Name: a guide to production, crystallization, and structure determination of human ikk1/&#945;
Uploaded: 2018-11-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/ÃŽÂ± at JoVE.com

Wij danken het personeel van de straallijnen 19ID, 24ID en 13ID bij de geavanceerde Photon bron, Lemont, IL, voor ondersteuning tijdens het verzamelen van de gegevens op verschillende kristallen. Wij zijn dankbaar aan Dmitry Lyumkis, Salk Instituut voor het ophalen van de lage resolutie cryo-EM kaart in vroege stadia van EM kaart/modelbouw, die werd gebruikt om de eerste IKK1 moleculaire vervanging zoeken model te bouwen. Het onderzoek leidt tot deze resultaten heeft financiering ontvangen van NIH grants AI064326, CA141722 en GM071862 naar GG. SP is momenteel een Wellcome Trust DBT India tussenliggende Fellow.

1. bereiding van recombinante Virus geschikt voor grootschalige uitdrukking van IKK1/α
<ol><li>
P1 virus voorbereiding 32<ol>
<li>Dag 1: Plaat Sf9 cellen (~ 6 X 105) (passage nummer minder dan 10) in 2 mL van Sf900 III insect cel medium in elk goed voor een 6-well-plate en Incubeer bij 27 ° C. Passage van cellen wanneer ze een bevolkingsdichtheid van 2 tot 3 X 106 cellen per mL in suspensie bereiken door verder verdunnen in verse media bij een dichtheid v...

<ol>
	<li>Xia, Y., Shen, S., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB,+an+active+player+in+human+cancers.">NF-kappaB, an active player in human cancers.</a> Cancer immunology research. 2 (9), 823-830 (2014).</li><li>Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity,+inflammation,+and+cancer.">Immunity, inflammation, and cancer.</a> Cell. 140 (6), 883-899 (2010).</li><li>Ben-Neriah, Y., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+meets+cancer,+with+NF-kappaB+as+the+matchmaker.">Inflammation meets cancer, with NF-kappaB as the matchmaker.</a> Nature immunology. 12 (8), 715-723 (2011).</li><li>Hinz, M., Scheidereit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IkappaB+kinase+complex+in+NF-kappaB+regulation+and+beyond.">The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond.</a> EMBO reports. 15 (1), 46-61 (2014).</li><li>Karin, M., Ben-Neriah, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+meets+ubiquitination:+the+control+of+NF-[kappa]B+activity.">Phosphorylation meets ubiquitination: the control of NF-[kappa]B activity.</a> Annu Rev Immunol. 18, 621-663 (2000).</li><li>Ghosh, S., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Missing+pieces+in+the+NF-kappaB+puzzle.">Missing pieces in the NF-kappaB puzzle.</a> Cell. 109, S81-S96 (2002).</li><li>Sun, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+noncanonical+NF-kappaB+pathway.">The noncanonical NF-kappaB pathway.</a> Immunol Rev. 246 (1), 125-140 (2012).</li><li>Bonizzi, G., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+NF-kappaB+activation+pathways+and+their+role+in+innate+and+adaptive+immunity.">The two NF-kappaB activation pathways and their role in innate and adaptive immunity.</a> Trends Immunol. 25 (6), 280-288 (2004).</li><li>DiDonato, J. A., Hayakawa, M., Rothwarf, D. M., Zandi, E., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cytokine-responsive+IkappaB+kinase+that+activates+the+transcription+factor+NF-kappaB.">A cytokine-responsive IkappaB kinase that activates the transcription factor NF-kappaB.</a> Nature. 388 (6642), 548-554 (1997).</li><li>Werner, S. L., Barken, D., Hoffmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulus+specificity+of+gene+expression+programs+determined+by+temporal+control+of+IKK+activity.">Stimulus specificity of gene expression programs determined by temporal control of IKK activity.</a> Science. 309 (5742), 1857-1861 (2005).</li><li>Zandi, E., Rothwarf, D. M., Delhase, M., Hayakawa, M., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IkappaB+kinase+complex+(IKK)+contains+two+kinase+subunits,+IKKalpha+and+IKKbeta,+necessary+for+IkappaB+phosphorylation+and+NF-kappaB+activation.">The IkappaB kinase complex (IKK) contains two kinase subunits, IKKalpha and IKKbeta, necessary for IkappaB phosphorylation and NF-kappaB activation.</a> Cell. 91 (2), 243-252 (1997).</li><li>Rothwarf, D. M., Zandi, E., Natoli, G., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IKK-gamma+is+an+essential+regulatory+subunit+of+the+IkappaB+kinase+complex.">IKK-gamma is an essential regulatory subunit of the IkappaB kinase complex.</a> Nature. 395 (6699), 297-300 (1998).</li><li>Yamaoka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementation+cloning+of+NEMO,+a+component+of+the+IkappaB+kinase+complex+essential+for+NF-kappaB+activation.">Complementation cloning of NEMO, a component of the IkappaB kinase complex essential for NF-kappaB activation.</a> Cell. 93 (7), 1231-1240 (1998).</li><li>Li, Z. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IKKbeta+subunit+of+IkappaB+kinase+(IKK)+is+essential+for+nuclear+factor+kappaB+activation+and+prevention+of+apoptosis.">The IKKbeta subunit of IkappaB kinase (IKK) is essential for nuclear factor kappaB activation and prevention of apoptosis.</a> J Exp Med. 189 (11), 1839-1845 (1999).</li><li>Hayden, M. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shared+principles+in+NF-kappaB+signaling.">Shared principles in NF-kappaB signaling.</a> Cell. 132 (3), 344-362 (2008).</li><li>Sun, S. C., Chang, J. H., Jin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+nuclear+factor-kappaB+in+autoimmunity.">Regulation of nuclear factor-kappaB in autoimmunity.</a> Trends Immunol. 34 (6), 282-289 (2013).</li><li>Claudio, E., Brown, K., Park, S., Wang, H., Siebenlist, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAFF-induced+NEMO-independent+processing+of+NF-kappa+B2+in+maturing+B+cells.">BAFF-induced NEMO-independent processing of NF-kappa B2 in maturing B cells.</a> Nat Immunol. 3 (10), 958-965 (2002).</li><li>Senftleben, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+by+IKKalpha+of+a+second,+evolutionary+conserved,+NF-kappa+B+signaling+pathway.">Activation by IKKalpha of a second, evolutionary conserved, NF-kappa B signaling pathway.</a> Science. 293 (5534), 1495-1499 (2001).</li><li>Coope, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40+regulates+the+processing+of+NF-kappaB2+p100+to+p52.">CD40 regulates the processing of NF-kappaB2 p100 to p52.</a> EMBO J. 21 (20), 5375-5385 (2002).</li><li>Dejardin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lymphotoxin-beta+receptor+induces+different+patterns+of+gene+expression+via+two+NF-kappaB+pathways.">The lymphotoxin-beta receptor induces different patterns of gene expression via two NF-kappaB pathways.</a> Immunity. 17 (4), 525-535 (2002).</li><li>Xiao, G., Fong, A., Sun, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+p100+processing+by+NF-kappaB-inducing+kinase+involves+docking+IkappaB+kinase+alpha+(IKKalpha)+to+p100+and+IKKalpha-mediated+phosphorylation.">Induction of p100 processing by NF-kappaB-inducing kinase involves docking IkappaB kinase alpha (IKKalpha) to p100 and IKKalpha-mediated phosphorylation.</a> The Journal of biological chemistry. 279 (29), 30099-30105 (2004).</li><li>Xiao, G., Harhaj, E. W., Sun, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB-inducing+kinase+regulates+the+processing+of+NF-kappaB2+p100.">NF-kappaB-inducing kinase regulates the processing of NF-kappaB2 p100.</a> Molecular cell. 7 (2), 401-409 (2001).</li><li>Qing, G., Qu, Z., Xiao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+basally+translated+NF-kappaB-inducing+kinase+(NIK)+protein+functions+as+a+molecular+switch+of+processing+of+NF-kappaB2+p100.">Stabilization of basally translated NF-kappaB-inducing kinase (NIK) protein functions as a molecular switch of processing of NF-kappaB2 p100.</a> J Biol Chem. 280 (49), 40578-40582 (2005).</li><li>Zarnegar, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncanonical+NF-kappaB+activation+requires+coordinated+assembly+of+a+regulatory+complex+of+the+adaptors+cIAP1,+cIAP2,+TRAF2+and+TRAF3+and+the+kinase+NIK.">Noncanonical NF-kappaB activation requires coordinated assembly of a regulatory complex of the adaptors cIAP1, cIAP2, TRAF2 and TRAF3 and the kinase NIK.</a> Nat Immunol. 9 (12), 1371-1378 (2008).</li><li>Vallabhapurapu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonredundant+and+complementary+functions+of+TRAF2+and+TRAF3+in+a+ubiquitination+cascade+that+activates+NIK-dependent+alternative+NF-kappaB+signaling.">Nonredundant and complementary functions of TRAF2 and TRAF3 in a ubiquitination cascade that activates NIK-dependent alternative NF-kappaB signaling.</a> Nat Immunol. 9 (12), 1364-1370 (2008).</li><li>Annunziata, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequent+engagement+of+the+classical+and+alternative+NF-kappaB+pathways+by+diverse+genetic+abnormalities+in+multiple+myeloma.">Frequent engagement of the classical and alternative NF-kappaB pathways by diverse genetic abnormalities in multiple myeloma.</a> Cancer cell. 12 (2), 115-130 (2007).</li><li>Keats, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promiscuous+mutations+activate+the+noncanonical+NF-kappaB+pathway+in+multiple+myeloma.">Promiscuous mutations activate the noncanonical NF-kappaB pathway in multiple myeloma.</a> Cancer cell. 12 (2), 131-144 (2007).</li><li>Staudt, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+activation+of+NF-kappaB.">Oncogenic activation of NF-kappaB.</a> Cold Spring Harbor perspectives in biology. 2 (6), a000109 (2010).</li><li>Polley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structural+basis+for+IkappaB+kinase+2+activation+via+oligomerization-dependent+trans+auto-phosphorylation.">A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation.</a> PLoS Biol. 11 (6), e1001581 (2013).</li><li>Hinz, M., Scheidereit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IkappaB+kinase+complex+in+NF-kappaB+regulation+and+beyond.">The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond.</a> EMBO Rep. 15 (1), 46-61 (2014).</li><li>Scheidereit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IkappaB+kinase+complexes:+gateways+to+NF-kappaB+activation+and+transcription.">IkappaB kinase complexes: gateways to NF-kappaB activation and transcription.</a> Oncogene. 25 (51), 6685-6705 (2006).</li><li>Luckow, V. A., Lee, S. C., Barry, G. F., Olins, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+infectious+recombinant+baculoviruses+by+site-specific+transposon-mediated+insertion+of+foreign+genes+into+a+baculovirus+genome+propagated+in+Escherichia+coli.">Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli.</a> J Virol. 67 (8), 4566-4579 (1993).</li><li>Polley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Basis+for+the+Activation+of+IKK1/alpha.">Structural Basis for the Activation of IKK1/alpha.</a> Cell reports. 17 (8), 1907-1914 (2016).</li><li>Otwinowski, Z. a. M., W, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+X-ray+Diffraction+Data+Collected+in+Oscillation+Mode.">Processing of X-ray Diffraction Data Collected in Oscillation Mode.</a> Methods in Enzymology. 276 (Macromolecular Crystallography, part A), 307-326 (1997).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+human+IkappaB+kinase+beta+asymmetric+dimer.">Crystal structure of a human IkappaB kinase beta asymmetric dimer.</a> J Biol Chem. 288 (31), 22758-22767 (2013).</li><li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+development+of+Coot.">Features and development of Coot.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).</li><li>McCoy, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phaser+crystallographic+software.">Phaser crystallographic software.</a> Journal of applied crystallography. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).</li><li>Vagin, A. T., Teplyakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MOLREP:+an+automated+program+for+molecular+replacement.">MOLREP: an automated program for molecular replacement.</a> J. Appl. Cryst. 30, 1022-1025 (1997).</li><li>Brunger, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Version+1.2+of+the+Crystallography+and+NMR+system.">Version 1.2 of the Crystallography and NMR system.</a> Nature protocols. 2 (11), 2728-2733 (2007).</li><li>Brunger, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallography+&amp;+NMR+system:+A+new+software+suite+for+macromolecular+structure+determination.">Crystallography &amp; NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological. 54 (Pt 5), 905-921 (1998).</li><li>McRee, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XtalView:+a+visual+protein+crystallographic+software+system+for+X11/Xview.">XtalView: a visual protein crystallographic software system for X11/Xview.</a> J. Mol Graph. 10, 44-47 (1992).</li><li>Schroder, G. F., Levitt, M., Brunger, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+biomolecular+crystallography+with+low-resolution+data.">Super-resolution biomolecular crystallography with low-resolution data.</a> Nature. 464 (7292), 1218-1222 (2010).</li><li>Polley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structural+basis+for+IkappaB+kinase+2+activation+via+oligomerization-dependent+trans+auto-phosphorylation.">A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation.</a> PLoS biology. 11 (6), e1001581 (2013).</li><li>Christopher, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+discovery+of+2-amino-3,5-diarylbenzamide+inhibitors+of+IKK-alpha+and+IKK-beta+kinases.">The discovery of 2-amino-3,5-diarylbenzamide inhibitors of IKK-alpha and IKK-beta kinases.</a> Bioorganic &amp; medicinal chemistry letters. 17 (14), 3972-3977 (2007).</li><li>Karplus, P. A., Diederichs, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+crystallographic+model+and+data+quality.">Linking crystallographic model and data quality.</a> Science. 336 (6084), 1030-1033 (2012).</li><li>Chen, V. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MolProbity:+all-atom+structure+validation+for+macromolecular+crystallography.">MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 1), 12-21 (2010).</li></ol>

Productie, kristallisatie en structuur oplossing van twee verwante IKK eiwitten We bepalen de X-ray kristalstructuur van IKK1/α met de gedachte dat het een relatief eenvoudige oefening gezien onze ervaring met IKK2/β eiwitproductie, kristallisatie en structuurbepaling zou zijn uiteengezet. Maar waren we zeer verrast dat deze twee verwante proteïnen heel anders met betrekking tot het gemak van kristallisatie gedragen. Ondanks pogingen van verschillende spraakmakende laboratoria nam de bepaling van d...

Transcriptionele activiteiten van de NF-recombination familie van dimeric transcriptiefactoren zijn vereist voor diverse cellulaire functies variërend van ontsteking en immuniteit tot overleving en dood. Deze activiteiten worden strikt gecontroleerd in cellen en een verlies van verordening leidt tot verscheidene pathologische condities, zoals auto-immune aandoeningen en kanker1,2,3. Bij het ontbreken van een stimulans, worden de activiteiten van NF-recombination geremde IκB (remmer van - recombination) eiwitten4bewaard. De fosforylatie van specifieke Ser residuen op IκB eiwitten markeert ze voor ubiquitination en aantasting van de latere remmen of selectieve verwerking5. Twee zeer homologe Ser/Thr kinases, IKK2/β en IKK1/α, fungeren als centrale regulatoren van NF-recombination activiteiten door het uitvoeren van deze fosforylatie gebeurtenissen6,7.
Interacties tussen een ligand en een receptor transduces een signaal door een reeks van bemiddelaars die leiden tot de activering van NF-recombination factoren. De NF-recombination seingeving proces kan globaal worden ingedeeld in twee afzonderlijke trajecten-canonieke en niet-canonieke (alternatieve)8. De activiteit van IKK2/β regelt voornamelijk de NF-recombination signalering van het canonieke leertraject dat essentieel is voor inflammatoire en aangeboren immuunresponsen9. Een duidelijk kenmerk van dit traject is een snelle en kortstondige activering van IKK2/β10 binnen een tot nu toe biochemically genfunctieonderzoek IKK complexe — geacht te worden samengesteld uit IKK1 en IKK2, evenals een regelgevende component, NEMO (NF-recombination essentiële Modulator )11,12,13. Tussen de twee katalytische IKK subeenheden van het complex IKK, IKK2 is voornamelijk verantwoordelijk14 voor de fosforylatie van bepaalde residuen van prototypische IκBs (α en -β, γ-) gebonden aan NF-recombination, en ook een atypische IκB eiwit, NF-κB1/p105, die een voorloper van de NF-recombination p50 subeenheid5. Fosforylering geïnduceerde ubiquitination en remmen de afbraak van IκB (of verwerking van p105) leidt tot de release en de activering van een bepaalde set van NF-recombination Dimeren15. Aberrant NF-recombination activiteit als gevolg van verkeerd gereglementeerde functie van IKK2 heeft waargenomen bij veel kankers zo goed zoals auto-immune aandoeningen2,3,16.
In tegenstelling tot IKK2/β regelt de activiteit van IKK1/α NF-recombination signalering van de niet-canonieke pathway, die essentieel is voor ontwikkeling en immuniteit. IKK1 kinaseenzym specifieke residuen van NF-κB2/p100 op haar C-terminal IκBδ-segment, wat tot de verwerking en de generatie van p52 leidt. De vorming van transcriptionally actieve p52:RelB heterodimer initieert een langzaam en duurzaam antwoord op ontwikkelingsstoornissen signalen7,17,18,19,20. Interessant, is de generatie van de centrale NF-recombination factor p52 van dit traject kritisch afhankelijk van een andere factor, NF-recombination inducerende Kinase (NIK)21,22, maar niet op IKK2 of NEMO. In rustende cellen blijft het niveau van NIK laag vanwege haar constante proteasoom-afhankelijke degradatie23,24,25. Bij stimulatie van cellen door 'niet-canonieke' liganden, en in bepaalde kwaadaardige cellen, NIK wordt gestabiliseerd te werven en te activeren IKK1 / α. Kinase activiteiten van zowel de IKK1 als de NIK zijn essentieel voor een efficiënte verwerking van p100 in p527. IKK1 en NIK phosphorylate drie serines (Ser866, 870 en 872) van NF-κB2/p100 op zijn segment van de C-terminal IκBδ wat leidt tot de verwerking en de generatie van p52. Aberrant activering van de niet-canonieke pathway heeft betrokken bij vele maligniteiten waaronder multiple myeloma26,27,28.
Verscheidene zeer efficiënte en specifieke remmers voor IKK2/β zijn bekend, hoewel niemand tot nu toe hebben bleek te zijn een effectieve drug. In tegenstelling, zijn IKK1/α-specifieke remmers schaars. Dit kan het gevolg zijn deels van ons gebrek aan structurele en biochemische informatieover IKK1/α, waardoor ons begrip van de mechanistische basis van activering van NF-recombination door IKK1 in cellen, en rationele drug design wordt beperkt. De X-ray structuren van IKK2/β voorzien ons van inzichten in het mechanisme van de activering van IKK2/β29; echter, deze structuren niet kon onthullen hoe verschillende upstream prikkels activeren activering van IKK1/α of IKK2/β voor het regelen van verschillende sets van NF-recombination activiteiten 30,31. Om te begrijpen de mechanistische basis ten grondslag liggen aan de duidelijke signaalfunctie van IKK1/α, en om een platform voor rationele drug design, we gericht op het bepalen van de structuur van IKK1/α.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cellfectin/Cellfectin II</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10362100</td>
			<td>Cellfectin is now discontinued, replaced by Cellfectin II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf900 III Insect cell medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12658-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SF9 cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12659017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-IKK1 antibody</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB100-56704</td>
			<td>Previously sold by Imgenex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PentaHis antibody</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>34460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>Nitrocellulose can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford assay reagent</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>500001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28989335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon concentrator</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC801008, UFC803008, UFC201024, UFC203024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound A</td>
			<td>Bayer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calbiochem IKK-inhibitor XII</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>401491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staurosporine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>S4400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLN120B</td>
			<td>Millenium</td>
			<td>Gift item</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPPNP</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A2647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulfate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>51227, 42867, 31404,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulfate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>93593, 81210, 88276, 95904, 81255, 89510, 92897, 81285, 95172</td>
			<td>Some of them are new Cat # on SIGMA catalogue. What we had was originally from Fluka that had different Cat #.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystallization Screens</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Screen I and II (Crystal Screen HT)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index HT</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG/Ion and PEG/Ion2 (PEG/Ion HT)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEGRX 1 and PEGRx 2 (PEGRx HT)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SaltRx 1 and SaltRx 2 (SaltRx HT)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal mounts</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR8-188, 190, 192, 194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synchrotron</td>
			<td>The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy&#8217;s Argonne National Laboratory</td>
			<td>Beamline 19 ID</td>
			<td>The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy&#8217;s Argonne National Laboratory provides ultra-bright, high-energy storage ring-generated X-ray beams for research in almost all scientific disciplines.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a guide to production, crystallization, and structure determination of human ikk1/&#945;

Een klasse van extracellulaire stimuli vereist activering van IKK1/α voor het opwekken van de generatie van een NF-recombination subeenheid, p52, door verwerking van haar voorloper p100. P52 fungeert als een homodimer of heterodimer met een ander NF-recombination subeenheid, RelB. Deze Dimeren reguleren op hun beurt de expressie van genen die betrokken zijn bij ontsteking, overleving van de cel en celcyclus honderden. IKK1/α blijft voornamelijk geassocieerd met IKK2/β en NEMO als een ternaire complex. Een klein zwembad voor het wordt echter ook als een laag molecuulgewicht complex(es) waargenomen. Het is onbekend of de p100 verwerking activiteit wordt geactiveerd door activering van IKK1/α binnen het grotere of het kleinere complex zwembad. Constitutieve activiteit van IKK1/α is geconstateerd in de verschillende vormen van kanker en ontstekingsziekten. Om te begrijpen van het mechanisme van activering van IKK1/α en het gebruik ervan als een drug target inschakelt, we recombinante IKK1/α uitgedrukt in verschillende hostsystemen, zoals E. coli, insect, en zoogdiercellen. Gelukt insect cellen, verkrijgen van mg hoeveelheden van zeer zuivere eiwitten, het kristalliseren in aanwezigheid van Remmers, en voor het vaststellen van zijn X-ray kristalstructuur uiting van oplosbare IKK1/α in baculovirus besmet. Hier beschrijven we de gedetailleerde stappen voor het produceren van de recombinant eiwit, haar kristallisatie en vastbesloten met X-ray kristal structuur.

Klonen en expressie van verschillende constructies van IKK1/α Volledige lengte die menselijke IKK1/α werd gekloond in de baculovirus expressie vector pFastBacHTa binnen haar beperkingsplaatsen EcoRI en kennisgevingen te verkrijgen van een N-terminal hexa-Histidine gelabeld IKK1. De tag kan worden verwijderd door TEV protease spijsvertering. Aangezien volledige lengte IKK1/α flexibele regio's aan beide uiteinden bevat, en flexibele regio's meestal een eiwit bemoeilij...

Watch this Scientific Journal Video about A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/ÃŽÂ± at JoVE.com

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

IκB Kinase 1/α (IKK1/α CHUK) is een Ser/Thr proteïne kinase dat in een horde van cellulaire activiteiten voornamelijk via activering van NF-recombination transcriptiefactoren betrokken is. Hier beschrijven we de belangrijkste stappen die nodig zijn voor de productie en de crystal structuurbepaling van dit eiwit.

Een gids voor productie, kristallisatie en structuurbepaling van menselijke IKK1/α

A class of extracellular stimuli requires activation of IKK1/&#945; to induce generation of an NF-&#954;B subunit, p52, through processing of its ...

Het doel van deze procedure is om richtlijnen te bieden voor de productie, kristallisatie en structurele bepaling van de menselijke IKK1-alpha om de mechanistische basis van zijn signaleringsfunctie te begrijpen en platforms voor rationeel medicijnontwerp te creëren. Deze methode moet onderzoekers helpen bij het bepalen van de structuur van IKK1, die antwoorden zou geven op belangrijke vragen op het gebied van immuunsignalering. Deze techniek beschrijft een gestroomlijnd pad naar het verkrijgen van kristallen van IKK-eiwitten, die nogal refractisch zijn voor kristallisatie en om verschillende kritische informatie te verstrekken bij het overwinnen van knelpunten bij het bepalen van de structuren.Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn bij deze methode het moeilijk hebben, omdat het genereren van milligramhoeveelheden oplosbaar, goed gedragen eiwit vereist, de expressie ervan in insectencellen vereist en kristallisatie kan worden gedaan onder slechts een zeer smal venster van omstandigheden. De moleculaire vervangingsprocedure die wordt gebruikt bij het bepalen van de structuur van IKK1 kan ook erg lastig zijn, vooral vanwege de slechte afbuigingseigenschap van de kristallen, niet op de plaats van de asymmetrische eenheid die veel IKK1-moleculen bevat bij afwezigheid van geschikte zoekmodellen. Het aantonen van de procedures zijn Kyle Shumate en Sonjiala Hotchkiss, studenten van mijn laboratorium.Op dag één, plaat Sf9 cellen in twee milliliter Sf903 insectencel medium, in elke put van een zes-put plaat en incubate op 27 graden Celsius. Doorsnee de cellen wanneer ze een dichtheid van twee tot drie keer 10 bereiken tot de zes cellen per milliliter in suspensie door het te verdunnen naar verse media, bij een dichtheid van ongeveer zes keer 10 tot vijf. Op dag twee verdun acht microliter Sf9-transfectiereagensagemiddel in 100 microliter van SF-903 of Grace's Insect Medium.Dan vortex het mengsel kort. Verdun in een aparte buis een microgram kitzuiverde recombinant bacmid in 100 microliter van hetzelfde medium. Combineer het verdunde DNA en transfectie reagens.Na het uitbroeden bij kamertemperatuur gedurende 15 tot 30 minuten, verwijder het medium uit de put. Voeg vervolgens een milliliter vers medium toe. Voeg vervolgens het verdunde DNA-transfectiereagensmengsel dropwise toe aan de cellen, waarbij de valgrootte zodanig wordt aangepast dat het niet ontwapenen aanhangende cellen.Voeg na zes uur 1,5 milliliter vers medium toe bovenop de cellen. Incubeer de cellen bij 27 graden Celsius, het controleren van de putten periodiek om de 12 uur op tekenen van virale infectie. Op dag vijf, verwijder het medium met cellen, 60 tot 72 uur na infectie.Na het overbrengen van het medium in buizen, centrifuge gedurende vijf minuten op 500 keer g en vier graden Celsius. Wanneer u klaar bent, sla de supernatant, dat is de P1 virus stack. Op dag één, resuspend de eerder voorbereide His-IKK1 celpellet in 40 milliliter lysebuffer.Plaats de celsuspensie op ijs en lyse de cellen door sonicatie op 60%tot 70% duty cycli en vijf tot 10 pulsen van 30-seconden duur met een interval van meer dan een minuut. Verhelder het lysaat door centrifugatie bij meer dan of gelijk aan 28.000 g gedurende 45 minuten bij vier graden Celsius. Na het voorbereiden van een Nickel-NTA Agarose hars, volgens het tekstprotocol, elute de His-tagged IKK1 alpha eiwit onder zwaartekracht stroom met behulp van 20 milliliter elution buffer.Verzamel een tot 1,5 milliliter fracties. Na het combineren van de fracties die het eiwit bevatten, verteer het monster 's nachts met TEV protease bij vier graden Celsius. In de ochtend van dag twee ontcunb tuurt het eiwit met één millimolar ATP, in aanwezigheid van magnesiumchloride, bèta-glycerofosfat, natriumfluoride en natriumortovanat gedurende een uur bij 27 graden Celsius.Na incubatie filtert u de eiwitoplossing door een filter van 0,45 micron. Laad vervolgens ongeveer zes milliliter van het monster op een 120 milliliter preparative size-exclusion kolom, bevestigd aan een geautomatiseerd vloeibaar chromatografiesysteem. Na evenwicht voert u de chromatografie van grootte-uitsluiting uit met een stroomsnelheid van één milliliter per minuut en verzamel ze twee milliliterfracties.Tijdens de run, monitor elution op 280 en 254 nanometer. Na het trekken van de zuivere fracties, concentreren in een 30-kilodalton, moleculair gewicht cut-off centrifugale concentrator, volgens de instructies van de fabrikant. Dan afzien van 25-microliter aliquots van het geconcentreerde eiwit en flash-freeze in vloeibare stikstof.Met behulp van een robot, pipet 80 tot 100 microliter van een kristallisatie reagens in het reservoir van een 96-put plaat. Met behulp van een kristallisatierobot, afzien en meng 0,2 tot 0,25 microliter van IKK1 en zijn remmer complex met hetzelfde volume van reservoir oplossing. Sluit onmiddellijk na het instellen van de druppels elke plaat af met optisch heldere folies om verdamping te voorkomen.Broed de ene plaat op 18 graden Celsius en de andere plaat op vier graden Celsius in een koude kamer. Gebruik een stereo microscoop met een polarisator om te controleren op het uiterlijk van kristal in elke druppel, elke dag, voor de eerste zeven dagen en vervolgens met langere intervallen. Na de voorbereiding van IKK1 en het remmercomplex zoals eerder beschreven, breng je de putoplossingen over op elke put van een 24-putplaat.Plaats een tot 1,5 microliter goed oplossing op een schone glazen coverslip. Voeg een gelijk volume van IKK1 en de remmer complex aan de glazen coverslip en meng zachtjes door pipet op en neer drie tot vier keer. Na het aanbrengen van vet op de ringen van elke put van de plaat, draai de glazen coverslip over en plaats op de respectieve goed met tangen.Sluit vervolgens de put af door op de glazen coverslip te drukken. Na het opzetten van alle druppels in de 24-put plaat, uitbroeden in de koude kamer, in het donker. Controleer af en toe de druppels onder een microscoop op het uiterlijk en de groei van kristallen.Zodra de kristalgroei is voltooid, verwijder voorzichtig de glazen coverslip met het kristal en plaats het op een vast oppervlak met de kristaldruppel naar boven gericht. Voeg voorzichtig 10 microliter cryo een oplossing op de top van de druppel en meng voorzichtig door pipetting, zodat het kristal niet wordt aangeraakt. Met behulp van een microscoop, langzaam verwijderen van wat vloeistof uit het kristal en houd ongeveer vijf tot acht microliter van de oplossing.Voeg voorzichtig 2,5 tot vier microliters cryo B-oplossing toe aan de druppel en meng voorzichtig door pipetten. Bedek de glazen coverslip met een kleine Petrie schotel om directe luchtstroom over het kristal te voorkomen. Na vijf minuten wachten, zorgvuldig kies een enkel kristal uit de druppel in een passende cryoloop gemonteerd op een goede basis.Flash-vries het kristal in vloeibare stikstof. Bewaar vervolgens het kristal met cryoloop in een puck ondergedompeld in vloeibare stikstof in een Dewar-kolf tot ze klaar zijn voor röntgendiffractie bij het synchrotron. Na uitgebreide studies met verschillende IKK1-varianten werden kristallen verkregen met één afgekapte constructie, die alleen geschikte röntgeneigenschappen vertoonde in aanwezigheid van de IKK-remmer XII.Het gecombineerde effect van röntgengegevens met een lage resolutie met zwakke intensiteiten, een groot aantal IKK1-moleculen in de asymmetrische eenheid en conformatievariatie van het IKK1 monomeric-dimeric-model, in vergelijking met bekende IKK2-modellen, maakten het moeilijk om een moleculaire vervangingsoplossing, IKK1, te verkrijgen en de structuur ervan te bepalen. Verschillende IKK2-structuren wezen op verschillende intermonomeeroriëntatie binnen de dimers, zodat de afstand tussen de alfacarbons van P578 in de twee kinase-domeinen, in vier verschillende dimermodellen, varieerde tussen 39 en 61 angstroms. Het verkrijgen van een nuttig zoekmodel was mogelijk vanwege de lage resolutie cryoelectron microscopie kaart en een hoge nauwkeurigheid model van IKK1 domeinen die kunnen worden gegenereerd op basis van een hoge resolutie IKK2 structuur.Het oorspronkelijke model gaf een oriëntatie van kinase domein gedraaid 24 graden ten opzichte van die van een IKK2 monomeer en een N-terminal opening van 58 angstroms. Met behulp van een van de dimers met de 52-angstrom opening als een model, zes dimers in de asymmetrische eenheid werden gevestigd. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek worden uitgevoerd in een paar maanden, als het goed wordt uitgevoerd.Tijdens het proberen van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden dat het verkrijgen van een oplosbaar, actief en goed gedragen eiwit is de eerste kritieke stap. Na het bekijken van deze video, moet u een goed algemeen begrip van alle stappen die moeten worden gevolgd in nauwgezette details, om succesvol te zijn in het kristalliseren en het bepalen van de structuur van IKK1 eiwit. Het leren van deze procedure, er is nog steeds structuren van andere IKK familie eiwitten die ook kunnen worden bepaald om aanvullende vragen over kinase-mitogen signalering te beantwoorden.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/&#945;

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, expressie, zuivering en kristallisatie van het Human serotonine transporter Gebonden aan<em&gt; S</em&gt; citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Combining Wet and Dry Lab Techniques to Guide the Crystallization of Large Coiled-coil Containing Proteins

De combinatie van natte en droge Lab Technieken om de kristallisatie van grote opgerolde-coil bevattende eiwitten Gids

Obtaining crystals for structure determination can be a difficult and time consuming proposition for any protein. Coiled-coil proteins and domains are ...

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Productie, kristallisatie en structuur bepalen van<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-1 via Microseeding en zink-SAD

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

High Precision FRET op single-molecuul niveau voor biomolecule structuur bepaling

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO

Productie, kristallisatie en structuurbepaling van het IKK-bindende domein van NEMO

NEMO is a scaffolding protein which plays an essential role in the NF-&#954;B pathway by assembling the IKK-complex with the kinases IKK&#945; and ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

Kristallisatie en structurele bepaling van een enzym: substraatcomplex door seriële kristallografie in een veelzijdige microfluïdische chip

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

The Extraction of Liver Glycogen Molecules for Glycogen Structure Determination

Liver glycogen is a hyperbranched glucose polymer that is involved in the maintenance of blood sugar levels in animals. The properties of glycogen are ...

Efficient and Scalable Production of Full-length Human Huntingtin Variants in Mammalian Cells using a Transient Expression System

Full-length huntingtin (FL HTT) is a large (aa 1-3,144), ubiquitously expressed, polyglutamine (polyQ)-containing protein with a mass of approximately 350 ...

High-Throughput Screening for Protein Crystallization

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography (Video) | JoVE 

High-throughput screening om kristalhits te verkrijgen voor eiwitkristallografie

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into ...

A Fibrinolytic Enzyme-Based Method to Study Cerebral Thrombus Cell Components

A Comprehensive Approach to Analyze the Cell Components of Cerebral Blood Clots

A Novel Method for Comprehensive Cell Component Analysis of Cerebral Blood Clots (Video) | JoVE

Een alomvattende benadering om de celcomponenten van cerebrale bloedstolsels te analyseren

Cerebral thrombosis, a blood clot in a cerebral artery or vein, is the most common type of cerebral infarction. The study of the cell components of ...