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings.</a> J Vis Exp. (95), e52310 (2015).</li><li>Nullens, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Recording+of+Mesenteric+Afferent+Nerve+Activity+in+Mouse+Jejunal+and+Colonic+Segments.">In Vitro Recording of Mesenteric Afferent Nerve Activity in Mouse Jejunal and Colonic Segments.</a> J Vis Exp. (116), (2016).</li><li>Rong, W., Hillsley, K., Davis, J. B., Hicks, G., Winchester, W. J., Grundy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jejunalafferent+nerve+sensitivity+in+wild-type+and+TRPV1+knockout+mice.">Jejunalafferent nerve sensitivity in wild-type and TRPV1 knockout mice.</a> J Physiol. 560 (Pt 3), 867-881 (2004).</li><li>Brierley, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+chemosensory+function+and+receptor+expression+of+splanchnic+and+pelvic+colonic+afferents+in+mice).">Differential chemosensory function and receptor expression of splanchnic and pelvic colonic afferents in mice).</a> J Physiol. 567 (Pt 1), 267-281 (2005).</li><li>Brierley, S. M., Jones, R. C. 3. r. d., Gebhart, G. F., Blackshaw, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splanchnic+and+pelvic+mechanosensory+afferents+signal+different+qualities+of+colonic+stimuli+in+mice.">Splanchnic and pelvic mechanosensory afferents signal different qualities of colonic stimuli in mice.</a> Gastroenterology. 127 (1), 166-178 (2004).</li><li>La, J. H., Schwartz, E. S., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+the+expression+of+transient+receptor+potential+channel+V1,+transient+receptor+potential+channel+A1+and+mechanosensitive+two+pore-domain+K++channels+between+the+lumbar+splanchnic+and+pelvic+nerve+innervations+of+mouse+urinary+bladder+and+colon.">Differences in the expression of transient receptor potential channel V1, transient receptor potential channel A1 and mechanosensitive two pore-domain K+ channels between the lumbar splanchnic and pelvic nerve innervations of mouse urinary bladder and colon.</a> Neuroscience. 186, 179-187 (2001).</li><li>Wang, G., Tang, B., Traub, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+processing+of+noxious+colonic+input+by+thoracolumbar+and+lumbosacral+dorsal+horn+neurons+in+the+rat.">Differential processing of noxious colonic input by thoracolumbar and lumbosacral dorsal horn neurons in the rat.</a> J Neurophysiol. 94 (6), 3788-3794 (2005).</li></ol>

El protocolo presentado aquí es un método experimental relativamente sencillo para determinar las propiedades electrofisiológicas de las aferentes colon de ratas. El protocolo (de disección del tejido para configurar la grabación de nervio) generalmente toma aproximadamente 2 horas para completar. Tejido (paso 3) y preparación de la toma de aspiración (paso 5) son los pasos críticos. Es crucial para poder localizar el PG, el LSN y el PN y tenga cuidado de no para dañar el ganglio y nervios durante la disección ...

El tracto gastrointestinal (TGI) es ricamente inervado con nervios aferentes extrínsecos que trasmiten las señales sensoriales del intestino al sistema nervioso central y que contribuyen a la interacción del intestino-cerebro. Excitabilidad alterada de estos aferentes extrínsecas, así como procesamiento central alterada de las entradas aferentes, es la base visceral del dolor y otros síntomas de afecciones GI, incluyendo enfermedades de intestinos inflamatoria y funcional1. Información sensorial desde el colon se transmite principalmente a través de toracolumbar/hipogástrico y los nervios sacrolumbares pélvica (PN)2. Ha habido un creciente interés en el estudio de las propiedades electrofisiológicas de estas fibras aferentes primarias en modelos de roedores de la enfermedad. Sin embargo, en vivo grabaciones electrofisiológicas de los aferentes colon en los roedores es un desafío técnico y requiere considerables habilidades quirúrgicas. Además, cambios hemodinámicos, el movimiento de tejido y anestésicos también pueden afectar actividad del nervio y sensibilidad a la prueba estímulos en vivo. Por lo tanto, en los últimos años, un creciente número de estudios ha empleado en vitro (ex vivo) preparados de diferentes especies, incluyendo ratones, ratas, conejillos de Indias y los seres humanos, a examinar los mecanismos de transducción sensorial en colon aferentes y la excitabilidad alterada en condiciones de enfermedad. 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8
Principalmente se han reportado dos tipos de ex vivo de colon preparación: la preparación de la "hoja plana"5,9,10 y el "tubo" preparación3,4. Un video protocolo para la preparación de colon murino "hoja plana" ha sido previamente publicado11. En el presente Protocolo, el colon de ratón, con el PN) o los nervios esplácnicos lumbares (LSN) Unidos, es cosechada y sobrefundido en una cámara de tejido. El colon es abrir longitudinalmente, y el paquete del nervio que se extiende en un compartimiento de grabación llenado de aceite de parafina. Actividad del nervio es registrada mediante un electrodo monopolar de platino-iridio. El protocolo permite la identificación de los campos receptivos de las fibras aferentes individuales mediante el uso de estimulación eléctrica imparcial. Localiza la aplicación de estímulos químicos, así como la aplicación de paradigmas de estimulación mecánica diferentes (por ejemplo, focal mucosa sondeo y estiramiento circunferencial), a las terminaciones nerviosas aferentes. Debido a que el nervio debe ampliarse a una cámara separada de la cámara de tejido, es crítico para mantener el nervio conectado relativamente largo; la disección exitosa de los nervios plantea un desafío a los nuevos a esta metodología. Más recientemente, Nullens et al. publicó un protocolo de vídeo para la grabación en vitro de los aferentes mesentéricas yeyunal murino y segmentos colónicos12. En la preparación de este "tubo", el segmento de intestino con el mesenterio Unido se mantiene intacto, lo que permite la distensión gradual y la administración intra y extra luminal de diferentes productos químicos. Puesto que el nervio del mesenterio se registra utilizando un electrodo de succión, que puede colocarse cerca del tejido, se puede grabar actividad aferente a pesar de que el nervio del mesenterio es relativamente corto. Sin embargo, el nervio de mesenterio consiste en poblaciones mixtas de fibras aferentes vagales y espinales que inervan el yeyuno o toracolumbar hipogástrica. Lumbosacra pélvicos aferentes inervan el colon, que no puede ser discriminado en el presente Protocolo. Aquí, presentamos un protocolo detallado para el registro electrofisiológico de aferentes colon de rata mediante la preparación de colon "tubo" con un PG intacto Este método puede permitir la caracterización de las propiedades funcionales de lumbar esplácnico (hipogástrica) y aferentes pélvico lumbosacra.

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	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:215px;height:40px;">Sodium Pentobarbital</td>
			<td style="width:123px;">Shanghai Westang Bio-Tech</td>
			<td style="width:344px;">B558</td>
			<td style="width:208px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Capsaicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Electrode puller</td>
			<td>MicroData Instrument Inc</td>
			<td>PMP107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Neurolog System (Bioamplifier)</td>
			<td>Digitimer, Ltd</td>
			<td>Neurolog System</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">A/D converter</td>
			<td>Cambridge Electronic Design</td>
			<td>Micro1401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Data processing software</td>
			<td>Cambridge Electronic Design</td>
			<td>Spike2 version 6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Silver wire</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>EP12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glass tubes</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B150-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Electrode holder</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MEH3SBW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Heating bath</td>
			<td>Grant</td>
			<td>GR150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Zoom2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dissecting microscope</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PZMIII-BS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cigarette lighter</td>
			<td>any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Surgical tools</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Insect pins</td>
			<td>home-made from 0.1 mm stainless steel wire</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Three way manipulator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>KITF-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Rats</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td>Any strain/sex can be used.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro characterization of the electrophysiological properties of colonic afferent fibers in rats

Disfunción de los nervios sensoriales colónicas ha sido implicada en la fisiopatología de varias condiciones comunes, incluyendo la diabetes y las enfermedades de intestino inflamatorias y funcional. Aquí, describimos un protocolo para la caracterización en vitro de las propiedades electrofisiológicas de los aferentes de colon en ratas. El colon, con el ganglio pélvico intacto (PG) adjuntado, se retira de la rata; sobrefundido con carbogenated solución de Krebs en la sala de grabación; y canulado en los extremos orales y anales para permitir la distensión. Se identifica un paquete del nervio fino que emana de la PG, y la actividad reciente del nervio aferente se registra utilizando un electrodo de succión. Distensión del segmento colónico provoca aumentos graduales en descarga multiunit. Se realiza un análisis de componentes principales para diferenciar el bajo umbral, el umbral alto y las fibras aferentes de rango dinámico ancho. Sensibilidad química de los aferentes colónicos puede ser estudiada a través de la administración baño o intramural de prueba compuestos. Este protocolo puede modificarse para su aplicación a otras especies, tales como ratones y conejillos de Indias y para estudiar las diferencias en las propiedades electrofisiológicas de los aferentes hipogástrica/toracolumbar y lumbosacra pélvica del colon descendente en normal y condiciones patológicas.

La figura 1 es la ilustración esquemática de la disposición experimental para la preparación de colon ex vivo "tubo", con un representante de la grabación de un nervio distal a la PG El nervio contiene probablemente una mezcla de aferentes esplácnicos pélvicos y lumbares. En preparaciones de ratas normales, los nervios aferentes colon suelen tienen un bajo nivel de actividad espontánea irregular. Distensión de la rampa del colon provoca un a...

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In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats

Función sensorial anormal subyacente visceral del dolor y otros síntomas de enfermedad intestinal inflamatoria y funcional. Aquí se presenta un protocolo para el registro electrofisiológico de los nervios aferentes colónicos en una preparación de colon ex vivo rata.

In Vitro Caracterización de las propiedades electrofisiológicas de las fibras aferentes colónicas en ratas

Dysfunction of the colonic sensory nerves has been implicated in the pathophysiology of several common conditions, including functional and inflammatory ...

Research

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Neuroscience

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Acute In Vivo Electrophysiological Recordings of Local Field Potentials and Multi-unit Activity from the Hyperdirect Pathway in Anesthetized Rats

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