Name: a guide to production, crystallization, and structure determination of human ikk1/&#945;
Uploaded: 2018-11-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/ÃŽÂ± at JoVE.com

ونحن نشكر الموظفين في 19ID بيملينيس، 24ID، و 13ID في "المتقدم فوتون المصدر"، ولاية، وايل، للدعم المقدم من خلال جمع البيانات عن بلورات مختلف. نحن ممتنون لديمتري ليومكيس، ومعهد سولك لجلب لنا خريطة م البرد دقة منخفضة في المراحل المبكرة من م خريطة/نموذج البناء، الذي كان يستخدم لبناء نموذج البحث استبدال الجزيئية IKK1 الأولى. البحوث المؤدية إلى هذه النتائج تلقت تمويلاً من المعاهد الوطنية للصحة منح AI064326 و CA141722 و GM071862 جيغاغرام. SP هو حاليا "ويلكوم ترست DBT الهند الوسيطة زميل".

1-إعداد مناسبة للتعبير واسع النطاق من IKK1/α المؤتلف الفيروس
<ol><li>
إعداد الفيروس P1 32<ol>
<li>يوم 1: الخلايا Sf9 لوحة (~ 6 × 105) (رقم إصدار أقل من 10) في 2 مل من Sf900 الثالث المتوسط خلية الحشرات في كل جيد من لوحة 6-جيدا واحتضان عند 27 درجة مئوية. مرور الخلايا عندما تصل كثافة من 2 إلى 3...

<ol>
	<li>Xia, Y., Shen, S., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB,+an+active+player+in+human+cancers.">NF-kappaB, an active player in human cancers.</a> Cancer immunology research. 2 (9), 823-830 (2014).</li><li>Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity,+inflammation,+and+cancer.">Immunity, inflammation, and cancer.</a> Cell. 140 (6), 883-899 (2010).</li><li>Ben-Neriah, Y., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+meets+cancer,+with+NF-kappaB+as+the+matchmaker.">Inflammation meets cancer, with NF-kappaB as the matchmaker.</a> Nature immunology. 12 (8), 715-723 (2011).</li><li>Hinz, M., Scheidereit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IkappaB+kinase+complex+in+NF-kappaB+regulation+and+beyond.">The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond.</a> EMBO reports. 15 (1), 46-61 (2014).</li><li>Karin, M., Ben-Neriah, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+meets+ubiquitination:+the+control+of+NF-[kappa]B+activity.">Phosphorylation meets ubiquitination: the control of NF-[kappa]B activity.</a> Annu Rev Immunol. 18, 621-663 (2000).</li><li>Ghosh, S., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Missing+pieces+in+the+NF-kappaB+puzzle.">Missing pieces in the NF-kappaB puzzle.</a> Cell. 109, S81-S96 (2002).</li><li>Sun, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+noncanonical+NF-kappaB+pathway.">The noncanonical NF-kappaB pathway.</a> Immunol Rev. 246 (1), 125-140 (2012).</li><li>Bonizzi, G., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+NF-kappaB+activation+pathways+and+their+role+in+innate+and+adaptive+immunity.">The two NF-kappaB activation pathways and their role in innate and adaptive immunity.</a> Trends Immunol. 25 (6), 280-288 (2004).</li><li>DiDonato, J. A., Hayakawa, M., Rothwarf, D. M., Zandi, E., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cytokine-responsive+IkappaB+kinase+that+activates+the+transcription+factor+NF-kappaB.">A cytokine-responsive IkappaB kinase that activates the transcription factor NF-kappaB.</a> Nature. 388 (6642), 548-554 (1997).</li><li>Werner, S. L., Barken, D., Hoffmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulus+specificity+of+gene+expression+programs+determined+by+temporal+control+of+IKK+activity.">Stimulus specificity of gene expression programs determined by temporal control of IKK activity.</a> Science. 309 (5742), 1857-1861 (2005).</li><li>Zandi, E., Rothwarf, D. M., Delhase, M., Hayakawa, M., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IkappaB+kinase+complex+(IKK)+contains+two+kinase+subunits,+IKKalpha+and+IKKbeta,+necessary+for+IkappaB+phosphorylation+and+NF-kappaB+activation.">The IkappaB kinase complex (IKK) contains two kinase subunits, IKKalpha and IKKbeta, necessary for IkappaB phosphorylation and NF-kappaB activation.</a> Cell. 91 (2), 243-252 (1997).</li><li>Rothwarf, D. M., Zandi, E., Natoli, G., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IKK-gamma+is+an+essential+regulatory+subunit+of+the+IkappaB+kinase+complex.">IKK-gamma is an essential regulatory subunit of the IkappaB kinase complex.</a> Nature. 395 (6699), 297-300 (1998).</li><li>Yamaoka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementation+cloning+of+NEMO,+a+component+of+the+IkappaB+kinase+complex+essential+for+NF-kappaB+activation.">Complementation cloning of NEMO, a component of the IkappaB kinase complex essential for NF-kappaB activation.</a> Cell. 93 (7), 1231-1240 (1998).</li><li>Li, Z. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IKKbeta+subunit+of+IkappaB+kinase+(IKK)+is+essential+for+nuclear+factor+kappaB+activation+and+prevention+of+apoptosis.">The IKKbeta subunit of IkappaB kinase (IKK) is essential for nuclear factor kappaB activation and prevention of apoptosis.</a> J Exp Med. 189 (11), 1839-1845 (1999).</li><li>Hayden, M. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shared+principles+in+NF-kappaB+signaling.">Shared principles in NF-kappaB signaling.</a> Cell. 132 (3), 344-362 (2008).</li><li>Sun, S. C., Chang, J. H., Jin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+nuclear+factor-kappaB+in+autoimmunity.">Regulation of nuclear factor-kappaB in autoimmunity.</a> Trends Immunol. 34 (6), 282-289 (2013).</li><li>Claudio, E., Brown, K., Park, S., Wang, H., Siebenlist, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAFF-induced+NEMO-independent+processing+of+NF-kappa+B2+in+maturing+B+cells.">BAFF-induced NEMO-independent processing of NF-kappa B2 in maturing B cells.</a> Nat Immunol. 3 (10), 958-965 (2002).</li><li>Senftleben, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+by+IKKalpha+of+a+second,+evolutionary+conserved,+NF-kappa+B+signaling+pathway.">Activation by IKKalpha of a second, evolutionary conserved, NF-kappa B signaling pathway.</a> Science. 293 (5534), 1495-1499 (2001).</li><li>Coope, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40+regulates+the+processing+of+NF-kappaB2+p100+to+p52.">CD40 regulates the processing of NF-kappaB2 p100 to p52.</a> EMBO J. 21 (20), 5375-5385 (2002).</li><li>Dejardin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lymphotoxin-beta+receptor+induces+different+patterns+of+gene+expression+via+two+NF-kappaB+pathways.">The lymphotoxin-beta receptor induces different patterns of gene expression via two NF-kappaB pathways.</a> Immunity. 17 (4), 525-535 (2002).</li><li>Xiao, G., Fong, A., Sun, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+p100+processing+by+NF-kappaB-inducing+kinase+involves+docking+IkappaB+kinase+alpha+(IKKalpha)+to+p100+and+IKKalpha-mediated+phosphorylation.">Induction of p100 processing by NF-kappaB-inducing kinase involves docking IkappaB kinase alpha (IKKalpha) to p100 and IKKalpha-mediated phosphorylation.</a> The Journal of biological chemistry. 279 (29), 30099-30105 (2004).</li><li>Xiao, G., Harhaj, E. W., Sun, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB-inducing+kinase+regulates+the+processing+of+NF-kappaB2+p100.">NF-kappaB-inducing kinase regulates the processing of NF-kappaB2 p100.</a> Molecular cell. 7 (2), 401-409 (2001).</li><li>Qing, G., Qu, Z., Xiao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+basally+translated+NF-kappaB-inducing+kinase+(NIK)+protein+functions+as+a+molecular+switch+of+processing+of+NF-kappaB2+p100.">Stabilization of basally translated NF-kappaB-inducing kinase (NIK) protein functions as a molecular switch of processing of NF-kappaB2 p100.</a> J Biol Chem. 280 (49), 40578-40582 (2005).</li><li>Zarnegar, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncanonical+NF-kappaB+activation+requires+coordinated+assembly+of+a+regulatory+complex+of+the+adaptors+cIAP1,+cIAP2,+TRAF2+and+TRAF3+and+the+kinase+NIK.">Noncanonical NF-kappaB activation requires coordinated assembly of a regulatory complex of the adaptors cIAP1, cIAP2, TRAF2 and TRAF3 and the kinase NIK.</a> Nat Immunol. 9 (12), 1371-1378 (2008).</li><li>Vallabhapurapu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonredundant+and+complementary+functions+of+TRAF2+and+TRAF3+in+a+ubiquitination+cascade+that+activates+NIK-dependent+alternative+NF-kappaB+signaling.">Nonredundant and complementary functions of TRAF2 and TRAF3 in a ubiquitination cascade that activates NIK-dependent alternative NF-kappaB signaling.</a> Nat Immunol. 9 (12), 1364-1370 (2008).</li><li>Annunziata, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequent+engagement+of+the+classical+and+alternative+NF-kappaB+pathways+by+diverse+genetic+abnormalities+in+multiple+myeloma.">Frequent engagement of the classical and alternative NF-kappaB pathways by diverse genetic abnormalities in multiple myeloma.</a> Cancer cell. 12 (2), 115-130 (2007).</li><li>Keats, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promiscuous+mutations+activate+the+noncanonical+NF-kappaB+pathway+in+multiple+myeloma.">Promiscuous mutations activate the noncanonical NF-kappaB pathway in multiple myeloma.</a> Cancer cell. 12 (2), 131-144 (2007).</li><li>Staudt, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+activation+of+NF-kappaB.">Oncogenic activation of NF-kappaB.</a> Cold Spring Harbor perspectives in biology. 2 (6), a000109 (2010).</li><li>Polley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structural+basis+for+IkappaB+kinase+2+activation+via+oligomerization-dependent+trans+auto-phosphorylation.">A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation.</a> PLoS Biol. 11 (6), e1001581 (2013).</li><li>Hinz, M., Scheidereit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IkappaB+kinase+complex+in+NF-kappaB+regulation+and+beyond.">The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond.</a> EMBO Rep. 15 (1), 46-61 (2014).</li><li>Scheidereit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IkappaB+kinase+complexes:+gateways+to+NF-kappaB+activation+and+transcription.">IkappaB kinase complexes: gateways to NF-kappaB activation and transcription.</a> Oncogene. 25 (51), 6685-6705 (2006).</li><li>Luckow, V. A., Lee, S. C., Barry, G. F., Olins, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+infectious+recombinant+baculoviruses+by+site-specific+transposon-mediated+insertion+of+foreign+genes+into+a+baculovirus+genome+propagated+in+Escherichia+coli.">Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli.</a> J Virol. 67 (8), 4566-4579 (1993).</li><li>Polley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Basis+for+the+Activation+of+IKK1/alpha.">Structural Basis for the Activation of IKK1/alpha.</a> Cell reports. 17 (8), 1907-1914 (2016).</li><li>Otwinowski, Z. a. M., W, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+X-ray+Diffraction+Data+Collected+in+Oscillation+Mode.">Processing of X-ray Diffraction Data Collected in Oscillation Mode.</a> Methods in Enzymology. 276 (Macromolecular Crystallography, part A), 307-326 (1997).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+human+IkappaB+kinase+beta+asymmetric+dimer.">Crystal structure of a human IkappaB kinase beta asymmetric dimer.</a> J Biol Chem. 288 (31), 22758-22767 (2013).</li><li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+development+of+Coot.">Features and development of Coot.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).</li><li>McCoy, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phaser+crystallographic+software.">Phaser crystallographic software.</a> Journal of applied crystallography. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).</li><li>Vagin, A. T., Teplyakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MOLREP:+an+automated+program+for+molecular+replacement.">MOLREP: an automated program for molecular replacement.</a> J. Appl. Cryst. 30, 1022-1025 (1997).</li><li>Brunger, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Version+1.2+of+the+Crystallography+and+NMR+system.">Version 1.2 of the Crystallography and NMR system.</a> Nature protocols. 2 (11), 2728-2733 (2007).</li><li>Brunger, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallography+&amp;+NMR+system:+A+new+software+suite+for+macromolecular+structure+determination.">Crystallography &amp; NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological. 54 (Pt 5), 905-921 (1998).</li><li>McRee, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XtalView:+a+visual+protein+crystallographic+software+system+for+X11/Xview.">XtalView: a visual protein crystallographic software system for X11/Xview.</a> J. Mol Graph. 10, 44-47 (1992).</li><li>Schroder, G. F., Levitt, M., Brunger, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+biomolecular+crystallography+with+low-resolution+data.">Super-resolution biomolecular crystallography with low-resolution data.</a> Nature. 464 (7292), 1218-1222 (2010).</li><li>Polley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structural+basis+for+IkappaB+kinase+2+activation+via+oligomerization-dependent+trans+auto-phosphorylation.">A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation.</a> PLoS biology. 11 (6), e1001581 (2013).</li><li>Christopher, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+discovery+of+2-amino-3,5-diarylbenzamide+inhibitors+of+IKK-alpha+and+IKK-beta+kinases.">The discovery of 2-amino-3,5-diarylbenzamide inhibitors of IKK-alpha and IKK-beta kinases.</a> Bioorganic &amp; medicinal chemistry letters. 17 (14), 3972-3977 (2007).</li><li>Karplus, P. A., Diederichs, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+crystallographic+model+and+data+quality.">Linking crystallographic model and data quality.</a> Science. 336 (6084), 1030-1033 (2012).</li><li>Chen, V. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MolProbity:+all-atom+structure+validation+for+macromolecular+crystallography.">MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 1), 12-21 (2010).</li></ol>

حل الإنتاج وتبلور وهيكل من اثنين من البروتينات إيك ذات الصلة لقد حددنا لتحديد هيكل الكريستال الأشعة السينية IKK1/α مع الفكرة القائلة أنه سيكون عملية معقدة نسبيا نظراً لتجربتنا مع IKK2/β إنتاج البروتين والتبلور، وتصميم الهيكل. ومع ذلك، فوجئنا بدرجة عالية أن هذه البروتينات ذات الصلة...

الأنشطة النسخي NF-κB الأسرة من عوامل النسخ dimeric مطلوبة من أجل وظائف خلوية متنوعة تتراوح بين الالتهاب والحصانة للبقاء على قيد الحياة والموت. وتخضع هذه الأنشطة صارم في الخلايا وفقدان التنظيم يؤدي إلى مختلف الحالات المرضية، بما في ذلك أمراض المناعة الذاتية والسرطان1،،من23. نظراً لغياب حافز، يتم الاحتفاظ بأنشطة NF-κB تحول دون ب البروتينات IκB (المانع-κB)4. علامات الفسفرة بقايا Ser محددة على البروتينات IκB لهم أوبيكويتينيشن وتدهور proteasomal اللاحقة أو معالجة انتقائية5. اثنين مؤنزم Ser/Thr عالية مثلى، IKK2/β و IKK1/α، تعمل كوسط منظمي الأنشطة NF-κB بالاضطلاع بهذه الأحداث الفسفرة6،7.
التفاعلات بين يجند ومستقبلات ترانسدوسيس إشارة من خلال سلسلة من الوسطاء مما يؤدي إلى تنشيط عوامل NF-κB. ويمكن تصنيف عملية التنبيه NF-κB على نطاق واسع إلى مسارين متميزة-المقبول وغير المقبول (البديلة)8. وينظم نشاط IKK2/β أساسا NF-κB إشارات من مسار الكنسي الذي يعتبر أساسيا للاستجابات المناعية التحريضية والفطرية9. سمة مميزة لهذا المسار تنشيط السريع ولم تدم طويلاً من IKK2/β10 داخل إيك أونتشاراكتيريزيد المتحلل حتى الآن معقدة – يفترض أن تكون مؤلفة من IKK1 و IKK2، فضلا عن عنصر تنظيمي، نيمو (NF-κB "المغير الأساسية" )11،،من1213. بين وحدتين فرعيتين إيك الحفاز لمجمع إيك، IKK2 هو أساسا مسؤولة14 الفسفرة بقايا محددة لتنميط IκBs (α،-β، وγ) منضمة إلى NF-κB، وأيضا بروتين IκB شاذة، NF-κB1/p105، الذي تمهيدا ل وحدة فرعية p50 NF-κB5. الناجم عن الفسفرة أوبيكويتينيشن وتدهور proteasomal IκB (أو تجهيز p105) يؤدي إلى إطلاق سراح والتنشيط لمجموعة محددة من NF-κB dimers15. وقد لوحظ نشاط NF-κB الشاذة بسبب سوء تنظيم وظيفة IKK2 في العديد من أنواع السرطان، وكذلك كما هو الحال في اضطرابات المناعة الذاتية2،،من316.
على النقيض من IKK2/β، ينظم نشاط من IKK1/α NF-κB يشير المسار غير متعارف عليه، هو أمر ضروري للتنمية والحصانة. IKK1 فوسفوريلاتيس بقايا محددة من NF-κB2/p100 في جزئه IκBδ ج-الطرفية، مما يؤدي إلى المعالجة وتوليد p52. يبدأ تشكيل هيتيروديمير p52:RelB ترانسكريبتيونالي النشطة استجابة بطيئة ومتواصلة لإشارات التنموية7،17،،من1819،20. من المثير للاهتمام، جيل p52 عامل نف κB المركزية لهذا المسار اعتماداً كبيرا على عامل آخر، كيناز الذي يحفز NF-κB (NIK)21،22، لكن ليس على IKK2 أو نيمو. في الخلايا يستريح، لا يزال مستوى NIK منخفضا بسبب لها التردي المستمر تعتمد على بروتوزوم23،24،25. عند تنشيط خلايا يغاندس 'غير مقبول'، وفي بعض الخلايا الخبيثة، يصبح استقرت NIK لتوظيف وتفعيل IKK1/α-أنشطة كيناز NIK و IKK1 ضرورية لفعالية تجهيز p100 إلى p527. IKK1 و NIK فوسفوريلاتي سيرينس الثلاثة (Ser866، 870 و 872) من NF-κB2/p100 في جزئه IκBδ ج-الطرفية مما يؤدي إلى المعالجة وتوليد p52. قد تورط الشاذة تفعيل المسار غير متعارف عليه في كثير من الأورام الخبيثة بما في ذلك الورم النخاعي المتعدد26،،من2728.
عدة مثبطات كفاءة عالية ومحددة ل IKK2/β معروفة، على الرغم من أن لا شيء حتى الآن وقد اتضح أن دواء فعال. وفي المقابل، مثبطات IKK1/α-محددة متفرق. وهذا قد تنبع جزئيا من افتقارنا للمعلومات الهيكلية والبيوكيميائية على IKK1/α، مما يحد من فهمنا للأساس آليا إلى تفعيل NF-κB التي IKK1 في الخلايا، وتصميم الأدوية العقلاني. هياكل الأشعة السينية IKK2/β قدم لنا رؤى في تفعيل إليه بيتا IKK2/29؛ ومع ذلك، هذه الهياكل يمكن أن لا تكشف عن مدى اختلاف المحفزات المنبع يؤدي التنشيط IKK1/α أو IKK2/β لتنظيم مجموعات متميزة من NF-κB الأنشطة 30،31. لفهم أساس الميكانيكية الأساسية لوظيفة التنبيه متميزة IKK1/α، وإنشاء منبر لتصميم الأدوية العقلاني، ركزنا على تحديد هيكل IKK1/α.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cellfectin/Cellfectin II</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10362100</td>
			<td>Cellfectin is now discontinued, replaced by Cellfectin II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf900 III Insect cell medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12658-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SF9 cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12659017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-IKK1 antibody</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB100-56704</td>
			<td>Previously sold by Imgenex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PentaHis antibody</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>34460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>Nitrocellulose can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford assay reagent</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>500001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28989335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon concentrator</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC801008, UFC803008, UFC201024, UFC203024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound A</td>
			<td>Bayer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calbiochem IKK-inhibitor XII</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>401491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staurosporine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>S4400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLN120B</td>
			<td>Millenium</td>
			<td>Gift item</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPPNP</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A2647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulfate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>51227, 42867, 31404,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulfate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>93593, 81210, 88276, 95904, 81255, 89510, 92897, 81285, 95172</td>
			<td>Some of them are new Cat # on SIGMA catalogue. What we had was originally from Fluka that had different Cat #.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystallization Screens</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Screen I and II (Crystal Screen HT)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index HT</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG/Ion and PEG/Ion2 (PEG/Ion HT)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEGRX 1 and PEGRx 2 (PEGRx HT)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SaltRx 1 and SaltRx 2 (SaltRx HT)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal mounts</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR8-188, 190, 192, 194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synchrotron</td>
			<td>The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy&#8217;s Argonne National Laboratory</td>
			<td>Beamline 19 ID</td>
			<td>The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy&#8217;s Argonne National Laboratory provides ultra-bright, high-energy storage ring-generated X-ray beams for research in almost all scientific disciplines.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a guide to production, crystallization, and structure determination of human ikk1/&#945;

فئة من المحفزات خارج الخلية يتطلب التنشيط من IKK1/α للحث على جيل من وحدة فرعية NF-κB، p52، من خلال تجهيز p100 السلائف. وظائف p52 هوموديمير أو هيتيروديمير مع وحدة فرعية NF-κB آخر، ريلب. وتنظم هذه dimers بدوره التعبير عن مئات جينات المعنية بالتهاب وبقاء الخلية، ودورة الخلية. IKK1/α أساسا يظل المقترنة مع IKK2/β ونيمو كمجمع ثلاثي. ومع ذلك، يلاحظ أيضا بركة صغيرة لأنها complex(es) وزن الجزيئي منخفض. من غير المعروف إذا كان يتم تشغيل نشاط تجهيز p100 بتفعيل IKK1/α داخل أكبر أو أصغر مجموعة معقدة. تم الكشف عن نشاط المكونة من IKK1/α في العديد من أنواع السرطان والأمراض الالتهابية. لفهم الآلية لتفعيل IKK1/α، ويمكن استخدامه كهدف المخدرات، أعربنا عن المؤتلف IKK1/α في أنظمة المضيف مختلفة، مثل كولاي، والحشرات، وخلايا الثدييات. لقد نجحنا في التعبير عن IKK1/α القابلة للذوبان في باكولوفيروس إصابة خلايا الحشرات، الحصول على كميات ملغ من البروتين النقي جداً، وبلورة ذلك حضور مثبطات، وتحديد هيكلها كريستال بالأشعة السينية. هنا، نحن تصف الخطوات التفصيلية لإنتاج البروتين المؤتلف وفي التبلور، وعزمه الهيكل كريستال بالأشعة السينية.

الاستنساخ والتعبير عن نيات مختلفة من IKK1/α طول كامل تم استنساخ البشر IKK1/α في بفاستباتشتا ناقلات التعبير باكولوفيروس داخل مواقعها تقييد اكوري و NotI للحصول على سداسي-الحامض الأميني الطرفي ن المعلمة IKK1. يمكن إزالة العلامة بحوزتي TEV الهضم. منذ طول كامل IKK1/α تحتوي على ...

Watch this Scientific Journal Video about A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/ÃŽÂ± at JoVE.com

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

كيناز IκB 1/α (IKK1/α الشق) هو كيناز بروتين Ser/منتدى المجالس الرومانسية التي تشارك في مجموعة متنوعة أنشطة الخلوية أساسا من خلال تفعيل عوامل النسخ نف κB. وهنا يصف لنا الخطوات الرئيسية اللازمة لإنتاج وتصميم هيكل الكريستال هذا البروتين.

دليل للإنتاج وتبلور، وتصميم هيكل للبشرية IKK1/α

A class of extracellular stimuli requires activation of IKK1/&#945; to induce generation of an NF-&#954;B subunit, p52, through processing of its ...

والهدف من هذا الإجراء هو توفير التوجيه لإنتاج وبلورة وتحديد الهيكلية للإنسان IKK1-ألفا من أجل فهم الأساس الميكانيكي لوظيفتها الإشارات وإنشاء منصات لتصميم المخدرات الرشيد. وينبغي أن تساعد هذه الطريقة الباحثين في تحديد هيكل IKK1، والتي من شأنها أن توفر إجابات على الاستفسارات الرئيسية في مجال الإشارات المناعية. تصف هذه التقنية مسارًا مبسطًا للحصول على بلورات من بروتينات IKK ، والتي هي بالأحرى انكسارية للتبلور وتوفير معلومات مهمة مختلفة في التغلب على الاختناقات في تحديد الهياكل.عموما ، سوف الأفراد الجدد لهذه الطريقة النضال ، وذلك لأن توليد كميات مليغرام من البروتين القابل للذوبان ، وحسن السلوك ، ويتطلب التعبير عنها في خلايا الحشرات ، ويمكن أن يتم التبلور فقط تحت نافذة ضيقة للغاية من الظروف. يمكن أن يكون إجراء الاستبدال الجزيئي المستخدم في تحديد بنية IKK1 صعبًا للغاية ، خاصة بسبب سوء خاصية الانحراف للبلورات ، وليس في موقع الوحدة غير المتماثلة التي تحتوي على العديد من جزيئات IKK1 في غياب نماذج البحث المناسبة. إثبات الإجراءات سيكون كايل شوماتي وسونجيلا هوتشكيس، طلاب من مختبري.في اليوم الأول ، الخلايا Sf9 لوحة في مليلترين من Sf903 خلية حشرات المتوسطة ، في كل بئر من لوحة ستة بئر واحتضان في 27 درجة مئوية. مرور الخلايا عندما تصل إلى كثافة من 2 إلى 3 مرات 10 إلى الخلايا الست لكل ملليلتر في التعليق عن طريق تمييعها إلى وسائط جديدة، في كثافة حوالي ست مرات 10 إلى 5. في اليوم الثاني ، تمييع ثمانية ميكرولترات من كاشف Sf9 transfection في 100 ميكرولترات من SF-903 أو وسط الحشرات في غريس.ثم دوامة الخليط لفترة وجيزة. في أنبوب منفصل، تمييع ميكروغرام واحد من عصيات إعادة الكومبيتامين المنقى في 100 ميكرولترات من نفس الوسيلة. الجمع بين الحمض النووي المخفف ومكشف نقل.بعد احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 إلى 30 دقيقة، وإزالة المتوسطة من البئر. ثم يضاف ملليلتر واحد من المتوسطة الطازجة. بعد ذلك ، أضف الخليط المُخفف من الملوثات الخلوية بالحمض النووي إلى الخلايا ، مع ضبط حجم القطرة بحيث لا يطرد الخلايا المضمّنة.بعد ست ساعات، إضافة 1.5 ملليلتر من المتوسطة الطازجة على رأس الخلايا. احتضان الخلايا في 27 درجة مئوية، والتحقق من الآبار بشكل دوري كل 12 ساعة لعلامات العدوى الفيروسية. في اليوم الخامس، إزالة الخلايا التي تحتوي على المتوسطة، 60 إلى 72 ساعة بعد العدوى.وبعد نقل الوسيط إلى أنابيب، يتم إرسال أجهزة الطرد المركزي لمدة خمس دقائق بمعدل 500 ضعف غرام وأربع درجات مئوية. عند الانتهاء، حفظ عظمى، وهو كومة فيروس P1. في اليوم الأول، resuspend إعداد سابقا له-IKK1 خلية بيليه في 40 ملليلتر من العازلة تحلل.وضع تعليق الخلية على الجليد وlyse الخلايا عن طريق سونيكيشن في 60٪ إلى 70٪ دورات الخدمة و 5 إلى 10 نبضات من 30 ثانية مدة في فاصل زمني أكبر من دقيقة واحدة. توضيح lysate بواسطة الطرد المركزي في أكبر من أو يساوي 28، 000 ز لمدة 45 دقيقة في أربع درجات مئوية. بعد إعداد راتنج النيكل-NTA Agarose, وفقا لبروتوكول النص, elute له الموسومة IKK1 بروتين ألفا تحت تدفق الجاذبية باستخدام 20 ملليلتر من عازلة elution.جمع 1-1.5 ملليلتر الكسور. بعد الجمع بين الكسور التي تحتوي على البروتين، هضم العينة مع بروتياز TEV بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية. في صباح اليوم الثاني، احتضان البروتين مع ملليمتر واحد من ATP، في وجود كلوريد المغنيسيوم، بيتا غليسيروفوسفات، فلوريد الصوديوم وعظام الصوديوم لمدة ساعة واحدة في 27 درجة مئوية.بعد الحضانة، قم بتصفية محلول البروتين من خلال فلتر 0.45 ميكرون. ثم قم بتحميل ما يقرب من ستة ملليلترات من العينة على عمود 120 ملليلتر إعدادي حجم استبعاد، تعلق على نظام كروماتوغرافيا السائل الآلي. بعد التوازن، قم بتشغيل كروماتوغرافيا الحجم -استبعاد بمعدل تدفق من ملليلتر واحد في الدقيقة وجمع كسور مليلتر اثنين.خلال المدى، رصد elution في 280 و 254 نانومتر. بعد سحب الكسور النقية، والتركيز في 30 كيلودالون، الوزن الجزيئي قطع المركزية المكثف، اتباع تعليمات الشركة المصنعة. ثم الاستغناء عن 25 ميكرولتر aliquots من البروتين المركز وفلاش تجميد في النيتروجين السائل.باستخدام الروبوت، ماصة 80 إلى 100 ميكرولترات من كاشف التبلور في خزان لوحة 96 جيدا. باستخدام الروبوت تبلور، الاستغناء ومزيج 0.2 إلى 0.25 ميكرولترات من IKK1 ومجمع المانع مع نفس حجم محلول الخزان. مباشرة بعد وضع قطرات، وختم كل لوحة مع الأفلام واضحة بصريا لتجنب التبخر.احتضان صفيحة واحدة في 18 درجة مئوية واللوحة الأخرى في أربع درجات مئوية في غرفة باردة. استخدام مجهر ستيريو مع المستقطب للتحقق من مظهر من الكريستال في كل قطرة، كل يوم، لأول سبعة أيام ثم على فترات أطول. بعد إعداد IKK1 ومُركب مثبطاته كما هو موضح سابقًا ، قم بنقل حلول البئر إلى كل بئر من 24 بئرًا.مكان واحد إلى 1.5 ميكرولترات من حل جيدا على غطاء الزجاج النظيف. إضافة حجم متساو من IKK1 ومجمع المانع لها إلى غطاء الزجاج ومزيج بلطف عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا ثلاث إلى أربع مرات. بعد تطبيق الشحوم على حلقات كل بئر من لوحة، بدوره غطاء الزجاج أكثر من مكان على بئر مع ملقط.ثم ختم البئر عن طريق الضغط على أسفل على غطاء الزجاج. بعد إعداد جميع قطرات في لوحة 24-جيدا، احتضان في غرفة باردة، في الظلام. أحيانا تحقق من قطرات تحت المجهر لمظهر ونمو البلورات.بمجرد اكتمال نمو البلورات، قم بإزالة غطاء الزجاج الذي يحتوي على الكريستال بلطف وضعه على سطح صلب مع هبوط الكريستال الذي يواجه الصعود. إضافة بلطف 10 ميكرولترات من محلول كريو A على رأس قطرة ومزيج بلطف عن طريق الأنابيب بحيث لا يتم لمس الكريستال. باستخدام المجهر، وإزالة ببطء بعض السوائل من الكريستال والحفاظ على حوالي خمسة إلى ثمانية ميكرولترات من المحلول.إضافة بلطف 2.5 إلى أربعة ميكرولترات من محلول ب التبريد على قطرة ومزيج بلطف عن طريق pipetting. غطي غطاء الزجاج بطبق صغير من بيتري لتجنب تدفق الهواء المباشر فوق الكريستال. بعد الانتظار خمس دقائق، واختيار بعناية بلورة واحدة من قطرة في cryoloop مناسبة شنت على قاعدة مناسبة.فلاش تجميد الكريستال في النيتروجين السائل. ثم تخزين الكريستال التي تحتوي على cryoloop في عفريت مغمورة في النيتروجين السائل في قارورة ديوار حتى جاهزة لالأشعة السينية حيود في السنكروترون. بعد تجارب واسعة النطاق مع عدة متغيرات مختلفة IKK1، تم الحصول على بلورات مع بناء واحد مبتور، والتي عرضت خصائص مناسبة الأشعة السينية فقط في وجود مثبطات IKK الثاني عشر.إن التأثير المشترك لبيانات الأشعة السينية ذات الدقة المنخفضة ذات الكثافة الضعيفة، وعدد كبير من جزيئات IKK1 في الوحدة غير المتماثلة والاختلاف التكتّاني لنموذج IKK1 أحادية االشعب- الديميريك، مقارنة بنماذج IKK2 المعروفة، جعل من الصعب الحصول على حل الاستبدال الجزيئي IKK1 وتحديد هيكله. أشارت هياكل IKK2 مختلفة إلى اتجاه مختلف بين المونمر داخل الخافتات بحيث أن المسافة بين كربونات ألفا من P578 في مجالين كيناز، في أربعة نماذج مختلفة من dimer، تختلف بين 39 و 61 انجستروم. كان الحصول على نموذج بحث مفيد ممكنًا بسبب خريطة المجهر ذات الدقة المنخفضة للتبريد ونموذج عالي الدقة للنطاقات IKK1 التي يمكن إنشاؤها استنادًا إلى بنية IKK2 عالية الدقة.وأشار النموذج الأولي إلى اتجاه نطاق كيناز استدارة 24 درجة بالنسبة إلى أن من مونومر IKK2 وفتحة N-المحطة الطرفية من 58 انجستروم. باستخدام واحدة من التممر مع افتتاح 52-angstrom كنموذج، تم تحديد ستة خافمات في وحدة غير متناظرة. وبمجرد أن يتقن، يمكن تنفيذ هذه التقنية في بضعة أشهر، إذا تم تنفيذها بشكل صحيح.أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر أن الحصول على بروتين قابل للذوبان ونشط وحسن السلوك هو الخطوة الحاسمة الأولى. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم عام جيد لجميع الخطوات التي تحتاج إلى اتباعها في التفاصيل المضنية، لتكون ناجحة في بلورة وتحديد هيكل بروتين IKK1. تعلم هذا الإجراء، لا تزال هناك هياكل من البروتينات العائلية IKK الأخرى التي يمكن أيضا أن تحدد من أجل الإجابة على أسئلة إضافية حول إشارات كيناز-ميتوجين.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/&#945;

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization والتعبير وتنقية، وتبلور من السيروتونين الناقل الإنسان ملزمة ل<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Combining Wet and Dry Lab Techniques to Guide the Crystallization of Large Coiled-coil Containing Proteins

الجمع بين الرطب وتقنيات مختبر الجافة لتوجيه بلورة البروتينات كبيرة ملفوف لفائف تحتوي على

Obtaining crystals for structure determination can be a difficult and time consuming proposition for any protein. Coiled-coil proteins and domains are ...

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

إنتاج وبلورة وتحديد هيكل<em&gt; C. صعب</em&gt; PPEP-1 عن طريق Microseeding والزنك والصحراء

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

عالية الدقة حنق في مستوى جزيء واحد لجزيء الجزيئي تحديد هيكل

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO

الإنتاج ، البلورة ، وتحديد الهيكل للمجال الملزم IKK من نيمو

NEMO is a scaffolding protein which plays an essential role in the NF-&#954;B pathway by assembling the IKK-complex with the kinases IKK&#945; and ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

التبلور والتصميم الهيكلي للانزيم: مجمع الركيزة بواسطة البلورات التسلسلية في رقاقة Microfluidic متعددة الاستخدامات

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

The Extraction of Liver Glycogen Molecules for Glycogen Structure Determination

Liver glycogen is a hyperbranched glucose polymer that is involved in the maintenance of blood sugar levels in animals. The properties of glycogen are ...

Efficient and Scalable Production of Full-length Human Huntingtin Variants in Mammalian Cells using a Transient Expression System

Full-length huntingtin (FL HTT) is a large (aa 1-3,144), ubiquitously expressed, polyglutamine (polyQ)-containing protein with a mass of approximately 350 ...

High-Throughput Screening for Protein Crystallization

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography (Video) | JoVE 

فحص عالي الإنتاجية للحصول على نتائج بلورية لعلم بلورات البروتين

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into ...

A Fibrinolytic Enzyme-Based Method to Study Cerebral Thrombus Cell Components

A Comprehensive Approach to Analyze the Cell Components of Cerebral Blood Clots

A Novel Method for Comprehensive Cell Component Analysis of Cerebral Blood Clots (Video) | JoVE

نهج شامل لتحليل مكونات الخلايا من جلطات الدم الدماغية

Cerebral thrombosis, a blood clot in a cerebral artery or vein, is the most common type of cerebral infarction. The study of the cell components of ...