Name: a guide to production, crystallization, and structure determination of human ikk1/&#945;
Uploaded: 2018-11-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/ÃŽÂ± at JoVE.com

Nous remercions le personnel de la 19ID de ces faisceaux, 24ID et 13ID à Advanced Photon Source, Lemont (Illinois), pour le soutien au cours de la collecte de données sur différents cristaux. Nous sommes reconnaissants à Dmitry Lyumkis, Salk Institute pour nous aller chercher la carte de cryo-EM basse résolution des stades précoces de EM carte/modèle de construction, qui a été utilisé pour construire le modèle initial de la recherche du remplacement moléculaire IKK1. La recherche ayant abouti à ces résultats a reçu un financement de subventions de NIH AI064326, CA141722 et GM071862 à GG. SP est actuellement Wellcome Trust DBT Inde intermédiaire boursier.

1. préparation du Virus Recombinant adapté à l’Expression de la grande échelle d’IKK1/α
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Préparation de virus P1 32<ol>
<li>Jour 1 : Les cellules Sf9 plaque (~ 6 X 105) (numéro du passage inférieur à 10) dans 2 mL du milieu cellulaire insectes Sf900 III dans chaque puits d’une plaque de 6 puits et incuber à 27 ° C. Passage des cellules lorsqu’ils atteignent une densité de 2 à 3 X 106 cellules / mL en suspension par dilution dan...

<ol>
	<li>Xia, Y., Shen, S., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB,+an+active+player+in+human+cancers.">NF-kappaB, an active player in human cancers.</a> Cancer immunology research. 2 (9), 823-830 (2014).</li><li>Grivennikov, S. I., Greten, F. 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M., Delhase, M., Hayakawa, M., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IkappaB+kinase+complex+(IKK)+contains+two+kinase+subunits,+IKKalpha+and+IKKbeta,+necessary+for+IkappaB+phosphorylation+and+NF-kappaB+activation.">The IkappaB kinase complex (IKK) contains two kinase subunits, IKKalpha and IKKbeta, necessary for IkappaB phosphorylation and NF-kappaB activation.</a> Cell. 91 (2), 243-252 (1997).</li><li>Rothwarf, D. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IKKbeta+subunit+of+IkappaB+kinase+(IKK)+is+essential+for+nuclear+factor+kappaB+activation+and+prevention+of+apoptosis.">The IKKbeta subunit of IkappaB kinase (IKK) is essential for nuclear factor kappaB activation and prevention of apoptosis.</a> J Exp Med. 189 (11), 1839-1845 (1999).</li><li>Hayden, M. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shared+principles+in+NF-kappaB+signaling.">Shared principles in NF-kappaB signaling.</a> Cell. 132 (3), 344-362 (2008).</li><li>Sun, S. C., Chang, J. 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Solution de production, la cristallisation et la structure de deux protéines IKK reliées Nous partons pour déterminer la structure cristalline du IKK1/α la notion qu’il serait un exercice relativement simple étant donné notre expérience avec la production de protéines IKK2/β, cristallisation et détermination de la structure. Cependant, nous avons été très surpris que ces deux protéines apparentées se sont comportés très différemment au sujet de la facilité de la cristallisation. M...

Activités de transcriptionnelles de la famille NF-κB de facteurs de transcription dimère sont requises pour les fonctions cellulaires variées allant de l’inflammation et l’immunité à la survie et la mort. Ces activités sont strictement contrôlées dans les cellules et une perte du règlement conduit à diverses conditions pathologiques, y compris les maladies auto-immunes et du cancer1,2,3. En l’absence d’un stimulus, les activités de NF-κB restent inhibées par IκB (inhibiteur de - κB) protéines4. La phosphorylation des résidus Ser spécifiques sur les protéines IκB les marque pour l’ubiquitination et dégradation ultérieure proteasome ou traitement sélectif5. Deux kinases hautement homologues de Ser/Thr, IKK2/β et IKK1/α, agissent comme des régulateurs centrales des activités de NF-κB en effectuant ces phosphorylation événements6,7.
Interactions entre un ligand et un récepteur transduit un signal à travers une série de médiateurs conduisant à l’activation de facteurs de NF-κB. Le processus de signalisation NF-κB peuvent être classé en deux voies distinctes – canoniques et non canoniques (alternative)8. L’activité de l’IKK2/β régit principalement le NF-κB signalisation de la voie canonique qui est essentielle pour des réponses immunitaires innées et inflammatoires9. Une caractéristique particulière de cette voie est une activation rapide et de courte durée de l’IKK2/β10 au sein d’un complexe de IKK jusque-là biochimiquement indéterminé — présumé se compose de IKK1 et IKK2, mais aussi un volet réglementaire, NEMO (NF-κB Essential Modulator )11,12,13. Entre les deux sous-unités IKK catalytiques du complexe IKK, IKK2 est principalement responsable14 pour la phosphorylation des résidus spécifiques de prototypes IκBs (α, β - et γ-) lié au NF-κB et également une protéine IκB atypique, NF-κB1/p105, qui est un précurseur de la NF-κB p50 sous-unité5. La phosphorylation induit par ubiquitination et dégradation de proteasome de IκB (ou traitement des p105) conduit à la libération et l’activation d’un ensemble spécifique de NF-κB dimères15. Activité de NF-κB aberrante grâce à une fonction mal réglementée de l’IKK2 a été observée dans nombreux cancers, ainsi que dans des maladies auto-immunes2,3,16.
Contrairement à l’IKK2/β, activité de IKK1/α réglemente NF-κB, signalisation de la voie non canonique, qui est essentielle pour le développement et l’immunité. IKK1 phosphoryle des résidus spécifiques de NF-κB2/p100 sur son segment C-terminal IκBδ, qui mène à son traitement et la génération de p52. La formation de p52:RelB transcriptionnellement actif hétérodimère initie une réponse lente et soutenue aux signaux du développement7,17,18,19,20. Fait intéressant, la génération de la p52 de facteur NF-κB central de cette voie est gravement dépendante sur un autre facteur,21,NF-κB induisant Kinase (NIK)22, mais pas sur IKK2 ou NEMO. Dans les cellules au repos, le niveau de NIK reste faible en raison de la dégradation constante de le dépendant du protéasome23,24,25. Lors de la stimulation des cellules par des ligands « non canoniques » et dans certaines cellules malignes, NIK devient stabilisé afin de recruter et d’activer IKK1 / α. les activités de Kinase de NIK et IKK1 sont essentielles pour le traitement efficace des p100 dans p527. IKK1 et NIK phosphorylent trois sérines (Ser866, 870 et 872) de NF-κB2/p100 sur son segment C-terminal IκBδ menant à son traitement et la génération de p52. Aberrante activation de la voie non canoniques a été impliquée dans nombreuses tumeurs malignes dont le myélome multiple26,27,28.
Plusieurs inhibiteurs hautement efficaces et spécifiques pour IKK2/β sont connus, même si aucun jusqu'à présent ont avéré pour être un médicament efficace. En revanche, les inhibiteurs α-IKK1/spécifiques sont rares. Cela peut s’expliquer en partie par notre manque d’informations structurales et biochimiques sur IKK1/α, ce qui limite notre compréhension de la base mécaniste de l’activation de NF-κB par IKK1 dans les cellules et design rationnel des médicaments. Les structures des IKK2/β nous a fourni un aperçu du mécanisme d’activation de l’IKK2/β29; Cependant, ces structures ne pourraient pas révéler comment différents stimuli en amont déclencher l’activation du IKK1/α ou IKK2/β pour réguler des ensembles distincts de NF-κB activités 30,31. Pour comprendre les bases mécanistiques qui sous-tendent la fonction signalisation distincte de IKK1/α et d’établir une plate-forme pour la conception rationnelle de médicaments, nous nous sommes concentrés sur la détermination de la structure de IKK1/α.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cellfectin/Cellfectin II</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10362100</td>
			<td>Cellfectin is now discontinued, replaced by Cellfectin II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf900 III Insect cell medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12658-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SF9 cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12659017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-IKK1 antibody</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB100-56704</td>
			<td>Previously sold by Imgenex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PentaHis antibody</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>34460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>Nitrocellulose can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford assay reagent</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>500001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28989335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon concentrator</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC801008, UFC803008, UFC201024, UFC203024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound A</td>
			<td>Bayer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calbiochem IKK-inhibitor XII</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>401491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staurosporine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>S4400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLN120B</td>
			<td>Millenium</td>
			<td>Gift item</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPPNP</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A2647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulfate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>51227, 42867, 31404,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulfate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>93593, 81210, 88276, 95904, 81255, 89510, 92897, 81285, 95172</td>
			<td>Some of them are new Cat # on SIGMA catalogue. What we had was originally from Fluka that had different Cat #.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystallization Screens</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Screen I and II (Crystal Screen HT)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index HT</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG/Ion and PEG/Ion2 (PEG/Ion HT)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEGRX 1 and PEGRx 2 (PEGRx HT)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SaltRx 1 and SaltRx 2 (SaltRx HT)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal mounts</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR8-188, 190, 192, 194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synchrotron</td>
			<td>The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy&#8217;s Argonne National Laboratory</td>
			<td>Beamline 19 ID</td>
			<td>The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy&#8217;s Argonne National Laboratory provides ultra-bright, high-energy storage ring-generated X-ray beams for research in almost all scientific disciplines.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a guide to production, crystallization, and structure determination of human ikk1/&#945;

Une classe de stimuli extracellulaires nécessite l’activation de IKK1/α pour induire la production d’une sous-unité de NF-κB, p52, grâce à la transformation de son précurseur p100. P52 fonctionne comme un homodimère ou un hétérodimère avec une autre sous-unité NF-κB, RelB. Ces dimères à son tour régulent l’expression de centaines de gènes impliqués dans l’inflammation, la survie des cellules et le cycle cellulaire. IKK1/α reste avant tout associé de l’IKK2/β et NEMO comme un complexe ternaire. Cependant, on observe aussi une petite piscine de celui-ci comme un complex(es) de faible poids moléculaire. On ne sait pas si l’activité de traitement p100 est déclenchée par l’activation de IKK1/α dans la plus grande ou la plus petite piscine complexe. L’activité constitutive de IKK1/α a été détectée dans plusieurs cancers et maladies inflammatoires. Pour comprendre le mécanisme d’activation de IKK1/α et permettre son utilisation comme cible de drogue, nous avons exprimé IKK1/α recombinant dans des systèmes hôte différent, comme e. coli, insecte et les cellules de mammifères. Nous avons réussi à exprimer IKK1/α soluble dans baculovirus infectés par des cellules d’insecte, obtenir des quantités de mg de protéine très pure, il cristallise en présence d’inhibiteurs et déterminer sa structure cristalline. Nous décrivons ici les étapes détaillées pour produire la protéine recombinante, sa cristallisation et sa détermination de structure cristalline aux rayons x.

Clonage et expression de différentes constructions de IKK1/α Pleine longueur qu'ikk1/α humain a été cloné dans le baculovirus expression vector pFastBacHTa au sein de ses sites de restriction EcoRI et NotI pour obtenir un N-terminale hexa-Histidine tag IKK1. La balise pourrait être supprimée par digestion protéasique TEV. Étant donné que pleine longueur IKK1/α contient des zones flexibles sur les deux extrémités, et régions souples rendent habituellement...

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A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

IκB Kinase 1/α (IKK1/α CHUK) est une protéine kinase de Ser/Thr qui participe à une myriade d’activités cellulaires principalement grâce à l’activation de facteurs de transcription NF-κB. Nous décrivons ici les principales étapes nécessaires à la production et la détermination de structure cristalline de cette protéine.

Un Guide pour la Production, la cristallisation et détermination de la Structure des IKK1 humaine/α

A class of extracellular stimuli requires activation of IKK1/&#945; to induce generation of an NF-&#954;B subunit, p52, through processing of its ...

L’objectif de cette procédure est de fournir des conseils pour la production, la cristallisation et la détermination structurelle de l’IKK1-alpha humain afin de comprendre la base mécaniste de sa fonction de signalisation et d’établir des plates-formes pour la conception rationnelle des médicaments. Cette méthode devrait aider les chercheurs à déterminer la structure de l’IKK1, qui fournirait des réponses aux questions clés dans le domaine de la signalisation immunitaire. Cette technique décrit un chemin rationalisé vers l’obtention de cristaux de protéines IKK, qui sont plutôt réfractaires à la cristallisation et de fournir diverses informations critiques pour surmonter les goulets d’étranglement dans la détermination des structures.En général, les individus nouveaux à cette méthode auront du mal, parce que la génération de quantités milligrammes de protéines solubles et bien comportées, nécessite son expression dans les cellules d’insectes, et la cristallisation peut être faite dans seulement une fenêtre très étroite de conditions. La procédure de remplacement moléculaire utilisée pour déterminer la structure d’IKK1 peut également être très délicate, en particulier en raison d’une mauvaise propriété de déflexion des cristaux, et non à l’emplacement de l’unité asymétrique contenant de nombreuses molécules IKK1 en l’absence de modèles de recherche appropriés. Kyle Shumate et Sonjiala Hotchkiss, étudiants de mon laboratoire, démontreront les procédures.Le premier jour, plaquez les cellules Sf9 en deux millilitres de milieu de cellules d’insectes Sf903, dans chaque puits d’une plaque de six puits et incubez à 27 degrés Celsius. Passer les cellules quand ils atteignent une densité de deux à trois fois 10 à la six cellules par millilitre en suspension en le diluant à des médias frais, à une densité d’environ six fois 10 à la cinq. Le deuxième jour, diluer huit microlitres de réaccente de transfection Sf9 dans 100 microlitres de SF-903 ou grace’s Insect Medium.Puis vortex le mélange brièvement. Dans un tube séparé, diluer un microgramme de bacmid recombinant purifié en kit dans 100 microlitres du même milieu. Mélanger l’ADN dilué et le réaccente de transfection.Après avoir couver à température ambiante de 15 à 30 minutes, retirer le milieu du puits. Ajouter ensuite un millilitre de milieu frais. Ensuite, ajoutez le mélange de réavant de transfection d’ADN dilué sur les cellules, en ajustant la taille de la goutte de telle sorte qu’il ne déloge pas les cellules adhérentes.Après six heures, ajouter 1,5 millilitres de milieu frais sur le dessus des cellules. Incuber les cellules à 27 degrés Celsius, en vérifiant périodiquement les puits toutes les 12 heures pour déceler les signes d’infection virale. Le cinquième jour, retirer le milieu contenant des cellules, 60 à 72 heures après l’infection.Après avoir transféré le milieu dans des tubes, centrifugeuse pendant cinq minutes à 500 fois g et quatre degrés Celsius. Une fois terminé, enregistrer le supernatant, qui est la pile de virus P1. Le premier jour, resuspendez la pastille cellulaire His-IKK1 précédemment préparée dans 40 millilitres de tampon de lyse.Placez la suspension cellulaire sur la glace et lysez les cellules par sonication à des cycles de service de 60 % à 70 % et de cinq à dix impulsions d’une durée de 30 secondes à un intervalle supérieur à une minute. Clarifier le lysate par centrifugation à plus ou égal à 28 000 g pendant 45 minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir préparé une résine Nickel-NTA Agarose, selon le protocole du texte, élisez la protéine alpha IKK1 étiquetée His sous flux gravitationnel à l’aide de 20 millilitres de tampon d’élitution.Recueillir une à 1,5 millilitre fractions. Après avoir combiné les fractions contenant la protéine, digérer l’échantillon avec la protéase TEV pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le matin du deuxième jour, incuber la protéine avec un millimolaire d’ATP, en présence de chlorure de magnésium, bêta-glycérophosphate, fluorure de sodium et orthovanadate de sodium pendant une heure à 27 degrés Celsius.Après l’incubation, filtrer la solution protéique à l’aide d’un filtre de 0,45 micron. Chargez ensuite environ six millilitres de l’échantillon sur une colonne d’exclusion de taille préparative de 120 millilitres, fixée à un système automatisé de chromatographie liquide. Après l’équilibrage, exécutez la chromatographie d’exclusion de taille à un débit d’un millilitre par minute et recueillez des fractions de deux millilitres.Pendant la course, surveiller l’éution à 280 et 254 nanomètres. Après avoir tiré les fractions pures, concentrez-vous dans un concentrateur centrifuge de 30 kilodaltons et moléculaire, suivant les instructions du fabricant. Distribuez ensuite des aliquots de 25 microlitres de la protéine concentrée et clignotez dans de l’azote liquide.À l’aide d’un robot, pipette 80 à 100 microlitres d’un reagent de cristallisation dans le réservoir d’une plaque de 96 puits. À l’aide d’un robot de cristallisation, distribuez et mélangez de 0,2 à 0,25 microlitres d’IKK1 et de son complexe inhibiteur avec le même volume de solution de réservoir. Immédiatement après avoir mis les gouttes, sceller chaque plaque avec des films optiquement clairs pour éviter l’évaporation.Incuber une assiette à 18 degrés Celsius et l’autre plaque à quatre degrés Celsius dans une pièce froide. Utilisez un microscope stéréo avec un polariseur pour vérifier l’apparence du cristal dans chaque goutte, tous les jours, pendant les sept premiers jours, puis à des intervalles plus longs. Après avoir préparé IKK1 et son complexe inhibiteur comme décrit précédemment, transférez les solutions de puits à chaque puits d’une plaque de 24 puits.Placez un à 1,5 microlitres de solution de puits sur un couvercle en verre propre. Ajouter un volume égal d’IKK1 et son complexe inhibiteur à la couverture en verre et mélanger délicatement en pipetting de haut en bas trois à quatre fois. Après avoir appliqué de la graisse sur les anneaux de chaque puits de la plaque, retourner le couvercle en verre et placer sur le puits respectif avec des forceps.Sceller ensuite le puits en appuyant sur le couvercle en verre. Après avoir mis en place toutes les gouttes dans la plaque de 24 puits, incuber dans la chambre froide, dans l’obscurité. Vérifiez occasionnellement les gouttes au microscope pour l’apparence et la croissance des cristaux.Une fois la croissance du cristal terminée, retirez doucement le couvercle en verre contenant le cristal et placez-le sur une surface solide avec la goutte de cristal orientée vers le haut. Ajouter délicatement 10 microlitres de cryo A solution sur le dessus de la goutte et mélanger délicatement par pipetting de sorte que le cristal n’est pas touché. À l’aide d’un microscope, retirer lentement un peu de liquide du cristal et conserver environ cinq à huit microlitres de la solution.Ajouter délicatement 2,5 à quatre microlitres de solution cryo B sur la goutte et mélanger délicatement par pipetting. Couvrir le couvercle en verre d’une petite boîte de Pétrie pour éviter le flux d’air direct sur le cristal. Après avoir attendu cinq minutes, choisissez soigneusement un seul cristal de la goutte dans un cryoloop approprié monté sur une base appropriée.Congeler le cristal dans de l’azote liquide. Rangez ensuite le cristal contenant du cryoloop dans une rondelle immergée dans de l’azote liquide dans un flacon Dewar jusqu’à ce qu’il soit prêt pour la diffraction des rayons X au synchrotron. Après des essais approfondis avec plusieurs variantes IKK1 différentes, des cristaux ont été obtenus avec une construction tronquée, qui a montré des propriétés appropriées de rayon X seulement en présence de l’inhibiteur d’IKK XII.L’effet combiné des données de rayons X à basse résolution avec des intensités faibles, un grand nombre de molécules IKK1 dans l’unité asymétrique et la variation conformationnelle du modèle monomérique-dimérique IKK1, par rapport aux modèles IKK2 connus, ont rendu difficile l’obtention d’une solution de remplacement moléculaire, IKK1, et de déterminer sa structure. Différentes structures IKK2 indiquaient une orientation inter-monomère différente dans ses dimers de sorte que la distance entre les carbones alpha de P578 dans les deux domaines de kinase, dans quatre modèles différents de dimère, variait entre 39 et 61 angstroms. L’obtention d’un modèle de recherche utile a été possible grâce à la carte de microscopie cryoélectron à basse résolution et à un modèle de haute précision des domaines IKK1 qui pourraient être générés sur la base d’une structure IKK2 haute résolution.Le modèle initial indiquait une orientation du domaine kinase pivotant de 24 degrés par rapport à celle d’un monomère IKK2 et d’une ouverture n-terminale de 58 angstroms. En utilisant l’un des dimers avec l’ouverture de 52 angstrom comme modèle, six dimers dans l’unité asymétrique ont été localisés. Une fois maîtrisée, cette technique peut être exécutée en quelques mois, si elle est exécutée correctement.Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler que l’obtention d’une protéine soluble, active et bien comportée est la première étape critique. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension générale de toutes les étapes qui doivent être suivies dans les moindres détails, pour réussir à cristalliser et à déterminer la structure de la protéine IKK1. En apprenant cette procédure, il existe encore des structures d’autres protéines de la famille IKK qui peuvent également être déterminées afin de répondre à d’autres questions sur la signalisation kinase-mitogène.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/&#945;

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilisation, Expression, purification et cristallisation du Serotonin Human Transporter Bound to<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

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