Name: a guide to production, crystallization, and structure determination of human ikk1/&#945;
Uploaded: 2018-11-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/ÃŽÂ± at JoVE.com

Wir bedanken uns bei die Mitarbeiter an die Beamlines 19ID, 24ID-Chek und 13ID bei Advanced Photon Source, Lemont, Illinois, für die Unterstützung während der Datenerfassung auf verschiedenen Kristalle. Wir sind dankbar, Dmitry Lyumkis, Salk Institute für das Abrufen von uns der niedrige Auflösung-Cryo-EM-Karte in frühen Stadien der EM Karte/Modellbau, die verwendet wurde, um das ursprüngliche IKK1 molekulare Ersatz Suche Modell zu bauen. Die Forschung führt zu diesen Ergebnissen wird finanziell vom NIH-Stipendien, AI064326, CA141722 und GM071862, GG. SP ist zurzeit Wellcome Trust DBT Indien Intermediate Fellow.

1. Vorbereitung des rekombinanten Virus geeignet für großflächige Ausdruck der IKK1/α
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P1-Virus-Vorbereitung 32<ol>
<li>Tag 1: Platte Sf9 Zellen (~ 6 X 105) (Durchgang Nummer weniger als 10) in 2 mL Sf900 III Insekt Zelle Medium in jedem der 6-Well-Platte und Inkubation bei 27 ° C. Durchgang Zellen, wenn sie eine Dichte von 2 bis 3 X 106 Zellen pro mL in der Schwebe zu erreichen durch Verdünnung in frische Medien bei einer Dichte von ~ 6 X 10<...

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	<li>Xia, Y., Shen, S., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB,+an+active+player+in+human+cancers.">NF-kappaB, an active player in human cancers.</a> Cancer immunology research. 2 (9), 823-830 (2014).</li><li>Grivennikov, S. I., Greten, F. 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Produktion, Kristallisation und Struktur Lösung zweier verwandter IKK-Proteine Wir wollten die Röntgen-Kristallstruktur des IKK1/α mit dem Begriff feststellen, dass es eine relativ einfache Übung, die aufgrund unserer Erfahrungen mit IKK2/β Proteinproduktion, Kristallisation und Strukturaufklärung wäre. Allerdings waren wir sehr überrascht, dass diese zwei verwandte Proteine über die Leichtigkeit der Kristallisation sehr unterschiedlich Verhalten. Trotz der Bemühungen von mehreren hochkarät...

Transkriptionelle Aktivitäten der NF-κB-Familie von dimeres Transkriptionsfaktoren sind erforderlich für verschiedene Zellfunktionen Entzündung und Immunität bis hin zu überleben und sterben. Diese Aktivitäten werden in Zellen und einem Verlust der Verordnung führt zu verschiedenen pathologischen Bedingungen, einschließlich der Autoimmun-Krankheiten und Krebs1,2,3streng kontrolliert. In Ermangelung eines Reizes sind die Aktivitäten der NF-κB gehemmt durch IκBα (Inhibitor - κB) Proteine4gehalten. Die Phosphorylierung des spezifischen Ser Rückstände auf IκBα Proteine markiert diese für Ubiquitination und anschließende proteasomalen Abbau oder selektive Verarbeitung5. Zwei hochgradig homologe Ser/Thr-Kinasen, IKK2/β und IKK1/α, fungieren als zentrale Regulatoren des NF-κB-Aktivitäten durch die Durchführung diese Phosphorylierung Veranstaltungen6,7.
Wechselwirkungen zwischen einem Ligand und Rezeptor transduces ein Signal durch eine Reihe von Mediatoren führt zur Aktivierung von NF-κB-Faktoren. Der NF-κB-Signalisierung-Prozess kann grob in zwei unterschiedliche Wege – kanonischen und nicht-kanonischen (alternative)8aufgeteilt werden. Die Aktivität der IKK2/β regelt in erster Linie die NF-κB Signalisierung der kanonischen Weges, der für entzündliche und angeborene Immunantwort9unerlässlich. Ein besonderes Merkmal dieser Weg ist eine schnelle und kurzlebigen Aktivierung von IKK2/β10 innerhalb einer komplexen bisher biochemisch Fußgelenkes IKK – vermutet, bestehend aus IKK1 und IKK2 sowie eine regulatorische Komponente, NEMO (NF-κB wesentliche Modulator )11,12,13. Zwischen den zwei katalytische IKK Untereinheiten des IKK-komplexes, IKK2 ist in erster Linie verantwortlich14 für die Phosphorylierung von spezifischen Rückständen von prototypischen IκBs (α, β- und γ-) verpflichtet, NF-κB, und auch eine atypische IκBα Protein NF-κB1/p105 ist ein Vorläufer des NF-κB p50 Untereinheit5. Phosphorylierung induzierten Ubiquitination und proteasomalen Abbau von IκBα (oder Verarbeitung von p105) führt zur Freisetzung und Aktivierung eines bestimmten Satzes von NF-κB Dimere15. Aberrante NF-κB-Aktivität durch MIS geregelte Funktion des IKK2 ist bei vielen Krebsarten, wie Autoimmun-Krankheiten2,3,16beobachtet worden.
Im Gegensatz zu IKK2/β reguliert die Aktivität von IKK1/α NF-κB Signalisierung des nicht-kanonischen Weges, die wesentlich für die Entwicklung und Immunität. IKK1 phosphorylates bestimmte Rückstände des NF-κB2/p100 auf Segment C-terminalen IκBδ, führt zu deren Verarbeitung und die Generierung von p52. Die Bildung von transcriptionally aktiv P52:RelB Heterodimer initiiert eine langsame und nachhaltige Antwort auf Entwicklungsstörungen Signale7,17,18,19,20. Interessanterweise ist die Generation der zentralen NF-κB Faktor p52 dieses Pfades ein weiterer Faktor, NF-κB induzierende Kinase (NIK)21,22, aber nicht auf IKK2 oder NEMO kritisch abhängig. Ruhende Zellen bleibt das Niveau der NIK aufgrund seiner konstanten Proteasom-abhängige Abbau23,24,25. Nach Stimulation der Zellen durch "nicht-kanonischen" Liganden und in bestimmten malignen Zellen NIK wird stabilisiert, um zu rekrutieren und aktivieren IKK1 / α-Kinase die Tätigkeit der NIK und IKK1 sind wesentlich für die effiziente Verarbeitung der p100 zu p527. IKK1 und NIK phosphorylieren drei Serine (Ser866, 870 bis 872) des NF-κB2/p100 auf seinem C-terminalen IκBδ Segment führt zu deren Verarbeitung und die Generierung von p52. Aberrante Aktivierung der nicht-kanonischen Weg hat in vielen Malignome einschließlich Multiples Myelom26,27,28verwickelt.
Einige höchst effiziente und spezifische Hemmstoffe für IKK2/β sind bekannt, obwohl keines bisher erwies haben sich als um ein wirksames Medikament zu sein. Im Gegensatz dazu sind IKK1/α-spezifische Inhibitoren spärlich. Dies kann stammen teilweise aus unser Mangel an strukturelle und biochemische Informationen über IKK1/α, das unser Verständnis der mechanistischen Grundlagen der Aktivierung von NF-κB von IKK1 in den Zellen und rationalen Wirkstoffdesign einschränkt. Die Röntgen-Strukturen der IKK2/β hat uns Einblicke in den Aktivierungsmechanismus von IKK2/β-29; Diese Strukturen könnten zeigen jedoch nicht wie andere vorgelagerte Reize auslösen Aktivierung des IKK1/α oder IKK2/β, verschiedene Gruppen von NF-κB Aktivitäten 30,31zu regulieren. Die mechanistische Grundlage zugrunde liegenden unterschiedlichen Signalfunktion von IKK1/α zu verstehen und eine Plattform für rationale Wirkstoffdesign etablieren, konzentrierten wir uns auf die Struktur von IKK1/α.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cellfectin/Cellfectin II</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10362100</td>
			<td>Cellfectin is now discontinued, replaced by Cellfectin II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf900 III Insect cell medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12658-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SF9 cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12659017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-IKK1 antibody</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB100-56704</td>
			<td>Previously sold by Imgenex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PentaHis antibody</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>34460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>Nitrocellulose can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford assay reagent</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>500001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28989335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon concentrator</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC801008, UFC803008, UFC201024, UFC203024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound A</td>
			<td>Bayer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calbiochem IKK-inhibitor XII</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>401491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staurosporine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>S4400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLN120B</td>
			<td>Millenium</td>
			<td>Gift item</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPPNP</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A2647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulfate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>51227, 42867, 31404,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulfate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>93593, 81210, 88276, 95904, 81255, 89510, 92897, 81285, 95172</td>
			<td>Some of them are new Cat # on SIGMA catalogue. What we had was originally from Fluka that had different Cat #.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystallization Screens</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Screen I and II (Crystal Screen HT)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index HT</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG/Ion and PEG/Ion2 (PEG/Ion HT)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEGRX 1 and PEGRx 2 (PEGRx HT)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SaltRx 1 and SaltRx 2 (SaltRx HT)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal mounts</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR8-188, 190, 192, 194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synchrotron</td>
			<td>The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy&#8217;s Argonne National Laboratory</td>
			<td>Beamline 19 ID</td>
			<td>The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy&#8217;s Argonne National Laboratory provides ultra-bright, high-energy storage ring-generated X-ray beams for research in almost all scientific disciplines.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a guide to production, crystallization, and structure determination of human ikk1/&#945;

Eine Klasse von extrazellulären Reize erfordert die Aktivierung von IKK1/α induzieren eine NF-κB-Untereinheit, p52, durch Verarbeitung von seinen Vorläufer-p100-Generation. P52 Funktionen als Homodimer oder Heterodimer mit einem anderen NF-κB-Untereinheit, RelB. Diese Dimere Regeln wiederum den Ausdruck von Hunderten von Genen beteiligt sind Entzündungen, Zelle überleben und Zellzyklus. IKK1/α bleibt in erster Linie als ternäre Komplex IKK2/β und NEMO zugeordnet. Ein kleiner Pool es wird jedoch auch als eine niedermolekulare complex(es) beobachtet. Es ist unbekannt, ob die p100-Verarbeitung-Aktivität durch Aktivierung der IKK1/α innerhalb der größeren oder kleineren komplexen Pool ausgelöst wird. Konstitutive Aktivität von IKK1/α wurde in verschiedenen Krebsarten und entzündlichen Erkrankungen erkannt. Um den Mechanismus der Aktivierung von IKK1/α zu verstehen, und seine Verwendung als Medikament Ziel, ausgedrückt wir rekombinanten IKK1/α in anderen Host-Systemen, wie E. Coli, Insekt und Säugerzellen. Uns gelungen, mit dem Ausdruck lösliche IKK1/α in Baculovirus Insektenzellen, mg-Mengen an hoch reines Protein zu erhalten, in Anwesenheit von Inhibitoren kristallisieren und Bestimmung der Röntgen-Kristallstruktur infiziert. Hier beschreiben wir die einzelnen Schritte um das rekombinante Protein, die Kristallisation und seine x-ray Kristall Strukturbestimmung zu produzieren.

Klonierung und Expression von verschiedenen Konstrukte der IKK1/α Voller Länge, die, den menschliche IKK1/α in das Baculovirus Ausdruck Vektor pFastBacHTa innerhalb seiner EcoRI und NotI Restriktionsschnittstellen zu einer N-terminalen Hexa-Histidin geklont wurde, gekennzeichnet IKK1. Der Tag könnte von TEV Protease Verdauung entfernt werden. Da IKK1/α in voller Länge flexible Regionen an beiden Enden enthält und flexible Regionen in der Regel ein Protein erschw...

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A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

IκBα Kinase 1/α (IKK1/α CHUK) ist ein Ser/Thr-Proteinkinase, die in einer Vielzahl von zellulären Aktivitäten in erster Linie durch Aktivierung von NF-κB Transkriptionsfaktoren beteiligt ist. Hier beschreiben wir die wichtigsten Schritte für die Produktion und Kristall Strukturbestimmung dieses Proteins notwendig.

Eine Anleitung zur Produktion, Kristallisation und Strukturaufklärung von menschlichen IKK1/α

A class of extracellular stimuli requires activation of IKK1/&#945; to induce generation of an NF-&#954;B subunit, p52, through processing of its ...

Ziel dieses Verfahrens ist es, Orientierungshilfen für die Herstellung, Kristallisation und strukturelle Bestimmung des menschlichen IKK1-alpha zu geben, um die mechanistische Grundlage seiner Signalfunktion zu verstehen und Plattformen für rationales Arzneimitteldesign zu schaffen. Diese Methode sollte Forschern helfen, die Struktur von IKK1 zu bestimmen, die Antworten auf wichtige Fragen im Bereich der Immunsignalisierung liefern würde. Diese Technik beschreibt einen schlanken Weg zur Gewinnung von Kristallen von IKK-Proteinen, die eher feuerfest zur Kristallisation sind, und um verschiedene kritische Informationen zur Überwindung von Engpässen bei der Bestimmung der Strukturen zu liefern.Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, weil die Erzeugung von Milligramm Mengen an löslichem, wohlerzogenem Protein seine Expression in Insektenzellen erfordert und die Kristallisation nur unter einem sehr engen Fenster von Bedingungen erfolgen kann. Das molekulare Ersatzverfahren, das bei der Bestimmung der Struktur von IKK1 verwendet wird, kann auch sehr schwierig sein, insbesondere aufgrund der schlechten Ablenkeigenschaften der Kristalle, nicht an der Stelle der asymmetrischen Einheit, die viele IKK1-Moleküle enthält, wenn keine geeigneten Suchmodelle vorhanden sind. Die Verfahren werden Kyle Shumate und Sonjiala Hotchkiss, Studenten aus meinem Labor, demonstrieren.Am ersten Tag, Platte Sf9 Zellen in zwei Milliliter Sf903 Insektenzellmedium, in jedem Brunnen einer Sechs-Brunnen-Platte und inkubieren bei 27 Grad Celsius. Durchdurchfahrt der Zellen, wenn sie eine Dichte von zwei bis drei mal 10 zu den sechs Zellen pro Milliliter in Suspension erreichen, indem sie sie zu frischen Medien verdünnen, mit einer Dichte von etwa sechs mal 10 bis fünf. Am zweiten Tag acht Mikroliter Sf9-Transfektionsreagenz in 100 Mikroliter SF-903 oder Grace es Insect Medium verdünnen.Dann wirbeln Sie die Mischung kurz. In einem separaten Rohr ein Mikrogramm kitgereinigtes rekombinantes Bakmid in 100 Mikroliter desselben Mediums verdünnen. Kombinieren Sie die verdünnte DNA und das Transfektionsreagenz.Nach der Inkubation bei Raumtemperatur für 15 bis 30 Minuten, entfernen Sie das Medium aus dem Brunnen. Dann fügen Sie einen Milliliter frisches Medium hinzu. Als nächstes fügen Sie das verdünnte DNA-Transfektionsreagenz-Gemisch tropfenweise auf die Zellen ein, um die Tropfengröße so anzupassen, dass sie anhaftende Zellen nicht verdrängt.Nach sechs Stunden 1,5 Milliliter frisches Medium auf die Zellen geben. Inkubieren Sie die Zellen bei 27 Grad Celsius und überprüfen Sie die Brunnen regelmäßig alle 12 Stunden auf Anzeichen einer Virusinfektion. Am fünften Tag, entfernen Sie das Medium enthaltende Zellen, 60 bis 72 Stunden nach der Infektion.Nach der Übertragung des Mediums in Rohre zentrifugieren Sie fünf Minuten bei 500 mal g und vier Grad Celsius. Speichern Sie nach Fertigstellung den Überstand, der der P1-Virusstapel ist. Am ersten Tag wird das zuvor vorbereitete His-IKK1-Zellpellet in 40 MilliliterLysepuffer wieder ausgesetzt.Legen Sie die Zellsuspension auf Eis und lysedien die Zellen durch Beschallung bei 60% bis 70%Zollzyklen und fünf bis zehn Impulsen mit 30-Sekunden-Dauer in einem Intervall von mehr als einer Minute. Klären Sie das Lysat durch Zentrifugation bei mehr als oder gleich 28 000 g für 45 Minuten bei vier Grad Celsius. Nach der Herstellung eines Nickel-NTA Agarose-Harzes, gemäß dem Textprotokoll, elute das His-tagged IKK1 Alpha-Protein unter Schwerkraftfluss mit 20 Milliliter Elutionspuffer.Sammeln Sie ein bis 1,5 Milliliter Fraktionen. Nach der Kombination der Fraktionen, die das Protein enthalten, verdauen Sie die Probe mit TEV-Protease über Nacht bei vier Grad Celsius. Am Morgen des zweiten Tages das Protein mit einem Millimolar ATP in Gegenwart von Magnesiumchlorid, Beta-Glycerophosphat, Natriumfluorid und Natriumorthovanadate für eine Stunde bei 27 Grad Celsius inkubieren.Filtern Sie die Proteinlösung nach der Inkubation durch einen 0,45-Mikron-Filter. Dann laden Sie etwa sechs Milliliter der Probe auf eine 120 Milliliter präparative Größenausschlusssäule, die an ein automatisiertes Flüssigkeitschromatographiesystem angeschlossen ist. Führen Sie nach dem Ausgleich die Größenausschlusschromatographie mit einer Durchflussrate von einem Milliliter pro Minute aus und sammeln Sie Zwei-Milliliter-Fraktionen.Während des Laufs die Elution bei 280 und 254 Nanometern überwachen. Nach dem Ziehen der reinen Fraktionen konzentrieren Sie sich in einem 30-Kilodalton, Molekulargewicht cut-off Zentrifugalkonzentrator, nach den Anweisungen des Herstellers. Dann 25-Mikroliter-Aliquots des konzentrierten Proteins abgeben und in flüssigem Stickstoff einfrieren.Mit einem Roboter, Pipette 80 bis 100 Mikroliter eines Kristallisationsreagenz in das Reservoir einer 96-Well-Platte. Mit einem Kristallisationsroboter 0,2 bis 0,25 Mikroliter IKK1 und dessen Inhibitorkomplex mit dem gleichen Volumen an Reservoirlösung dosieren und mischen. Unmittelbar nach dem Einstellen der Tropfen jede Platte mit optisch klaren Folien versiegeln, um Verdunstung zu vermeiden.Eine Platte bei 18 Grad Celsius und die andere Platte bei vier Grad Celsius in einem kalten Raum bebrüten. Verwenden Sie ein Stereomikroskop mit einem Polarisator, um das Aussehen von Kristall in jedem Tropfen zu überprüfen, jeden Tag, für die ersten sieben Tage und dann in längeren Intervallen. Nach der Vorbereitung von IKK1 und seinem Inhibitorkomplex, wie zuvor beschrieben, übertragen Sie die Brunnenlösungen auf jeden Brunnen einer 24-Well-Platte.Legen Sie ein bis 1,5 Mikroliter Brunnenlösung auf einen sauberen Glasdeckel. Fügen Sie dem Glasabdeckungsrutsch ein gleiches Volumen von IKK1 und seinem Inhibitorkomplex hinzu und mischen Sie es vorsichtig, indem Sie drei- bis viermal nach oben und unten pfeifen. Nach dem Auftragen von Fett auf die Ringe jedes Brunnens der Platte, drehen Sie die Glasabdeckung über und legen Sie auf dem jeweiligen Brunnen mit Zangen.Dann versiegeln Sie den Brunnen, indem Sie auf den Glasdeckel drücken. Nach dem Aufstellen aller Tropfen in der 24-Well-Platte, inkubieren in der kalten Raum, im Dunkeln. Überprüfen Sie gelegentlich die Tropfen unter dem Mikroskop auf Aussehen und Wachstum von Kristallen.Sobald das Kristallwachstum abgeschlossen ist, entfernen Sie vorsichtig den Glasdeckel, der den Kristall enthält, und legen Sie ihn auf eine feste Oberfläche mit dem Kristalltropfen nach oben. Fügen Sie vorsichtig 10 Mikroliter Kryo Eine Lösung auf dem Tropfen und sanft durch Pipettieren mischen, so dass der Kristall nicht berührt wird. Mit einem Mikroskop, langsam entfernen Sie etwas Flüssigkeit aus dem Kristall und halten Sie etwa fünf bis acht Mikroliter der Lösung.2,5 bis vier Mikroliter Kryo-B-Lösung vorsichtig auf den Tropfen geben und vorsichtig durch Pipetieren mischen. Bedecken Sie den Glasdeckel mit einer kleinen Petrie-Schale, um einen direkten Luftstrom über den Kristall zu vermeiden. Nach fünf Minuten Wartezeit, wählen Sie vorsichtig einen einzelnen Kristall aus dem Tropfen in einem entsprechenden Kryoloop auf einer richtigen Basis montiert.Flash-Freeze den Kristall in flüssigem Stickstoff. Dann lagern Sie den Kristall mit Kryoloop in einem Puck in flüssigen Stickstoff in einem Dewar-Kolben eingetaucht, bis sie für die Röntgenbeugung am Synchrotron bereit sind. Nach umfangreichen Versuchen mit mehreren verschiedenen IKK1-Varianten wurden Kristalle mit einem abgeschnittenen Konstrukt gewonnen, das nur in Gegenwart des IKK-Inhibitors XII geeignete Röntgeneigenschaften aufwies.Die kombinierte Wirkung von Röntgendaten mit niedriger Auflösung mit schwachen Intensitäten, einer großen Anzahl von IKK1-Molekülen in der asymmetrischen Einheit und konformationalen Variationen des monomeric-dimerischen IKK1-Modells im Vergleich zu bekannten IKK2-Modellen erschwerte es, eine molekulare Ersatzlösung, IKK1, zu erhalten und ihre Struktur zu bestimmen. Verschiedene IKK2-Strukturen zeigten eine unterschiedliche intermonomere Ausrichtung innerhalb ihrer Dimere an, so dass der Abstand zwischen den Alpha-Kohlenstoffen von P578 in den beiden Kinase-Domänen in vier verschiedenen Dimer-Modellen zwischen 39 und 61 Angstroms variierte. Die Beschaffung eines nützlichen Suchmodells war aufgrund der low-resolution cryoelectron microscopy map und eines hochpräzisen Modells von IKK1-Domänen möglich, die auf der Grundlage einer hochauflösenden IKK2-Struktur generiert werden konnten.Das ursprüngliche Modell zeigte eine Ausrichtung der Kinase-Domäne um 24 Grad relativ zu der eines IKK2-Monomers und einer N-Terminalöffnung von 58 Angstroms. Anhand eines der Dimer mit der 52-Angstrom-Öffnung als Modell wurden sechs Dimere in der asymmetrischen Einheit lokalisiert. Einmal gemeistert, kann diese Technik in ein paar Monaten ausgeführt werden, wenn sie ordnungsgemäß ausgeführt wird.Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Erlangung eines löslichen, aktiven und gut erzogenen Proteins der erste kritische Schritt ist. Nachdem Sie sich dieses Video angeschaut haben, sollten Sie ein gutes allgemeines Verständnis aller Schritte haben, die in sorgfältiger Detailgenauigkeit befolgt werden müssen, um erfolgreich die Struktur des IKK1-Proteins zu kristallisieren und zu bestimmen. Wenn man dieses Verfahren lernt, gibt es immer noch Strukturen anderer Proteine der IKK-Familie, die auch bestimmt werden können, um zusätzliche Fragen zur Kinase-Mitogen-Signalisierung zu beantworten.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/&#945;

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Reinigung und Kristallisation des menschlichen Serotonin-Transporter-Bound<em&gt; S</em&gt; -Citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Forschung

Biochemie

Combining Wet and Dry Lab Techniques to Guide the Crystallization of Large Coiled-coil Containing Proteins

Nass- und Trockenlabortechniken Die Kombination der Kristallisation von Large Coiled-Coil-Proteine ​​enthalten, zu Führer

Obtaining crystals for structure determination can be a difficult and time consuming proposition for any protein. Coiled-coil proteins and domains are ...

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Produktion, Kristallisation und Strukturbestimmung<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-1 über Microseeding und Zink-SAD

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

Hochpräzisions-FRET auf Einzelmolekül-Niveau für die Bestimmung der Biomolekülstruktur

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO

Produktion, Kristallisation und Strukturbestimmung der IKK-bindungsdomäne von NEMO

NEMO is a scaffolding protein which plays an essential role in the NF-&#954;B pathway by assembling the IKK-complex with the kinases IKK&#945; and ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

Kristallisation und strukturelle Bestimmung eines Enzyms: Substratkomplex durch serielle Kristallisation in einem vielseitigen mikrofluidischen Chip

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

The Extraction of Liver Glycogen Molecules for Glycogen Structure Determination

Liver glycogen is a hyperbranched glucose polymer that is involved in the maintenance of blood sugar levels in animals. The properties of glycogen are ...

Efficient and Scalable Production of Full-length Human Huntingtin Variants in Mammalian Cells using a Transient Expression System

Full-length huntingtin (FL HTT) is a large (aa 1-3,144), ubiquitously expressed, polyglutamine (polyQ)-containing protein with a mass of approximately 350 ...

High-Throughput Screening for Protein Crystallization

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography (Video) | JoVE 

Hochdurchsatz-Screening zur Gewinnung von Kristalltreffern für die Proteinkristallographie

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into ...

A Fibrinolytic Enzyme-Based Method to Study Cerebral Thrombus Cell Components

A Comprehensive Approach to Analyze the Cell Components of Cerebral Blood Clots

A Novel Method for Comprehensive Cell Component Analysis of Cerebral Blood Clots (Video) | JoVE

Ein umfassender Ansatz zur Analyse der Zellbestandteile von zerebralen Blutgerinnseln

Cerebral thrombosis, a blood clot in a cerebral artery or vein, is the most common type of cerebral infarction. The study of the cell components of ...