Name: a guide to production, crystallization, and structure determination of human ikk1/&#945;
Uploaded: 2018-11-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/ÃŽÂ± at JoVE.com

Vi takke personalet på beamlines 19ID, 24ID og 13ID på avanceret Photon kilde, Lemont, IL, for støtte under dataindsamling på forskellige krystaller. Vi er taknemmelige for Dmitry Lyumkis, Salk Institute til at hente os lav opløsning cryo-EM kort på tidlige stadier af EM kort/model bygning, som blev brugt til at bygge den første IKK1 molekylære udskiftning søgemodel. Forskning fører til disse resultater har modtaget midler fra NIH tilskud AI064326, CA141722 og GM071862 til GG. SP er i øjeblikket en Wellcome Trust DBT Indien mellemliggende fyr.

1. forberedelse af rekombinant Virus egnet til storstilet udtryk for IKK1/α
<ol><li>
P1 virus forberedelse 32<ol>
<li>Dag 1: Plade Sf9 celler (~ 6 X 105) (passage nummer mindre end 10) i 2 mL af Sf900 III insekt celle medium i hver godt af en 6-godt plade og inkuberes ved 27 ° C. Passage celler, når de når en massefylde på 2 til 3 X 106 celler pr. mL i suspension ved fortynding i friske medier med en tæthed på ~ 6 X 105.</li>
		<li>Dag 2: ...

<ol>
	<li>Xia, Y., Shen, S., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB,+an+active+player+in+human+cancers.">NF-kappaB, an active player in human cancers.</a> Cancer immunology research. 2 (9), 823-830 (2014).</li><li>Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity,+inflammation,+and+cancer.">Immunity, inflammation, and cancer.</a> Cell. 140 (6), 883-899 (2010).</li><li>Ben-Neriah, Y., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+meets+cancer,+with+NF-kappaB+as+the+matchmaker.">Inflammation meets cancer, with NF-kappaB as the matchmaker.</a> Nature immunology. 12 (8), 715-723 (2011).</li><li>Hinz, M., Scheidereit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IkappaB+kinase+complex+in+NF-kappaB+regulation+and+beyond.">The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond.</a> EMBO reports. 15 (1), 46-61 (2014).</li><li>Karin, M., Ben-Neriah, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+meets+ubiquitination:+the+control+of+NF-[kappa]B+activity.">Phosphorylation meets ubiquitination: the control of NF-[kappa]B activity.</a> Annu Rev Immunol. 18, 621-663 (2000).</li><li>Ghosh, S., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Missing+pieces+in+the+NF-kappaB+puzzle.">Missing pieces in the NF-kappaB puzzle.</a> Cell. 109, S81-S96 (2002).</li><li>Sun, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+noncanonical+NF-kappaB+pathway.">The noncanonical NF-kappaB pathway.</a> Immunol Rev. 246 (1), 125-140 (2012).</li><li>Bonizzi, G., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+NF-kappaB+activation+pathways+and+their+role+in+innate+and+adaptive+immunity.">The two NF-kappaB activation pathways and their role in innate and adaptive immunity.</a> Trends Immunol. 25 (6), 280-288 (2004).</li><li>DiDonato, J. A., Hayakawa, M., Rothwarf, D. M., Zandi, E., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cytokine-responsive+IkappaB+kinase+that+activates+the+transcription+factor+NF-kappaB.">A cytokine-responsive IkappaB kinase that activates the transcription factor NF-kappaB.</a> Nature. 388 (6642), 548-554 (1997).</li><li>Werner, S. L., Barken, D., Hoffmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulus+specificity+of+gene+expression+programs+determined+by+temporal+control+of+IKK+activity.">Stimulus specificity of gene expression programs determined by temporal control of IKK activity.</a> Science. 309 (5742), 1857-1861 (2005).</li><li>Zandi, E., Rothwarf, D. M., Delhase, M., Hayakawa, M., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IkappaB+kinase+complex+(IKK)+contains+two+kinase+subunits,+IKKalpha+and+IKKbeta,+necessary+for+IkappaB+phosphorylation+and+NF-kappaB+activation.">The IkappaB kinase complex (IKK) contains two kinase subunits, IKKalpha and IKKbeta, necessary for IkappaB phosphorylation and NF-kappaB activation.</a> Cell. 91 (2), 243-252 (1997).</li><li>Rothwarf, D. M., Zandi, E., Natoli, G., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IKK-gamma+is+an+essential+regulatory+subunit+of+the+IkappaB+kinase+complex.">IKK-gamma is an essential regulatory subunit of the IkappaB kinase complex.</a> Nature. 395 (6699), 297-300 (1998).</li><li>Yamaoka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementation+cloning+of+NEMO,+a+component+of+the+IkappaB+kinase+complex+essential+for+NF-kappaB+activation.">Complementation cloning of NEMO, a component of the IkappaB kinase complex essential for NF-kappaB activation.</a> Cell. 93 (7), 1231-1240 (1998).</li><li>Li, Z. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IKKbeta+subunit+of+IkappaB+kinase+(IKK)+is+essential+for+nuclear+factor+kappaB+activation+and+prevention+of+apoptosis.">The IKKbeta subunit of IkappaB kinase (IKK) is essential for nuclear factor kappaB activation and prevention of apoptosis.</a> J Exp Med. 189 (11), 1839-1845 (1999).</li><li>Hayden, M. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shared+principles+in+NF-kappaB+signaling.">Shared principles in NF-kappaB signaling.</a> Cell. 132 (3), 344-362 (2008).</li><li>Sun, S. C., Chang, J. H., Jin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+nuclear+factor-kappaB+in+autoimmunity.">Regulation of nuclear factor-kappaB in autoimmunity.</a> Trends Immunol. 34 (6), 282-289 (2013).</li><li>Claudio, E., Brown, K., Park, S., Wang, H., Siebenlist, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAFF-induced+NEMO-independent+processing+of+NF-kappa+B2+in+maturing+B+cells.">BAFF-induced NEMO-independent processing of NF-kappa B2 in maturing B cells.</a> Nat Immunol. 3 (10), 958-965 (2002).</li><li>Senftleben, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+by+IKKalpha+of+a+second,+evolutionary+conserved,+NF-kappa+B+signaling+pathway.">Activation by IKKalpha of a second, evolutionary conserved, NF-kappa B signaling pathway.</a> Science. 293 (5534), 1495-1499 (2001).</li><li>Coope, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40+regulates+the+processing+of+NF-kappaB2+p100+to+p52.">CD40 regulates the processing of NF-kappaB2 p100 to p52.</a> EMBO J. 21 (20), 5375-5385 (2002).</li><li>Dejardin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lymphotoxin-beta+receptor+induces+different+patterns+of+gene+expression+via+two+NF-kappaB+pathways.">The lymphotoxin-beta receptor induces different patterns of gene expression via two NF-kappaB pathways.</a> Immunity. 17 (4), 525-535 (2002).</li><li>Xiao, G., Fong, A., Sun, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+p100+processing+by+NF-kappaB-inducing+kinase+involves+docking+IkappaB+kinase+alpha+(IKKalpha)+to+p100+and+IKKalpha-mediated+phosphorylation.">Induction of p100 processing by NF-kappaB-inducing kinase involves docking IkappaB kinase alpha (IKKalpha) to p100 and IKKalpha-mediated phosphorylation.</a> The Journal of biological chemistry. 279 (29), 30099-30105 (2004).</li><li>Xiao, G., Harhaj, E. W., Sun, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB-inducing+kinase+regulates+the+processing+of+NF-kappaB2+p100.">NF-kappaB-inducing kinase regulates the processing of NF-kappaB2 p100.</a> Molecular cell. 7 (2), 401-409 (2001).</li><li>Qing, G., Qu, Z., Xiao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+basally+translated+NF-kappaB-inducing+kinase+(NIK)+protein+functions+as+a+molecular+switch+of+processing+of+NF-kappaB2+p100.">Stabilization of basally translated NF-kappaB-inducing kinase (NIK) protein functions as a molecular switch of processing of NF-kappaB2 p100.</a> J Biol Chem. 280 (49), 40578-40582 (2005).</li><li>Zarnegar, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncanonical+NF-kappaB+activation+requires+coordinated+assembly+of+a+regulatory+complex+of+the+adaptors+cIAP1,+cIAP2,+TRAF2+and+TRAF3+and+the+kinase+NIK.">Noncanonical NF-kappaB activation requires coordinated assembly of a regulatory complex of the adaptors cIAP1, cIAP2, TRAF2 and TRAF3 and the kinase NIK.</a> Nat Immunol. 9 (12), 1371-1378 (2008).</li><li>Vallabhapurapu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonredundant+and+complementary+functions+of+TRAF2+and+TRAF3+in+a+ubiquitination+cascade+that+activates+NIK-dependent+alternative+NF-kappaB+signaling.">Nonredundant and complementary functions of TRAF2 and TRAF3 in a ubiquitination cascade that activates NIK-dependent alternative NF-kappaB signaling.</a> Nat Immunol. 9 (12), 1364-1370 (2008).</li><li>Annunziata, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequent+engagement+of+the+classical+and+alternative+NF-kappaB+pathways+by+diverse+genetic+abnormalities+in+multiple+myeloma.">Frequent engagement of the classical and alternative NF-kappaB pathways by diverse genetic abnormalities in multiple myeloma.</a> Cancer cell. 12 (2), 115-130 (2007).</li><li>Keats, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promiscuous+mutations+activate+the+noncanonical+NF-kappaB+pathway+in+multiple+myeloma.">Promiscuous mutations activate the noncanonical NF-kappaB pathway in multiple myeloma.</a> Cancer cell. 12 (2), 131-144 (2007).</li><li>Staudt, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+activation+of+NF-kappaB.">Oncogenic activation of NF-kappaB.</a> Cold Spring Harbor perspectives in biology. 2 (6), a000109 (2010).</li><li>Polley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structural+basis+for+IkappaB+kinase+2+activation+via+oligomerization-dependent+trans+auto-phosphorylation.">A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation.</a> PLoS Biol. 11 (6), e1001581 (2013).</li><li>Hinz, M., Scheidereit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IkappaB+kinase+complex+in+NF-kappaB+regulation+and+beyond.">The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond.</a> EMBO Rep. 15 (1), 46-61 (2014).</li><li>Scheidereit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IkappaB+kinase+complexes:+gateways+to+NF-kappaB+activation+and+transcription.">IkappaB kinase complexes: gateways to NF-kappaB activation and transcription.</a> Oncogene. 25 (51), 6685-6705 (2006).</li><li>Luckow, V. A., Lee, S. C., Barry, G. F., Olins, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+infectious+recombinant+baculoviruses+by+site-specific+transposon-mediated+insertion+of+foreign+genes+into+a+baculovirus+genome+propagated+in+Escherichia+coli.">Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli.</a> J Virol. 67 (8), 4566-4579 (1993).</li><li>Polley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Basis+for+the+Activation+of+IKK1/alpha.">Structural Basis for the Activation of IKK1/alpha.</a> Cell reports. 17 (8), 1907-1914 (2016).</li><li>Otwinowski, Z. a. M., W, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+X-ray+Diffraction+Data+Collected+in+Oscillation+Mode.">Processing of X-ray Diffraction Data Collected in Oscillation Mode.</a> Methods in Enzymology. 276 (Macromolecular Crystallography, part A), 307-326 (1997).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+human+IkappaB+kinase+beta+asymmetric+dimer.">Crystal structure of a human IkappaB kinase beta asymmetric dimer.</a> J Biol Chem. 288 (31), 22758-22767 (2013).</li><li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+development+of+Coot.">Features and development of Coot.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).</li><li>McCoy, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phaser+crystallographic+software.">Phaser crystallographic software.</a> Journal of applied crystallography. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).</li><li>Vagin, A. T., Teplyakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MOLREP:+an+automated+program+for+molecular+replacement.">MOLREP: an automated program for molecular replacement.</a> J. Appl. Cryst. 30, 1022-1025 (1997).</li><li>Brunger, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Version+1.2+of+the+Crystallography+and+NMR+system.">Version 1.2 of the Crystallography and NMR system.</a> Nature protocols. 2 (11), 2728-2733 (2007).</li><li>Brunger, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallography+&amp;+NMR+system:+A+new+software+suite+for+macromolecular+structure+determination.">Crystallography &amp; NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological. 54 (Pt 5), 905-921 (1998).</li><li>McRee, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XtalView:+a+visual+protein+crystallographic+software+system+for+X11/Xview.">XtalView: a visual protein crystallographic software system for X11/Xview.</a> J. Mol Graph. 10, 44-47 (1992).</li><li>Schroder, G. F., Levitt, M., Brunger, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+biomolecular+crystallography+with+low-resolution+data.">Super-resolution biomolecular crystallography with low-resolution data.</a> Nature. 464 (7292), 1218-1222 (2010).</li><li>Polley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structural+basis+for+IkappaB+kinase+2+activation+via+oligomerization-dependent+trans+auto-phosphorylation.">A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation.</a> PLoS biology. 11 (6), e1001581 (2013).</li><li>Christopher, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+discovery+of+2-amino-3,5-diarylbenzamide+inhibitors+of+IKK-alpha+and+IKK-beta+kinases.">The discovery of 2-amino-3,5-diarylbenzamide inhibitors of IKK-alpha and IKK-beta kinases.</a> Bioorganic &amp; medicinal chemistry letters. 17 (14), 3972-3977 (2007).</li><li>Karplus, P. A., Diederichs, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+crystallographic+model+and+data+quality.">Linking crystallographic model and data quality.</a> Science. 336 (6084), 1030-1033 (2012).</li><li>Chen, V. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MolProbity:+all-atom+structure+validation+for+macromolecular+crystallography.">MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 1), 12-21 (2010).</li></ol>

Produktion, krystallisering og struktur løsning af to relaterede IKK proteiner Vi satte sig for at bestemme X-ray krystalstruktur af IKK1/α med forestillingen om, at det ville være en relativt enkel øvelse givet vores erfaring med IKK2/β protein produktion, krystallisering og struktur beslutsomhed. Men vi var meget overrasket over, at disse to relaterede proteiner opførte sig meget anderledes med hensyn til lethed af krystallisering. Trods indsats fra flere højt profilerede laboratorier tog bes...

Transkriptionel aktiviteter af NF-κB familien af dimerisk transkriptionsfaktorer er påkrævet for forskellige cellulære funktioner lige fra betændelse og immunitet til overlevelse og død. Disse aktiviteter er nøje kontrolleret i celler og et tab af forordning fører til forskellige patologiske tilstande, herunder autoimmune sygdomme og kræft1,2,3. I mangel af en stimulus holdes NF-κB aktiviteter hæmmet af IκB (hæmmer af - κB) proteiner4. Fosforylering af specifikke Ser rester på IκB proteiner markerer dem for ubiquitination og efterfølgende proteasomal nedbrydning eller selektiv behandling5. To meget homologe Ser/Thr kinaser, IKK2/β og IKK1/α, fungere som central regulatorer af NF-κB aktiviteter ved at gennemføre disse fosforylering begivenheder6,7.
Interaktioner mellem en ligand og en receptor transduces et signal gennem en række mæglere fører til aktivering af NF-κB faktorer. NF-κB signal processen kan groft inddeles i to forskellige veje – kanoniske og ikke-kanoniske (alternative)8. Aktiviteten af IKK2/β regulerer primært NF-κB signalering af de kanoniske pathway, som er afgørende for inflammatoriske og medfødte immunrespons9. En særskilt funktion i denne sti er en hurtig og kortvarig aktivering af IKK2/β10 inden for et hidtil biokemisk uncharacterized IKK komplekse — formodes at være sammensat af IKK1 og IKK2, samt en regulerende komponent, NEMO (NF-κB væsentlige Modulator )11,12,13. Mellem de to katalytiske IKK underenheder af IKK kompleks, IKK2 er primært ansvarlig14 for fosforylering af specifikke rester af prototypiske IκBs (α, - β, & -γ) bundet til NF-κB, og også en atypisk IκB protein, NF-κB1/p105, som er en forløberen for NF-κB p50 subunit5. Fosforylering induceret ubiquitination og proteasomal nedbrydning af IκB (eller forarbejdning af p105) fører til frigivelse og aktivering af et bestemt sæt af NF-κB dimerer15. Afvigende NF-κB aktivitet på grund af mis regulerede funktion af IKK2 er blevet observeret i mange kræftformer såvel som i autoimmune sygdomme2,3,16.
I modsætning til IKK2/β regulerer aktiviteten af IKK1/α NF-κB signalering af den ikke-kanoniske pathway, som er afgørende for udvikling og immunitet. IKK1 phosphorylates specifikke rester af NF-κB2/p100 på sine C-terminal IκBδ segment, som fører til forarbejdningen og generation af p52. Dannelsen af transcriptionally aktive p52:RelB heterodimer indleder en langsom og vedvarende reaktion på udviklingsmæssige signaler7,17,18,19,20. Interessant, er generation af den centrale NF-κB faktor p52 af denne vej helt afhængig af en anden faktor, NF-κB inducerende Kinase (NIK)21,22, men ikke på IKK2 eller NEMO. I resting celler stadig NIK lav på grund af sin konstante proteasom-afhængige nedbrydning23,24,25. Ved stimulation af celler af ikke-kanoniske ligander, og i visse maligne celler, NIK bliver stabiliseret for at rekruttere og aktivere IKK1 / α. Kinase aktiviteter både NIK og IKK1 er afgørende for effektiv behandling af p100 i p527. IKK1 og NIK phosphorylate tre serines (Ser866, 870 og 872) af NF-κB2/p100 på sine C-terminal IκBδ segment fører til forarbejdningen og generation af p52. Afvigende aktivering af de ikke-kanoniske pathway har været impliceret i mange maligniteter herunder myelomatose26,27,28.
Flere højeffektive og specifikke hæmmere for IKK2/β er kendt, selv om ingen hidtil har vist sig for at være en effektiv stof. Derimod er IKK1/α-specifikke hæmmere sparsomme. Dette kan dels skyldes vores manglende strukturelle og biokemiske oplysninger om IKK1/α, som begrænser vores forståelse af det mekanistiske grundlaget for aktivering af NF-κB af IKK1 i celler og rationel stof design. X-ray strukturer af IKK2/β forsynet os med indblik i aktivering mekanisme i IKK2/β29; men disse strukturer kan ikke afsløre hvordan forskellige opstrøms stimuli udløser aktivering af IKK1/α eller IKK2/β at regulere forskellige sæt af NF-κB aktiviteter 30,31. At forstå den mekanistiske grundlag bag de forskellige signalsystemer funktion af IKK1/α, og at etablere en platform for rationel drug design, fokuseret vi på at bestemme strukturen af IKK1/α.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cellfectin/Cellfectin II</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10362100</td>
			<td>Cellfectin is now discontinued, replaced by Cellfectin II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf900 III Insect cell medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12658-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SF9 cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12659017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-IKK1 antibody</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB100-56704</td>
			<td>Previously sold by Imgenex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PentaHis antibody</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>34460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>Nitrocellulose can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford assay reagent</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>500001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28989335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon concentrator</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC801008, UFC803008, UFC201024, UFC203024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound A</td>
			<td>Bayer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calbiochem IKK-inhibitor XII</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>401491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staurosporine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>S4400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLN120B</td>
			<td>Millenium</td>
			<td>Gift item</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPPNP</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A2647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulfate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>51227, 42867, 31404,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulfate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>93593, 81210, 88276, 95904, 81255, 89510, 92897, 81285, 95172</td>
			<td>Some of them are new Cat # on SIGMA catalogue. What we had was originally from Fluka that had different Cat #.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystallization Screens</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Screen I and II (Crystal Screen HT)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index HT</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG/Ion and PEG/Ion2 (PEG/Ion HT)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEGRX 1 and PEGRx 2 (PEGRx HT)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SaltRx 1 and SaltRx 2 (SaltRx HT)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal mounts</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR8-188, 190, 192, 194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synchrotron</td>
			<td>The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy&#8217;s Argonne National Laboratory</td>
			<td>Beamline 19 ID</td>
			<td>The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy&#8217;s Argonne National Laboratory provides ultra-bright, high-energy storage ring-generated X-ray beams for research in almost all scientific disciplines.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a guide to production, crystallization, and structure determination of human ikk1/&#945;

En klasse af ekstracellulære stimuli kræver aktivering af IKK1/α at fremkalde generation af en NF-κB subunit, p52, gennem behandlingen af sin forløber p100. P52 fungerer som en homodimer eller heterodimer med en anden NF-κB subunit, RelB. Disse dimerer regulere igen udtryk for hundredvis af gener involveret i inflammation, celle overlevelse og celle cyklus. IKK1/α forbliver primært tilknyttet IKK2/β og NEMO som en ternær kompleks. En lille pulje af det ses også som en lavmolekylære complex(es). Det er uvist, om p100 behandlingsaktivitet udløses ved aktivering af IKK1/α inden for den større eller mindre komplekse poolen. Konstituerende aktivitet af IKK1/α er blevet opdaget i flere kræftformer og inflammatoriske sygdomme. For at forstå mekanismen for aktivering af IKK1/α, og aktivere dets anvendelse som en drug target, vi udtrykt rekombinante IKK1/α i forskellige værtssystemer, såsom E. coli, insekt, og pattedyrsceller. Det lykkedes os at give udtryk for opløselige IKK1/α i baculovirus inficeret insekt celler, at opnå mg mængder af meget ren protein, krystalliserede det i overværelse af hæmmere, og fastlægge dens X-ray krystalstruktur. Her beskriver vi de detaljerede trin til at producere det rekombinante protein, dets krystallisation og dens X-ray Krystalstrukturbestemmelse.

Kloning og udtryk for forskellige konstruktioner af IKK1/α Fuld længde menneskelige IKK1/α er klonet i baculovirus udtryk vektor pFastBacHTa inden for dens EcoRI og opdag begrænsning steder at få en N-terminale hexa-histidin markeret IKK1. Tag kunne fjernes ved TEV protease fordøjelsen. Da fuld længde IKK1/α indeholder fleksible regioner i begge ender, og fleksible regioner normalt gøre et protein vanskeligt at krystallisere, klonet vi forskellige afkortet fra...

Watch this Scientific Journal Video about A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/ÃŽÂ± at JoVE.com

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

IκB Kinase 1/α (IKK1/α CHUK) er en Ser/Thr protein kinase, der er involveret i et utal af cellulære aktiviteter primært gennem aktivering af NF-κB transkriptionsfaktorer. Her beskriver vi de vigtigste trin er nødvendige for produktionen og Krystalstrukturbestemmelse af dette protein.

En Guide til produktion, krystallisering og struktur bestemmelse af menneskelige IKK1/α

A class of extracellular stimuli requires activation of IKK1/&#945; to induce generation of an NF-&#954;B subunit, p52, through processing of its ...

Målet med denne procedure er at vejlede til produktion, krystallisering og strukturel bestemmelse af human iKK1-alpha for at forstå det mekanistiske grundlag for dens signalfunktion og etablere platforme for rationelt lægemiddeldesign. Denne metode bør hjælpe forskerne med at bestemme strukturen af IKK1, hvilket ville give svar på centrale forespørgsler inden for immunsignalering. Denne teknik beskriver en strømlinet vej til at opnå krystaller af IKK proteiner, som er temmelig ildfaste til krystallisering og til at give forskellige kritiske oplysninger i at overvinde flaskehalse i fastsættelsen af strukturer.Generelt, individer nye til denne metode vil kæmpe, fordi generere milligram mængder af opløselige, velopdragen protein, kræver sit udtryk i insektceller, og krystallisering kan gøres under kun en meget smal vindue af betingelser. Den molekylære udskiftningsprocedure, der anvendes til bestemmelse af strukturen af IKK1, kan også være meget vanskelig, især på grund af krystallernes dårlige afbøjningsgenskab, ikke på det sted, hvor den asymmetriske enhed indeholder mange IKK1-molekyler, ikke findes i passende søgemodeller. Demonstrere procedurerne vil være Kyle Shumate og Sonjiala Hotchkiss, studerende fra mit laboratorium.På dag ét, plade Sf9 celler i to milliliter sf903 insekt celle medium, i hver brønd af en seks-brønd plade og inkubere ved 27 grader Celsius. Passage cellerne, når de når en tæthed på to til tre gange 10 til de seks celler pr. milliliter i suspension ved at fortynde det til friske medier, med en tæthed på ca. seks gange 10 til de fem. På dag to fortyndes otte mikroliter af Sf9 transfektion reagens i 100 mikroliter SF-903 eller Grace's Insect Medium.Så vortex blandingen kort. I et separat rør fortyndes et mikrogram kitrenseret rekombinant bacmid i 100 mikroliter af samme medium. Kombiner det fortyndede DNA og transinfektions reagens.Efter inkubering ved stuetemperatur i 15 til 30 minutter, skal du fjerne mediet fra brønden. Derefter tilsættes en milliliter frisk medium. Dernæst tilsættes den fortyndede DNA transfektion reagens blanding dropwise på cellerne, justere dråbestørrelsen, således at det ikke løsner klæbende celler.Efter seks timer tilsættes 1,5 milliliter frisk medium oven på cellerne. Inkuber cellerne ved 27 grader Celsius, kontrollere brønde regelmæssigt hver 12 timer for tegn på virusinfektion. På dag fem, fjerne mediet indeholder celler, 60 til 72 timer efter infektion.Efter overførsel af mediet i rør, centrifuge i fem minutter ved 500 gange g og fire grader Celsius. Når du er færdig, gemme supernatant, som er P1 virus stak. På dag et, resuspend den tidligere forberedte His-IKK1 celle pellet i 40 milliliter lysis buffer.Cellernesuspension på is og lyser cellerne ved sonikering ved 60% til 70% arbejdscyklusser og fem til 10 impulser af 30 sekunders varighed med et interval på over et minut. Afklare lysatet ved centrifugering ved større end eller lig med 28,000 g i 45 minutter ved fire grader Celsius. Efter at have forberedt en Nikkel-NTA Agarose harpiks, ifølge tekstprotokollen, eluter his-mærkede IKK1 alfa protein under tyngdekraften flow ved hjælp af 20 milliliter eluering buffer.Saml en til 1,5 milliliter fraktioner. Efter at kombinere de fraktioner, der indeholder proteinet, fordøje prøven med TEV protease natten over ved fire grader Celsius. Om morgenen på dag to inkuberes proteinet med en millimolar ATP ved tilstedeværelse af magnesiumchlorid, beta-glycerophosphat, natriumfluorid og natriumortovanadat i en time ved 27 grader Celsius.Efter inkubationen filtreres proteinopløsningen gennem et 0,45 mikronfilter. Derefter indlæst ca. seks milliliter af prøven på en 120 milliliter præparativ størrelsesudelukkende kolonne, der er fastgjort til et automatiseret væskekromatografisystem. Efter ækvilibrering køres størrelsesudelukkekromatografien med en strømningshastighed på 1 milliliter pr. minut, og der opsamres to milliliterfraktioner.Under kørslen overvåges eluering ved 280 og 254 nanometer. Efter træk i de rene fraktioner, koncentrat i en 30-kilodalton, molekylvægt cut-off centrifugalkoncentrator, efter fabrikantens anvisninger. Derefter dispenseres 25-mikroliter aliquots af det koncentrerede protein og flash-fryse i flydende nitrogen.Ved hjælp af en robot, pipette 80 til 100 mikroliter af en krystallisering reagens i reservoiret af en 96-brønd plade. Ved hjælp af en krystalliseringsrobot skal der dispenseres og blandes 0,2 til 0,25 mikroliter af IKK1 og dets inhibitorkompleks med samme mængde reservoiropløsning. Umiddelbart efter indstilling af dråber, forsegle hver plade med optisk klare film for at undgå fordampning.Inkuber en plade ved 18 grader Celsius og den anden plade ved fire grader Celsius i et koldt rum. Brug et stereomikroskop med en polarisator til at kontrollere for udseendet af krystal i hver dråbe, hver dag, for de første syv dage og derefter med længere mellemrum. Efter klargøring af IKK1 og dets inhibitorkompleks som tidligere beskrevet, skal brøndopløsningerne overføres til hver brønd på en 24-brøndplade.Placer en til 1,5 mikroliter af brøndopløsning på en ren glasdækslæb. Tilsæt et tilsvarende volumen af IKK1 og dets inhibitor kompleks til glasset coverslip og bland forsigtigt ved pipettering op og ned tre til fire gange. Når du har påføring af fedt på ringene i hver brønd på pladen, skal du dreje glasdækslen over og placere den på den respektive brønd med snævler.Derefter forsegle godt ved at trykke ned på glasset coverslip. Efter opsætning af alle dråberne i 24-brøndpladen, inkuberes i det kolde rum, i mørke. Lejlighedsvis kontrollere dråber under et mikroskop for udseende og vækst af krystaller.Når krystalvæksten er færdig, skal du forsigtigt fjerne glasdækslæbet, der indeholder krystallen, og placere den på en fast overflade med krystalfaldet opad. Tilsæt forsigtigt 10 mikroliter kryo En opløsning oven på dråben og bland forsigtigt ved pipettering, så krystallen ikke berøres. Ved hjælp af et mikroskop, langsomt fjerne nogle væske fra krystal og holde omkring fem til otte mikroliter af opløsningen.Tilsæt forsigtigt 2,5 til fire mikroliter kryo B-opløsning på dråben og bland forsigtigt ved pipettering. Dæk glasdækslet med en lille Petrie skål for at undgå direkte luftstrøm over krystallen. Efter at have ventet fem minutter, omhyggeligt vælge en enkelt krystal fra dråben i en passende cryoloop monteret på en ordentlig base.Flash-fryse krystal i flydende nitrogen. Opbevar derefter krystalbydende kryoloop i en puck nedsænket i flydende nitrogen i en Dewar-kolbe, indtil den er klar til røntgendiffraktion ved synkrotronen. Efter omfattende forsøg med flere forskellige IKK1-varianter blev krystaller opnået med en afkortet konstruktion, som kun viste egnede røntgenegenskaber ved tilstedeværelse af IKK-hæmmeren XII.Den kombinerede effekt af røntgendata med lav opløsning med svage intensiteter, et stort antal IKK1-molekyler i den asymmetriske enhed og konformationsvariationen af IKK1 monomerisk-dimeric-modellen sammenlignet med kendte IKK2-modeller, gjorde det vanskeligt at opnå en molekylær udskiftningsopløsning, IKK1, og bestemme dens struktur. Forskellige IKK2-strukturer angav forskellige intermonmerorienter inden for dympningerne, således at afstanden mellem P578's alfakulfiber i de to kinasedomæner i fire forskellige dimermodeller varierede mellem 39 og 61 angstroms. Det var muligt at opnå en nyttig søgemodel på grund af kryoelektronkortet med lav opløsning og en model med høj nøjagtighed af IKK1-domæner, der kunne genereres på grundlag af en IKK2-struktur med høj opløsning.Den oprindelige model viste en orientering af kinase domæne roteret 24 grader i forhold til en IKK2 monomer og en N-terminal åbning af 58 angstroms. Ved hjælp af en af dimers med 52-angstrom åbning som model, seks dimers i den asymmetriske enhed var placeret. Når mestrer, kan denne teknik udføres i et par måneder, hvis det udføres korrekt.Mens du forsøger denne procedure, Er det vigtigt at huske, at opnåelse af en opløselig, aktiv og velopdragen protein er det første kritiske skridt. Efter at have set denne video, bør du have en god generel forståelse af alle de skridt, der skal følges i omhyggelige detaljer, at få succes i krystallisering og bestemmelse af strukturen af IKK1 protein. Læring denne procedure, er der stadig strukturer af andre IKK familie proteiner, der også kan bestemmes for at besvare yderligere spørgsmål om kinase-mitogen signalering.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/&#945;

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Termostabilisering, Expression, Rensning, og Krystallisation af Human Serotonin Transporter Bundet til<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Combining Wet and Dry Lab Techniques to Guide the Crystallization of Large Coiled-coil Containing Proteins

Kombinere våd og tør Lab Techniques Guide krystallisering af store coiled-coil indeholdende proteiner

Obtaining crystals for structure determination can be a difficult and time consuming proposition for any protein. Coiled-coil proteins and domains are ...

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Produktion, krystallisation og struktur Bestemmelse af<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-1 via mikropodning og Zink-SAD

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

High Precision FRET på enkeltmolekyliveau for biomolekylstrukturbestemmelse

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO

Produktion, krystallisering og struktur bestemmelse af IKK-bindings domænet NEMO

NEMO is a scaffolding protein which plays an essential role in the NF-&#954;B pathway by assembling the IKK-complex with the kinases IKK&#945; and ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

Krystallisering og strukturel bestemmelse af et enzym:Substratkompleks ved seriel krystallografi i en alsidig mikrofluidisk chip

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

The Extraction of Liver Glycogen Molecules for Glycogen Structure Determination

Liver glycogen is a hyperbranched glucose polymer that is involved in the maintenance of blood sugar levels in animals. The properties of glycogen are ...

Efficient and Scalable Production of Full-length Human Huntingtin Variants in Mammalian Cells using a Transient Expression System

Full-length huntingtin (FL HTT) is a large (aa 1-3,144), ubiquitously expressed, polyglutamine (polyQ)-containing protein with a mass of approximately 350 ...

High-Throughput Screening for Protein Crystallization

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography (Video) | JoVE 

High-throughput screening for at opnå krystal hits til proteinkrystallografi

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into ...

A Fibrinolytic Enzyme-Based Method to Study Cerebral Thrombus Cell Components

A Comprehensive Approach to Analyze the Cell Components of Cerebral Blood Clots

A Novel Method for Comprehensive Cell Component Analysis of Cerebral Blood Clots (Video) | JoVE

En omfattende tilgang til analyse af cellekomponenterne i cerebrale blodpropper

Cerebral thrombosis, a blood clot in a cerebral artery or vein, is the most common type of cerebral infarction. The study of the cell components of ...