Name: a guide to production, crystallization, and structure determination of human ikk1/&#945;
Uploaded: 2018-11-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/ÃŽÂ± at JoVE.com

אנו מודים הצוות beamlines 19ID, 24ID, ו 13ID מתקדם פוטון במקור, Lemont, איל, לתמיכה במהלך איסוף נתונים על קריסטלים שונים. אנחנו מודים דמיטרי Lyumkis, מכון סאלק להבאה אותנו על המפה הקפאה-EM ברזולוציה נמוכה בשלבים המוקדמים של EM מפה/דגם בניין, אשר שימש כדי לבנות את הדגם הראשוני של חיפוש תחליף מולקולרית IKK1. המחקר שהוביל את התוצאות הללו זכה למימון מענקים NIH AI064326, CA141722 ו- GM071862 כדי GG. SP הוא כעת Wellcome אמון DBT הודו ביניים עמית.

1. הכנת וירוס רקומביננטי מתאים לביטוי בקנה מידה גדול של IKK1/α
<ol><li>
הכנת וירוס P1 32<ol>
<li>יום 1: צלחת Sf9 תאים (~ 6 X 105) (פסקה מספר פחות מ 10) ב 2 מ של Sf900 השלישי תא חרקים בינוני בכל טוב של צלחת 6-ובכן, דגירה ב-27 º C מעבר תאים כאשר הם מגיעים צפיפות של 2-3 X 106 תאים לכל מ ל השעיה ע...

<ol>
	<li>Xia, Y., Shen, S., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB,+an+active+player+in+human+cancers.">NF-kappaB, an active player in human cancers.</a> Cancer immunology research. 2 (9), 823-830 (2014).</li><li>Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity,+inflammation,+and+cancer.">Immunity, inflammation, and cancer.</a> Cell. 140 (6), 883-899 (2010).</li><li>Ben-Neriah, Y., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+meets+cancer,+with+NF-kappaB+as+the+matchmaker.">Inflammation meets cancer, with NF-kappaB as the matchmaker.</a> Nature immunology. 12 (8), 715-723 (2011).</li><li>Hinz, M., Scheidereit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IkappaB+kinase+complex+in+NF-kappaB+regulation+and+beyond.">The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond.</a> EMBO reports. 15 (1), 46-61 (2014).</li><li>Karin, M., Ben-Neriah, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+meets+ubiquitination:+the+control+of+NF-[kappa]B+activity.">Phosphorylation meets ubiquitination: the control of NF-[kappa]B activity.</a> Annu Rev Immunol. 18, 621-663 (2000).</li><li>Ghosh, S., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Missing+pieces+in+the+NF-kappaB+puzzle.">Missing pieces in the NF-kappaB puzzle.</a> Cell. 109, S81-S96 (2002).</li><li>Sun, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+noncanonical+NF-kappaB+pathway.">The noncanonical NF-kappaB pathway.</a> Immunol Rev. 246 (1), 125-140 (2012).</li><li>Bonizzi, G., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+NF-kappaB+activation+pathways+and+their+role+in+innate+and+adaptive+immunity.">The two NF-kappaB activation pathways and their role in innate and adaptive immunity.</a> Trends Immunol. 25 (6), 280-288 (2004).</li><li>DiDonato, J. A., Hayakawa, M., Rothwarf, D. M., Zandi, E., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cytokine-responsive+IkappaB+kinase+that+activates+the+transcription+factor+NF-kappaB.">A cytokine-responsive IkappaB kinase that activates the transcription factor NF-kappaB.</a> Nature. 388 (6642), 548-554 (1997).</li><li>Werner, S. L., Barken, D., Hoffmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulus+specificity+of+gene+expression+programs+determined+by+temporal+control+of+IKK+activity.">Stimulus specificity of gene expression programs determined by temporal control of IKK activity.</a> Science. 309 (5742), 1857-1861 (2005).</li><li>Zandi, E., Rothwarf, D. M., Delhase, M., Hayakawa, M., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IkappaB+kinase+complex+(IKK)+contains+two+kinase+subunits,+IKKalpha+and+IKKbeta,+necessary+for+IkappaB+phosphorylation+and+NF-kappaB+activation.">The IkappaB kinase complex (IKK) contains two kinase subunits, IKKalpha and IKKbeta, necessary for IkappaB phosphorylation and NF-kappaB activation.</a> Cell. 91 (2), 243-252 (1997).</li><li>Rothwarf, D. M., Zandi, E., Natoli, G., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IKK-gamma+is+an+essential+regulatory+subunit+of+the+IkappaB+kinase+complex.">IKK-gamma is an essential regulatory subunit of the IkappaB kinase complex.</a> Nature. 395 (6699), 297-300 (1998).</li><li>Yamaoka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementation+cloning+of+NEMO,+a+component+of+the+IkappaB+kinase+complex+essential+for+NF-kappaB+activation.">Complementation cloning of NEMO, a component of the IkappaB kinase complex essential for NF-kappaB activation.</a> Cell. 93 (7), 1231-1240 (1998).</li><li>Li, Z. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IKKbeta+subunit+of+IkappaB+kinase+(IKK)+is+essential+for+nuclear+factor+kappaB+activation+and+prevention+of+apoptosis.">The IKKbeta subunit of IkappaB kinase (IKK) is essential for nuclear factor kappaB activation and prevention of apoptosis.</a> J Exp Med. 189 (11), 1839-1845 (1999).</li><li>Hayden, M. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shared+principles+in+NF-kappaB+signaling.">Shared principles in NF-kappaB signaling.</a> Cell. 132 (3), 344-362 (2008).</li><li>Sun, S. C., Chang, J. H., Jin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+nuclear+factor-kappaB+in+autoimmunity.">Regulation of nuclear factor-kappaB in autoimmunity.</a> Trends Immunol. 34 (6), 282-289 (2013).</li><li>Claudio, E., Brown, K., Park, S., Wang, H., Siebenlist, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAFF-induced+NEMO-independent+processing+of+NF-kappa+B2+in+maturing+B+cells.">BAFF-induced NEMO-independent processing of NF-kappa B2 in maturing B cells.</a> Nat Immunol. 3 (10), 958-965 (2002).</li><li>Senftleben, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+by+IKKalpha+of+a+second,+evolutionary+conserved,+NF-kappa+B+signaling+pathway.">Activation by IKKalpha of a second, evolutionary conserved, NF-kappa B signaling pathway.</a> Science. 293 (5534), 1495-1499 (2001).</li><li>Coope, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40+regulates+the+processing+of+NF-kappaB2+p100+to+p52.">CD40 regulates the processing of NF-kappaB2 p100 to p52.</a> EMBO J. 21 (20), 5375-5385 (2002).</li><li>Dejardin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lymphotoxin-beta+receptor+induces+different+patterns+of+gene+expression+via+two+NF-kappaB+pathways.">The lymphotoxin-beta receptor induces different patterns of gene expression via two NF-kappaB pathways.</a> Immunity. 17 (4), 525-535 (2002).</li><li>Xiao, G., Fong, A., Sun, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+p100+processing+by+NF-kappaB-inducing+kinase+involves+docking+IkappaB+kinase+alpha+(IKKalpha)+to+p100+and+IKKalpha-mediated+phosphorylation.">Induction of p100 processing by NF-kappaB-inducing kinase involves docking IkappaB kinase alpha (IKKalpha) to p100 and IKKalpha-mediated phosphorylation.</a> The Journal of biological chemistry. 279 (29), 30099-30105 (2004).</li><li>Xiao, G., Harhaj, E. W., Sun, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB-inducing+kinase+regulates+the+processing+of+NF-kappaB2+p100.">NF-kappaB-inducing kinase regulates the processing of NF-kappaB2 p100.</a> Molecular cell. 7 (2), 401-409 (2001).</li><li>Qing, G., Qu, Z., Xiao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+basally+translated+NF-kappaB-inducing+kinase+(NIK)+protein+functions+as+a+molecular+switch+of+processing+of+NF-kappaB2+p100.">Stabilization of basally translated NF-kappaB-inducing kinase (NIK) protein functions as a molecular switch of processing of NF-kappaB2 p100.</a> J Biol Chem. 280 (49), 40578-40582 (2005).</li><li>Zarnegar, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncanonical+NF-kappaB+activation+requires+coordinated+assembly+of+a+regulatory+complex+of+the+adaptors+cIAP1,+cIAP2,+TRAF2+and+TRAF3+and+the+kinase+NIK.">Noncanonical NF-kappaB activation requires coordinated assembly of a regulatory complex of the adaptors cIAP1, cIAP2, TRAF2 and TRAF3 and the kinase NIK.</a> Nat Immunol. 9 (12), 1371-1378 (2008).</li><li>Vallabhapurapu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonredundant+and+complementary+functions+of+TRAF2+and+TRAF3+in+a+ubiquitination+cascade+that+activates+NIK-dependent+alternative+NF-kappaB+signaling.">Nonredundant and complementary functions of TRAF2 and TRAF3 in a ubiquitination cascade that activates NIK-dependent alternative NF-kappaB signaling.</a> Nat Immunol. 9 (12), 1364-1370 (2008).</li><li>Annunziata, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequent+engagement+of+the+classical+and+alternative+NF-kappaB+pathways+by+diverse+genetic+abnormalities+in+multiple+myeloma.">Frequent engagement of the classical and alternative NF-kappaB pathways by diverse genetic abnormalities in multiple myeloma.</a> Cancer cell. 12 (2), 115-130 (2007).</li><li>Keats, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promiscuous+mutations+activate+the+noncanonical+NF-kappaB+pathway+in+multiple+myeloma.">Promiscuous mutations activate the noncanonical NF-kappaB pathway in multiple myeloma.</a> Cancer cell. 12 (2), 131-144 (2007).</li><li>Staudt, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+activation+of+NF-kappaB.">Oncogenic activation of NF-kappaB.</a> Cold Spring Harbor perspectives in biology. 2 (6), a000109 (2010).</li><li>Polley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structural+basis+for+IkappaB+kinase+2+activation+via+oligomerization-dependent+trans+auto-phosphorylation.">A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation.</a> PLoS Biol. 11 (6), e1001581 (2013).</li><li>Hinz, M., Scheidereit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IkappaB+kinase+complex+in+NF-kappaB+regulation+and+beyond.">The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond.</a> EMBO Rep. 15 (1), 46-61 (2014).</li><li>Scheidereit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IkappaB+kinase+complexes:+gateways+to+NF-kappaB+activation+and+transcription.">IkappaB kinase complexes: gateways to NF-kappaB activation and transcription.</a> Oncogene. 25 (51), 6685-6705 (2006).</li><li>Luckow, V. A., Lee, S. C., Barry, G. F., Olins, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+infectious+recombinant+baculoviruses+by+site-specific+transposon-mediated+insertion+of+foreign+genes+into+a+baculovirus+genome+propagated+in+Escherichia+coli.">Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli.</a> J Virol. 67 (8), 4566-4579 (1993).</li><li>Polley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Basis+for+the+Activation+of+IKK1/alpha.">Structural Basis for the Activation of IKK1/alpha.</a> Cell reports. 17 (8), 1907-1914 (2016).</li><li>Otwinowski, Z. a. M., W, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+X-ray+Diffraction+Data+Collected+in+Oscillation+Mode.">Processing of X-ray Diffraction Data Collected in Oscillation Mode.</a> Methods in Enzymology. 276 (Macromolecular Crystallography, part A), 307-326 (1997).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+human+IkappaB+kinase+beta+asymmetric+dimer.">Crystal structure of a human IkappaB kinase beta asymmetric dimer.</a> J Biol Chem. 288 (31), 22758-22767 (2013).</li><li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+development+of+Coot.">Features and development of Coot.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).</li><li>McCoy, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phaser+crystallographic+software.">Phaser crystallographic software.</a> Journal of applied crystallography. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).</li><li>Vagin, A. T., Teplyakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MOLREP:+an+automated+program+for+molecular+replacement.">MOLREP: an automated program for molecular replacement.</a> J. Appl. Cryst. 30, 1022-1025 (1997).</li><li>Brunger, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Version+1.2+of+the+Crystallography+and+NMR+system.">Version 1.2 of the Crystallography and NMR system.</a> Nature protocols. 2 (11), 2728-2733 (2007).</li><li>Brunger, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallography+&amp;+NMR+system:+A+new+software+suite+for+macromolecular+structure+determination.">Crystallography &amp; NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological. 54 (Pt 5), 905-921 (1998).</li><li>McRee, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XtalView:+a+visual+protein+crystallographic+software+system+for+X11/Xview.">XtalView: a visual protein crystallographic software system for X11/Xview.</a> J. Mol Graph. 10, 44-47 (1992).</li><li>Schroder, G. F., Levitt, M., Brunger, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+biomolecular+crystallography+with+low-resolution+data.">Super-resolution biomolecular crystallography with low-resolution data.</a> Nature. 464 (7292), 1218-1222 (2010).</li><li>Polley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structural+basis+for+IkappaB+kinase+2+activation+via+oligomerization-dependent+trans+auto-phosphorylation.">A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation.</a> PLoS biology. 11 (6), e1001581 (2013).</li><li>Christopher, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+discovery+of+2-amino-3,5-diarylbenzamide+inhibitors+of+IKK-alpha+and+IKK-beta+kinases.">The discovery of 2-amino-3,5-diarylbenzamide inhibitors of IKK-alpha and IKK-beta kinases.</a> Bioorganic &amp; medicinal chemistry letters. 17 (14), 3972-3977 (2007).</li><li>Karplus, P. A., Diederichs, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+crystallographic+model+and+data+quality.">Linking crystallographic model and data quality.</a> Science. 336 (6084), 1030-1033 (2012).</li><li>Chen, V. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MolProbity:+all-atom+structure+validation+for+macromolecular+crystallography.">MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 1), 12-21 (2010).</li></ol>

פתרון ייצור, התגבשות, מבנה של שני חלבונים IKK קשורים . יצאנו כדי לקבוע את המבנה של IKK1/α עם הרעיון שיהיה זה תרגיל פשוט למדי בהתחשב בניסיון שלנו עם ייצור החלבון IKK2/β, התגבשות ונחישות מבנה... עם זאת, היינו מאוד מופתעים כי אלה שני חלבונים הקשורים התנהגו אחרת לגבי הקלות של התגבשות. למרות ה?...

פעילות גנים ברמת השעתוק NF-κB משפחתו של גורמי שעתוק dimeric נדרשים לפונקציות הסלולר מגוונות, החל דלקת וחסינות הישרדות ומוות. פעילויות אלה נשלטים והטכני תאים, לאובדן של רגולציה מוביל מצבים פתולוגיים שונים, כולל הפרעות אוטואימוניות וסרטן1,2,3. בהיעדר גירוי, הפעילות של NF-κB נשמרים עכבות על ידי חלבונים IκB (מעכב של - κB)4. זירחון של שאריות Ser ספציפי על חלבונים IκB מסמן אותם ubiquitination, proteasomal הבאים השפלה או עיבוד סלקטיבי5. Kinases שני Ser/חמישי מאוד הומולוגיים, IKK2/β, IKK1/α, לשמש הרגולטורים המרכזי של NF-κB פעילויות על-ידי ביצוע אלה זרחון אירועים6,7.
אינטראקציות בין ליגנד קולטן transduces אות דרך סדרה של מתווכים מובילים לקראת הפעלת גורמי NF-κB. באופן כללי ניתן לסווג תהליך האיתות NF-κB שני מסלולים נפרדים – ואמנות קאנונית (אלטרנטיבית)8. הפעילות של IKK2/β בעיקר מסדיר את NF-κB איתות של הנתיב הקנוני חיונית תגובות חיסוניות דלקתיות, מולדת9. תכונה ברורים של מסלול זה היא הפעלה של מהיר ולא קצרת ימים של IKK2/β10 בתוך IKK עד כה מבחינה ביוכימית uncharacterized מורכבות – אוכל מורכב IKK1, IKK2, כמו גם רכיב תקינה, נמו (NF-κB חיוני אפנן )11,12,13. בין שני קטליטי IKK subunits של המתחם IKK, IKK2 הוא בעיקר אחראי14 עבור זירחון של שאריות ספציפית של IκBs טיפוסית (α, - β, & - γ) קשורה NF-κB, וגם של החלבון IκB טיפוסיות, NF-κB1/p105, אשר הוא קודמן של יחידת משנה p505NF-κB. זרחון המושרה ubiquitination ומוביל proteasomal השפלה של IκB (או עיבוד של p105) שחרור, הפעלה של קבוצה ספציפית של NF-κB הדימרים15. פעילות חריגה NF-κB בשל הפונקציה מוסדר בצורה שגויה של IKK2 נצפתה ב סרטן רבים כמו גם כמו הפרעות אוטואימוניות2,3,16.
בניגוד IKK2/β, מווסת פעילות של IKK1/α NF-κB איתות של מסלול קאנונית, שהיא הכרחית עבור פיתוח חסינות. IKK1 phosphorylates שאריות ספציפי של NF-κB2/p100 שלה קטע C-terminal IκBδ, מה שמוביל את העיבוד שלו, את הדור של p52. היווצרות של heterodimer p52:RelB transcriptionally פעיל יוזם תגובה איטית ומתמשכת אותות התפתחותית7,17,18,19,20. מעניין, הדור של p52 גורם מרכזי NF-κB של מסלול זה תלויה באופן ביקורתי גורם נוסף, NF-κB גרימת קינאז (NIK)21,22, אבל לא על IKK2 או נמו. בתאים resting, הרמה של ניק נשאר נמוך עקב שלה24,23,השפלה מתמדת פרוטאוזום תלוית25. על גירוי של תאים על-ידי ליגנדים 'קאנונית' ולאחר בתאים ממאירים מסוימים, ניק הופך התייצב לגייס ולהפעיל IKK1 / α. פעילות קינאז של ניק וגם IKK1 הם חיוניים עבור עיבוד יעיל של p100 לתוך p527. IKK1, ניק phosphorylate serines 3 (Ser866, 870, 872) של NF-κB2/p100 בקטע שלה-IκBδ C-מסוף המוביל את העיבוד שלו את הדור של p52. ההפעלה aberrant של השביל קאנונית היה מעורב ממאירות רבות כולל מיאלומה26,27,28.
מספר מעכבי מאוד יעילה, מדויקת עבור IKK2/β ידועים, למרות אף אחד עד כה יש התברר להיות תרופה יעילה. לעומת זאת, מעכבי IKK1/α-ספציפיות הם דלילים. זה עשויה לנבוע בחלקה שלנו חוסר מידע ביוכימי מבניים על IKK1/α, אשר מגביל את ההבנה שלנו של הבסיס מכניסטית של הפעלה של NF-κB מאת IKK1 תאים, תכנון תרופות רציונלי. המבנים רנטגן של IKK2/β סיפק לנו תובנות לגבי מנגנון ההפעלה של IKK2/β29; עם זאת, מבנים אלה לא יכלו לחשוף כמה שונה לגירויים במעלה להפעיל הפעלה של IKK1/α או IKK2/β להסדיר סטים ברורים של NF-κB פעילויות 30,31. כדי להבין את הבסיס מכניסטית שבבסיס הפונקציה האיתות מובהק של IKK1/α, וכדי ליצור פלטפורמה עבור תכנון רציונלי תרופות, התמקדנו לקביעת המבנה של IKK1/α.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cellfectin/Cellfectin II</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10362100</td>
			<td>Cellfectin is now discontinued, replaced by Cellfectin II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf900 III Insect cell medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12658-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SF9 cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12659017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-IKK1 antibody</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB100-56704</td>
			<td>Previously sold by Imgenex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PentaHis antibody</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>34460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>Nitrocellulose can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford assay reagent</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>500001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28989335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon concentrator</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC801008, UFC803008, UFC201024, UFC203024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound A</td>
			<td>Bayer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calbiochem IKK-inhibitor XII</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>401491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staurosporine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>S4400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLN120B</td>
			<td>Millenium</td>
			<td>Gift item</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPPNP</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A2647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulfate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>51227, 42867, 31404,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulfate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>93593, 81210, 88276, 95904, 81255, 89510, 92897, 81285, 95172</td>
			<td>Some of them are new Cat # on SIGMA catalogue. What we had was originally from Fluka that had different Cat #.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystallization Screens</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Screen I and II (Crystal Screen HT)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index HT</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG/Ion and PEG/Ion2 (PEG/Ion HT)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEGRX 1 and PEGRx 2 (PEGRx HT)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SaltRx 1 and SaltRx 2 (SaltRx HT)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal mounts</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR8-188, 190, 192, 194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synchrotron</td>
			<td>The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy&#8217;s Argonne National Laboratory</td>
			<td>Beamline 19 ID</td>
			<td>The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy&#8217;s Argonne National Laboratory provides ultra-bright, high-energy storage ring-generated X-ray beams for research in almost all scientific disciplines.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a guide to production, crystallization, and structure determination of human ikk1/&#945;

מחלקה של גירויים חוץ-תאית מחייב הפעלה של IKK1/α לזירוז דור של יחידת משנה NF-κB, p52, דרך עיבוד p100 קודמן שלו. פונקציות p52 homodimer או heterodimer עם יחידת משנה נוספת של NF-κB, RelB. הדימרים הללו בתורו לווסת את הביטוי של מאות גנים מעורבים דלקת, הישרדות cell ו מחזור התא. IKK1/α בעיקר נשאר משויך IKK2/β, נמו כמו קומפלקס ternary. עם זאת, בריכה קטנה של זה הוא ציין גם בתור complex(es) נמוך משקל מולקולרי. זה לא ידוע אם הפעילות עיבוד p100 המופעלת על-ידי הפעלה של IKK1/α במרחק גדול יותר או של הבריכה מורכבת קטנים יותר. פעילות המכונן של IKK1/α זוהתה במספר סוגי סרטן ומחלות דלקתיות. כדי להבין את המנגנון של הפעלה של IKK1/α, ולאפשר את השימוש בו כמטרה סמים, אנחנו הביע IKK1 רקומביננטי/α במערכות מארח שונים, כגון e. coli, חרקים, ואת תאי יונקים. שהצלחנו להביע מסיסים IKK1 α ב baculovirus נגוע תאים חרקים, קבלת mg כמויות של פרוטאין טהור מאוד, אך איבדו מחוזקן. בנוכחות מעכבי, וקביעת מבנה שלה. כאן, אנו מתארים את השלבים המפורטים כדי לייצר חלבון רקומביננטי להתגבשותו, נחישותה מבנה הגביש רנטגן.

שיבוט וביטוי של מבנים שונים של IKK1/α אורך מלא ש-ikk1 האנושי/α היה משובטים לתוך הביטוי baculovirus וקטור pFastBacHTa בתוך למושבכם ההגבלה EcoRI ו- NotI להשיג של N-מסוף hexa-היסטידין מתויגות IKK1. היתה אפשרות להסיר את התג על ידי אס פרוטאז עיכול. כיוון אורך מלא IKK1/α מכיל אזורים גמישים בשני ה...

Watch this Scientific Journal Video about A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/ÃŽÂ± at JoVE.com

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

קינאז IκB 1/α (IKK1/α CHUK) הוא חלבון Ser/חמישי קינאז מעורב מספר עצום של פעילויות הסלולר בעיקר באמצעות הפעלה של גורמי שעתוק NF-κB. כאן, אנו מתארים את השלבים העיקריים הדרושים כדי להפוך את ייצור מכשור לקביעת קשיות ומבנה הגביש של חלבון זה.

מדריך הייצור, התגבשות ונחישות מבנה של IKK1 האנושי/α

A class of extracellular stimuli requires activation of IKK1/&#945; to induce generation of an NF-&#954;B subunit, p52, through processing of its ...

מטרת הליך זה היא לספק הדרכה לייצור, התגבשות ונחישות מבנית של האדם IKK1-אלפא על מנת להבין את הבסיס המקניסטי של פונקציית האיתות שלה ולהקים פלטפורמות לעיצוב תרופות רציונלי. שיטה זו אמורה לסייע לחוקרים לקבוע את המבנה של IKK1, אשר יספק תשובות לשאלות מפתח בתחום האיתות החיסוני. טכניקה זו מתארת נתיב יעיל להשגת גבישים של חלבוני IKK, שהם עקשנים למדי להתגבש ולספק מידע קריטי שונים להתגבר על צווארי בקבוק בקביעת המבנים.בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו, כי יצירת כמויות מיליגרם של חלבון מסיס, מתנהג היטב, דורש ביטוי שלה בתאי חרקים, התגבשות יכולה להיעשות תחת רק חלון צר מאוד של תנאים. הליך ההחלפה המולקולרית המשמש לקביעת המבנה של IKK1 יכול להיות גם מסובך מאוד, במיוחד בשל מאפיין הסטה לקוי של הגבישים, לא באתר של היחידה האסימטרית המכילה מולקולות IKK1 רבות בהיעדר מודלים מתאימים לחיפוש. הדגימו את הנהלים יהיו קייל שומט וסונג'ילה הוצ'קיס, סטודנטים מהמעבדה שלי.ביום הראשון, צלחת Sf9 תאים בשני מיליליטר של Sf903 תא חרק בינוני, בכל באר של צלחת שש בארות דגירה ב 27 מעלות צלזיוס. מעבר התאים כאשר הם מגיעים לצפיפות של 2-3 פעמים 10 לשישה תאים למיליליטר בהשעיה על ידי דילול זה למדיה טרייה, בצפיפות של בערך שש פעמים 10 עד חמש. ביום השני, לדלל שמונה microliters של Sf9 reagent transfection ב 100 microliters של SF-903 או מדיום חרקים של גרייס.ואז מערבולת את התערובת בקצרה. בצינור נפרד, לדלל מיקרוגרם אחד של bacmid רקומביננטי מטוהר ערכה ב 100 microliters של אותו מדיום. ערבבו את הדנ"א המדולל ואת ה-transfection reagent.לאחר דגירה בטמפרטורת החדר במשך 15 עד 30 דקות, להסיר את המדיום מן האגם. לאחר מכן מוסיפים מיליליטר אחד של מדיום טרי. לאחר מכן, מוסיפים את תערובת reagent transfection DNA מדולל dropwise על התאים, התאמת גודל טיפה כך שהוא לא לנתק תאים חסידים.לאחר שש שעות, להוסיף 1.5 מיליליטר של מדיום טרי על גבי התאים. דגירה התאים ב 27 מעלות צלזיוס, בדיקת בארות מעת לעת כל 12 שעות לסימנים של זיהום ויראלי. ביום החמישי, להסיר את התאים המכילים בינוני, 60 עד 72 שעות לאחר ההדבקה.לאחר העברת המדיום לצינורות, צנטריפוגה במשך חמש דקות ב 500 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס. בסיום, שמור את העל-טבעי, שהוא מחסנית הווירוסים P1. ביום הראשון, תן שימוש חוזר כדורי התא שלו-IKK1 שהוכן בעבר ב 40 מיליליטר של חיץ תזה.מניחים את ההשעיה התא על קרח lyse התאים על ידי sonication ב 60%-70% מחזורי חובה וחמישה עד 10 פולסים של משך 30 שניות במרווח גדול מדקה אחת. להבהיר את lysate על ידי צנטריפוגה גדול או שווה ל 28, 000 גרם במשך 45 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הכנת שף ניקל-NTA אגרוז, על פי פרוטוקול הטקסט, לחמק חלבון אלפא IKK1 מתויג שלו תחת זרימת הכבידה באמצעות 20 מיליליטר של מאגר אלוטיון.לאסוף שבר אחד עד 1.5 מיליליטר. לאחר שילוב השברים המכילים את החלבון, לעכל את המדגם עם פרוטאז TEV לילה בארבע מעלות צלזיוס. בבוקרו של היום השני, הדגירה את החלבון עם מילימולר אחד של ATP, בנוכחות מגנזיום כלורי, בטא גליצרופוספט, נתרן פלואוריד ונתרן אורתוובנה במשך שעה אחת ב 27 מעלות צלזיוס.לאחר הדגירה, מסננים את ת פתרון החלבון באמצעות מסנן 0.45 מיקרון. לאחר מכן לטעון כשישה מיליליטר של המדגם על לעמודת אי הכללת גודל הכנה 120 מיליליטר, מחובר למערכת כרומטוגרפיה נוזלית אוטומטית. לאחר שיווי המשקל, הפעל את הכרומטוגרפיה של אי-הכללת הגודל בקצב זרימה של מיליליטר לדקה ואאסוף שברים של שני מיליליטר.במהלך הריצה, לפקח על elution ב 280 ו 254 ננומטר. לאחר משיכת שברים טהורים, להתרכז 30 קילודלטון, צנטריפוגה ניתוק משקל מולקולרי, בעקבות הוראות היצרן. לאחר מכן מחלקים 25 מיקרוליטר aliquots של חלבון מרוכז והקפאת פלאש בחנקן נוזלי.באמצעות רובוט, פיפטה 80 עד 100 מיקרוליטרים של מתגבש reagent לתוך המאגר של צלחת 96 באר. באמצעות רובוט התגבשות, לוותר ולערבב 0.2 כדי 0.25 microliters של IKK1 ואת קומפלקס מעכב שלה עם אותו נפח של פתרון המאגר. מיד לאחר הגדרת הטיפות, לאטום כל צלחת עם סרטים ברורים אופטית, כדי למנוע אידוי.דגירה צלחת אחת ב 18 מעלות צלזיוס והצלחת השנייה בארבע מעלות צלזיוס בחדר קר. השתמש במיקרוסקופ סטריאו עם מקטב כדי לבדוק את המראה של גביש בכל טיפה, כל יום, במשך שבעת הימים הראשונים ולאחר מכן במרווחי זמן ארוכים יותר. לאחר הכנת IKK1 ואת קומפלקס המעכבים שלה כפי שתואר קודם לכן, להעביר את הפתרונות גם לכל באר של צלחת 24 היטב.מניחים אחד עד 1.5 microliters של פתרון גם על כיסוי זכוכית נקי. מוסיפים נפח שווה של IKK1 ואת קומפלקס המעכבים שלו למכסה הזכוכית ומערבבים בעדינות על ידי צינור למעלה ולמטה שלוש עד ארבע פעמים. לאחר החלת גריז על הטבעות של כל באר של הצלחת, להפוך את כיסוי הזכוכית מעל ומקום על היטב בהתאמה עם מטלפים.ואז לאטום את הגם על ידי לחיצה על כיסוי הזכוכית. לאחר הגדרת כל הטיפות בצלחת 24 באר, דגירה בחדר הקר, בחושך. מדי פעם לבדוק את הטיפות תחת מיקרוסקופ עבור המראה והצמיחה של גבישים.לאחר השלמת צמיחת הגביש, הסר בעדינות את כיסוי הזכוכית המכיל את הגביש והצב אותו על משטח מוצק עם טיפת הגביש הפונה כלפי מעלה. מוסיפים בעדינות 10 מיקרוליטרים של קריו פתרון על גבי הירידה ומערבבים בעדינות על ידי צינורות כך שלא נוגעים בגביש. באמצעות מיקרוסקופ, להסיר לאט קצת נוזל מהקריסטל ולשמור על חמישה עד שמונה microliters של הפתרון.מוסיפים בעדינות 2.5 עד 4 מיקרוליטרים של תוסף cryo B על הירידה ומערבבים בעדינות על ידי צינורות. מכסים את כיסוי הזכוכית בצלחת פטרי קטנה כדי למנוע זרימת אוויר ישירה מעל הקריסטל. לאחר המתנה של חמש דקות, בחרו בזהירות גביש אחד מהירידה בהקפאה מתאימה המותקנת על בסיס מתאים.פלאש להקפיא את הגביש בחנקן נוזלי. לאחר מכן אחסנו את הגביש המכיל קריולואופ בדסקית שקועה בחנקן נוזלי בבקבוק דיואר עד שהם מוכנים לדיפראקציה של קרני רנטגן בסנכרון. לאחר ניסויים נרחבים עם מספר גרסאות IKK1 שונות, קריסטלים הושגו עם מבנה אחד חצוץ, אשר הציג תכונות רנטגן מתאימות רק בנוכחות מעכב IKK XII.ההשפעה המשולבת של נתוני רנטגן ברזולוציה נמוכה עם חזקות חלשות, מספר רב של מולקולות IKK1 ביחידה הא-סימטרית וריאציה קונפורמית של המודל המונומרי-דימרי IKK1, בהשוואה לדגמי IKK2 ידועים, הקשו על השגת פתרון החלפה מולקולרית, IKK1, ולקבוע את המבנה שלו. מבנים שונים של IKK2 הצביעו על אוריינטציה בין-מונומרית שונה בתוך המטבעות שלה, כך שהמרחק בין הפחמנים האלפאים של P578 בשני תחומי הקינאז, בארבעה דגמים עמומים יותר, נע בין 39 ל -61 אנגסטרום. השגת מודל חיפוש שימושי התאפשרה בגלל מפת המיקרוסקופיה קריואלקטרון ברזולוציה נמוכה ומודל דיוק גבוה של תחומי IKK1 שיכול להיווצר בהתבסס על מבנה IKK2 ברזולוציה גבוהה.הדגם הראשוני הצביע על אוריינטציה של תחום kinase מסתובב 24 מעלות יחסית לזה של מונומר IKK2 ופתיחה N-מסוף של 58 אנגסטרום. באמצעות אחד העמילים עם פתיחת 52 אנגסטרום כמודל, שישה dimers ביחידה אסימטרית היו ממוקמים. לאחר השליטה, טכניקה זו יכולה להתבצע בתוך כמה חודשים, אם היא מבוצעת כראוי.בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי השגת חלבון מסיס, פעיל ומתנהג היטב הוא הצעד הקריטי הראשון. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה צריך הבנה כללית טובה של כל השלבים שיש לעקוב בפירוט מדוקדק, כדי להצליח להתגבש ולקבוע את המבנה של חלבון IKK1. לימוד הליך זה, יש עדיין מבנים של חלבונים משפחתיים אחרים IKK כי ניתן לקבוע גם על מנת לענות על שאלות נוספות על קינאז-מיתום איתות.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/&#945;

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, ביטוי, טיהור, התגבשות של Transporter סרוטונין האדם Bound כדי<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Combining Wet and Dry Lab Techniques to Guide the Crystallization of Large Coiled-coil Containing Proteins

שילוב רטוב טכניקות מעבדה יבשות כדי להנחות את ההתגבשות של חלבונים מפותל, סליל גדולים המכיל

Obtaining crystals for structure determination can be a difficult and time consuming proposition for any protein. Coiled-coil proteins and domains are ...

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

הפקה, התגבשות וקביעת מבנה<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-1 באמצעות Microseeding ואבץ-SAD

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

דיוק גבוהה סריג ברמת מולקולה בודדת עבור קביעת מבנה ביומולקולה

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO

הפקה, התגבשות וקביעת מבנה של התחום המחייב של ה-IKK של נמו

NEMO is a scaffolding protein which plays an essential role in the NF-&#954;B pathway by assembling the IKK-complex with the kinases IKK&#945; and ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

התגבשות וקביעת מבנה של אנזים:קומפלקס מצע על ידי התגבשות סדרתית בשבב מיקרופלואידי רב-תכליתי

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

The Extraction of Liver Glycogen Molecules for Glycogen Structure Determination

Liver glycogen is a hyperbranched glucose polymer that is involved in the maintenance of blood sugar levels in animals. The properties of glycogen are ...

Efficient and Scalable Production of Full-length Human Huntingtin Variants in Mammalian Cells using a Transient Expression System

Full-length huntingtin (FL HTT) is a large (aa 1-3,144), ubiquitously expressed, polyglutamine (polyQ)-containing protein with a mass of approximately 350 ...

High-Throughput Screening for Protein Crystallization

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography (Video) | JoVE 

סינון בתפוקה גבוהה להשגת פגיעות קריסטליות לקריסטלוגרפיה של חלבונים

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into ...

A Fibrinolytic Enzyme-Based Method to Study Cerebral Thrombus Cell Components

A Comprehensive Approach to Analyze the Cell Components of Cerebral Blood Clots

A Novel Method for Comprehensive Cell Component Analysis of Cerebral Blood Clots (Video) | JoVE

גישה מקיפה לניתוח מרכיבי התא של קרישי דם מוחיים

Cerebral thrombosis, a blood clot in a cerebral artery or vein, is the most common type of cerebral infarction. The study of the cell components of ...