Name: a guide to production, crystallization, and structure determination of human ikk1/&#945;
Uploaded: 2018-11-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/ÃŽÂ± at JoVE.com

Ringraziamo il personale presso il beamlines 19ID, 24ID e 13ID alla Advanced Photon fonte, Lemont, IL, per il supporto durante la raccolta di dati su vari cristalli. Siamo grati a Dmitry Lyumkis, Istituto di Salk per noi il recupero la mappa di cryo-EM bassa risoluzione alle fasi iniziali di EM mappa/modello edificio, che è stato usato per costruire il modello di ricerca molecolare sostituzione IKK1 iniziale. La ricerca che porta a questi risultati ha ricevuto finanziamenti da sovvenzioni NIH AI064326, CA141722 e GM071862 a GG. SP è attualmente un Wellcome Trust DBT India intermedio Fellow.

1. preparazione del Virus ricombinante adatto a larga scala espressione di IKK1/α
<ol><li>
Preparazione di virus P1 32<ol>
<li>Giorno 1: Le celle di piastra Sf9 (~ 6 X 105) (passaggio numero meno di 10) in 2 mL di Sf900 III insetto medium cellulare in ciascuna di una piastra a 6 pozzetti ed incubare a 27 ° C. Cellule del passaggio quando raggiungono una densità di 2-3 X 106 cellule per mL in sospensione diluendo in media freschi ad una densità di ~ 6 X ...

<ol>
	<li>Xia, Y., Shen, S., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB,+an+active+player+in+human+cancers.">NF-kappaB, an active player in human cancers.</a> Cancer immunology research. 2 (9), 823-830 (2014).</li><li>Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity,+inflammation,+and+cancer.">Immunity, inflammation, and cancer.</a> Cell. 140 (6), 883-899 (2010).</li><li>Ben-Neriah, Y., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+meets+cancer,+with+NF-kappaB+as+the+matchmaker.">Inflammation meets cancer, with NF-kappaB as the matchmaker.</a> Nature immunology. 12 (8), 715-723 (2011).</li><li>Hinz, M., Scheidereit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IkappaB+kinase+complex+in+NF-kappaB+regulation+and+beyond.">The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond.</a> EMBO reports. 15 (1), 46-61 (2014).</li><li>Karin, M., Ben-Neriah, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+meets+ubiquitination:+the+control+of+NF-[kappa]B+activity.">Phosphorylation meets ubiquitination: the control of NF-[kappa]B activity.</a> Annu Rev Immunol. 18, 621-663 (2000).</li><li>Ghosh, S., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Missing+pieces+in+the+NF-kappaB+puzzle.">Missing pieces in the NF-kappaB puzzle.</a> Cell. 109, S81-S96 (2002).</li><li>Sun, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+noncanonical+NF-kappaB+pathway.">The noncanonical NF-kappaB pathway.</a> Immunol Rev. 246 (1), 125-140 (2012).</li><li>Bonizzi, G., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+NF-kappaB+activation+pathways+and+their+role+in+innate+and+adaptive+immunity.">The two NF-kappaB activation pathways and their role in innate and adaptive immunity.</a> Trends Immunol. 25 (6), 280-288 (2004).</li><li>DiDonato, J. A., Hayakawa, M., Rothwarf, D. M., Zandi, E., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cytokine-responsive+IkappaB+kinase+that+activates+the+transcription+factor+NF-kappaB.">A cytokine-responsive IkappaB kinase that activates the transcription factor NF-kappaB.</a> Nature. 388 (6642), 548-554 (1997).</li><li>Werner, S. L., Barken, D., Hoffmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulus+specificity+of+gene+expression+programs+determined+by+temporal+control+of+IKK+activity.">Stimulus specificity of gene expression programs determined by temporal control of IKK activity.</a> Science. 309 (5742), 1857-1861 (2005).</li><li>Zandi, E., Rothwarf, D. M., Delhase, M., Hayakawa, M., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IkappaB+kinase+complex+(IKK)+contains+two+kinase+subunits,+IKKalpha+and+IKKbeta,+necessary+for+IkappaB+phosphorylation+and+NF-kappaB+activation.">The IkappaB kinase complex (IKK) contains two kinase subunits, IKKalpha and IKKbeta, necessary for IkappaB phosphorylation and NF-kappaB activation.</a> Cell. 91 (2), 243-252 (1997).</li><li>Rothwarf, D. M., Zandi, E., Natoli, G., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IKK-gamma+is+an+essential+regulatory+subunit+of+the+IkappaB+kinase+complex.">IKK-gamma is an essential regulatory subunit of the IkappaB kinase complex.</a> Nature. 395 (6699), 297-300 (1998).</li><li>Yamaoka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementation+cloning+of+NEMO,+a+component+of+the+IkappaB+kinase+complex+essential+for+NF-kappaB+activation.">Complementation cloning of NEMO, a component of the IkappaB kinase complex essential for NF-kappaB activation.</a> Cell. 93 (7), 1231-1240 (1998).</li><li>Li, Z. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IKKbeta+subunit+of+IkappaB+kinase+(IKK)+is+essential+for+nuclear+factor+kappaB+activation+and+prevention+of+apoptosis.">The IKKbeta subunit of IkappaB kinase (IKK) is essential for nuclear factor kappaB activation and prevention of apoptosis.</a> J Exp Med. 189 (11), 1839-1845 (1999).</li><li>Hayden, M. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shared+principles+in+NF-kappaB+signaling.">Shared principles in NF-kappaB signaling.</a> Cell. 132 (3), 344-362 (2008).</li><li>Sun, S. C., Chang, J. H., Jin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+nuclear+factor-kappaB+in+autoimmunity.">Regulation of nuclear factor-kappaB in autoimmunity.</a> Trends Immunol. 34 (6), 282-289 (2013).</li><li>Claudio, E., Brown, K., Park, S., Wang, H., Siebenlist, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAFF-induced+NEMO-independent+processing+of+NF-kappa+B2+in+maturing+B+cells.">BAFF-induced NEMO-independent processing of NF-kappa B2 in maturing B cells.</a> Nat Immunol. 3 (10), 958-965 (2002).</li><li>Senftleben, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+by+IKKalpha+of+a+second,+evolutionary+conserved,+NF-kappa+B+signaling+pathway.">Activation by IKKalpha of a second, evolutionary conserved, NF-kappa B signaling pathway.</a> Science. 293 (5534), 1495-1499 (2001).</li><li>Coope, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40+regulates+the+processing+of+NF-kappaB2+p100+to+p52.">CD40 regulates the processing of NF-kappaB2 p100 to p52.</a> EMBO J. 21 (20), 5375-5385 (2002).</li><li>Dejardin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lymphotoxin-beta+receptor+induces+different+patterns+of+gene+expression+via+two+NF-kappaB+pathways.">The lymphotoxin-beta receptor induces different patterns of gene expression via two NF-kappaB pathways.</a> Immunity. 17 (4), 525-535 (2002).</li><li>Xiao, G., Fong, A., Sun, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+p100+processing+by+NF-kappaB-inducing+kinase+involves+docking+IkappaB+kinase+alpha+(IKKalpha)+to+p100+and+IKKalpha-mediated+phosphorylation.">Induction of p100 processing by NF-kappaB-inducing kinase involves docking IkappaB kinase alpha (IKKalpha) to p100 and IKKalpha-mediated phosphorylation.</a> The Journal of biological chemistry. 279 (29), 30099-30105 (2004).</li><li>Xiao, G., Harhaj, E. W., Sun, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB-inducing+kinase+regulates+the+processing+of+NF-kappaB2+p100.">NF-kappaB-inducing kinase regulates the processing of NF-kappaB2 p100.</a> Molecular cell. 7 (2), 401-409 (2001).</li><li>Qing, G., Qu, Z., Xiao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+basally+translated+NF-kappaB-inducing+kinase+(NIK)+protein+functions+as+a+molecular+switch+of+processing+of+NF-kappaB2+p100.">Stabilization of basally translated NF-kappaB-inducing kinase (NIK) protein functions as a molecular switch of processing of NF-kappaB2 p100.</a> J Biol Chem. 280 (49), 40578-40582 (2005).</li><li>Zarnegar, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncanonical+NF-kappaB+activation+requires+coordinated+assembly+of+a+regulatory+complex+of+the+adaptors+cIAP1,+cIAP2,+TRAF2+and+TRAF3+and+the+kinase+NIK.">Noncanonical NF-kappaB activation requires coordinated assembly of a regulatory complex of the adaptors cIAP1, cIAP2, TRAF2 and TRAF3 and the kinase NIK.</a> Nat Immunol. 9 (12), 1371-1378 (2008).</li><li>Vallabhapurapu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonredundant+and+complementary+functions+of+TRAF2+and+TRAF3+in+a+ubiquitination+cascade+that+activates+NIK-dependent+alternative+NF-kappaB+signaling.">Nonredundant and complementary functions of TRAF2 and TRAF3 in a ubiquitination cascade that activates NIK-dependent alternative NF-kappaB signaling.</a> Nat Immunol. 9 (12), 1364-1370 (2008).</li><li>Annunziata, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequent+engagement+of+the+classical+and+alternative+NF-kappaB+pathways+by+diverse+genetic+abnormalities+in+multiple+myeloma.">Frequent engagement of the classical and alternative NF-kappaB pathways by diverse genetic abnormalities in multiple myeloma.</a> Cancer cell. 12 (2), 115-130 (2007).</li><li>Keats, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promiscuous+mutations+activate+the+noncanonical+NF-kappaB+pathway+in+multiple+myeloma.">Promiscuous mutations activate the noncanonical NF-kappaB pathway in multiple myeloma.</a> Cancer cell. 12 (2), 131-144 (2007).</li><li>Staudt, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+activation+of+NF-kappaB.">Oncogenic activation of NF-kappaB.</a> Cold Spring Harbor perspectives in biology. 2 (6), a000109 (2010).</li><li>Polley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structural+basis+for+IkappaB+kinase+2+activation+via+oligomerization-dependent+trans+auto-phosphorylation.">A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation.</a> PLoS Biol. 11 (6), e1001581 (2013).</li><li>Hinz, M., Scheidereit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IkappaB+kinase+complex+in+NF-kappaB+regulation+and+beyond.">The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond.</a> EMBO Rep. 15 (1), 46-61 (2014).</li><li>Scheidereit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IkappaB+kinase+complexes:+gateways+to+NF-kappaB+activation+and+transcription.">IkappaB kinase complexes: gateways to NF-kappaB activation and transcription.</a> Oncogene. 25 (51), 6685-6705 (2006).</li><li>Luckow, V. A., Lee, S. C., Barry, G. F., Olins, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+infectious+recombinant+baculoviruses+by+site-specific+transposon-mediated+insertion+of+foreign+genes+into+a+baculovirus+genome+propagated+in+Escherichia+coli.">Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli.</a> J Virol. 67 (8), 4566-4579 (1993).</li><li>Polley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Basis+for+the+Activation+of+IKK1/alpha.">Structural Basis for the Activation of IKK1/alpha.</a> Cell reports. 17 (8), 1907-1914 (2016).</li><li>Otwinowski, Z. a. M., W, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+X-ray+Diffraction+Data+Collected+in+Oscillation+Mode.">Processing of X-ray Diffraction Data Collected in Oscillation Mode.</a> Methods in Enzymology. 276 (Macromolecular Crystallography, part A), 307-326 (1997).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+human+IkappaB+kinase+beta+asymmetric+dimer.">Crystal structure of a human IkappaB kinase beta asymmetric dimer.</a> J Biol Chem. 288 (31), 22758-22767 (2013).</li><li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+development+of+Coot.">Features and development of Coot.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).</li><li>McCoy, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phaser+crystallographic+software.">Phaser crystallographic software.</a> Journal of applied crystallography. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).</li><li>Vagin, A. T., Teplyakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MOLREP:+an+automated+program+for+molecular+replacement.">MOLREP: an automated program for molecular replacement.</a> J. Appl. Cryst. 30, 1022-1025 (1997).</li><li>Brunger, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Version+1.2+of+the+Crystallography+and+NMR+system.">Version 1.2 of the Crystallography and NMR system.</a> Nature protocols. 2 (11), 2728-2733 (2007).</li><li>Brunger, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallography+&amp;+NMR+system:+A+new+software+suite+for+macromolecular+structure+determination.">Crystallography &amp; NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological. 54 (Pt 5), 905-921 (1998).</li><li>McRee, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XtalView:+a+visual+protein+crystallographic+software+system+for+X11/Xview.">XtalView: a visual protein crystallographic software system for X11/Xview.</a> J. Mol Graph. 10, 44-47 (1992).</li><li>Schroder, G. F., Levitt, M., Brunger, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+biomolecular+crystallography+with+low-resolution+data.">Super-resolution biomolecular crystallography with low-resolution data.</a> Nature. 464 (7292), 1218-1222 (2010).</li><li>Polley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structural+basis+for+IkappaB+kinase+2+activation+via+oligomerization-dependent+trans+auto-phosphorylation.">A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation.</a> PLoS biology. 11 (6), e1001581 (2013).</li><li>Christopher, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+discovery+of+2-amino-3,5-diarylbenzamide+inhibitors+of+IKK-alpha+and+IKK-beta+kinases.">The discovery of 2-amino-3,5-diarylbenzamide inhibitors of IKK-alpha and IKK-beta kinases.</a> Bioorganic &amp; medicinal chemistry letters. 17 (14), 3972-3977 (2007).</li><li>Karplus, P. A., Diederichs, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+crystallographic+model+and+data+quality.">Linking crystallographic model and data quality.</a> Science. 336 (6084), 1030-1033 (2012).</li><li>Chen, V. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MolProbity:+all-atom+structure+validation+for+macromolecular+crystallography.">MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 1), 12-21 (2010).</li></ol>

Soluzione di produzione, la cristallizzazione e la struttura delle due proteine IKK relative Abbiamo precisato per determinare la struttura di cristallo dei raggi x di IKK1/α con la nozione che sarebbe stato un esercizio relativamente semplice, dato la nostra esperienza con la produzione della proteina IKK2/β, cristallizzazione e determinazione della struttura. Tuttavia, siamo rimasti molto sorpresi che queste due proteine correlate si comportavano in modo molto diverso per quanto riguarda la facili...

Attività trascrizionali della famiglia di fattori trascrizionali dimerica NF-κB sono necessari per diverse funzioni cellulari, che vanno da infiammazione ed immunità alla sopravvivenza e morte. Queste attività sono rigorosamente controllate nelle cellule e una perdita di regolamento porta a varie circostanze patologiche, compreso i disordini autoimmuni e cancro1,2,3. In assenza di uno stimolo, l'attività di NF-κB sono tenute inibita di IκB (inibitore di-f-κB) proteine4. La fosforilazione di specifici residui di Ser IκB proteine marchia per ubiquitinazione e degradazione proteasomica successive o elaborazione selettiva5. Due altamente omologo Ser/Thr chinasi, IKK2/β e IKK1/α, agiscono come regolatori centrale delle attività di NF-κB effettuando questi eventi di fosforilazione6,7.
Interazioni tra un ligando e un recettore trasduce un segnale attraverso una serie di mediatori che portano all'attivazione di fattori di n-f-κB. Il processo di segnalazione di NF-κB possa essere classificato in due percorsi distinti – canoniche e non canoniche (alternativi)8. L'attività di IKK2/β regola principalmente la segnalazione di n-f-κB del pathway canonico che è essenziale per le risposte immunitarie infiammatorie e innata9. Una caratteristica distintiva di questa via è un'attivazione rapida e di breve durata di IKK2/β10 all'interno di un complesso di IKK finora biochimicamente atipici — presunto per essere composto di IKK1 e IKK2, nonché un componente regolamentazione, NEMO (n-f-κB modulatore essenziale )11,12,13. Tra le due subunità catalitiche IKK del complesso IKK, IKK2 è principalmente responsabile14 per la fosforilazione di specifici residui di prototipo IκBs (α, - β e γ-) associati a NF-κB e anche una proteina IκB atipica, NF-κB1/p105, che è un precursore della subunità p50 NF-κB5. Fosforilazione indotta ubiquitinazione e degradazione proteasomal di IκB (o elaborazione di p105) conduce al rilascio e attivazione di un set specifico di n-f-κB dimeri15. Attività di NF-κB aberrante a causa di cattiva regolazione funzione di IKK2 è stato osservato in molti cancri pure come in disordini autoimmuni2,3,16.
In contrasto con IKK2/β, attività di IKK1/α regola NF-κB segnalazione della via non canonica, che è essenziale per lo sviluppo e l'immunità. IKK1 fosforila residui specifici di NF-κB2/p100 sul relativo segmento C-terminale IκBδ, che conduce alla sua elaborazione e la generazione di p52. La formazione dell'eterodimero p52:RelB trascrizionalmente attiva inizia una risposta lenta e sostenuta a segnali dello sviluppo7,17,18,19,20. Interessante, la generazione del centrale p52 fattore NF-κB di questa via è criticamente dipendente da un altro fattore, n-f-κB inducendo chinasi (NIK)21,,22, ma non sul IKK2 o NEMO. Nelle cellule a riposo, il livello di NIK rimane basso a causa della sua costante degradazione proteasoma-dipendente23,24,25. Stimolazione delle cellule da ligandi 'non canoniche' e in alcune cellule maligne, NIK diventa stabilizzato per reclutare e attivare IKK1 / α. le attività della chinasi di NIK e di IKK1 sono essenziali per un'elaborazione efficiente di p100 in p527. IKK1 e NIK fosforilare tre serine (Ser866, 870 e 872), NF-κB2/P100 sul relativo segmento IκBδ C-terminale che porta l'elaborazione e la generazione di p52. Attivazione aberrante del pathway non canonico è stato implicato in molte malignità compreso il mieloma multiplo26,27,28.
Diversi inibitori altamente efficienti e specifici per IKK2/β sono noti, anche se nessuno finora si sono rivelati essere un farmaco efficace. Al contrario, gli inibitori IKK1/α-specific sono sparsi. Questo può derivare in parte dalla nostra mancanza di informazione strutturale e biochimica su IKK1/α, che limita la nostra comprensione della base meccanicistica dell'attivazione di NF-κB di IKK1 nelle cellule e progettazione razionale dei farmaci. Le strutture dei raggi x di IKK2/β ci ha fornito con intuizioni il meccanismo di attivazione di IKK2/β29; Tuttavia, queste strutture non ha potevano rivelare come i diversi stimoli a Monte innescare l'attivazione di IKK1/α o β/IKK2 regolare insiemi distinti di n-f-κB attività 30,31. Per capire la base meccanicistica sottostante la funzione di segnalazione distinta di IKK1/α e a istituire una piattaforma per la progettazione razionale dei farmaci, ci siamo concentrati sulla determinazione della struttura di IKK1/α.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cellfectin/Cellfectin II</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10362100</td>
			<td>Cellfectin is now discontinued, replaced by Cellfectin II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf900 III Insect cell medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12658-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SF9 cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12659017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-IKK1 antibody</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB100-56704</td>
			<td>Previously sold by Imgenex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PentaHis antibody</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>34460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>Nitrocellulose can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford assay reagent</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>500001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28989335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon concentrator</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC801008, UFC803008, UFC201024, UFC203024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound A</td>
			<td>Bayer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calbiochem IKK-inhibitor XII</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>401491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staurosporine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>S4400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLN120B</td>
			<td>Millenium</td>
			<td>Gift item</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPPNP</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A2647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulfate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>51227, 42867, 31404,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulfate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>93593, 81210, 88276, 95904, 81255, 89510, 92897, 81285, 95172</td>
			<td>Some of them are new Cat # on SIGMA catalogue. What we had was originally from Fluka that had different Cat #.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystallization Screens</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Screen I and II (Crystal Screen HT)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index HT</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG/Ion and PEG/Ion2 (PEG/Ion HT)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEGRX 1 and PEGRx 2 (PEGRx HT)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SaltRx 1 and SaltRx 2 (SaltRx HT)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal mounts</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR8-188, 190, 192, 194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synchrotron</td>
			<td>The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy&#8217;s Argonne National Laboratory</td>
			<td>Beamline 19 ID</td>
			<td>The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy&#8217;s Argonne National Laboratory provides ultra-bright, high-energy storage ring-generated X-ray beams for research in almost all scientific disciplines.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a guide to production, crystallization, and structure determination of human ikk1/&#945;

Una classe di stimoli extracellulari richiede l'attivazione di IKK1/α per indurre la generazione di una subunità di NF-κB, p52, attraverso l'elaborazione del suo precursore p100. P52 funzioni come un omodimero o un eterodimero con un'altra subunità di NF-κB, RelB. Questi dimeri a loro volta regolano l'espressione di centinaia di geni coinvolti nel ciclo cellulare, la sopravvivenza delle cellule e l'infiammazione. IKK1/α rimane principalmente associato con IKK2/β e NEMO come un complesso ternario. Tuttavia, una piccola piscina di esso inoltre è osservata come un complex(es) di basso peso molecolare. Non è noto se l'attività di elaborazione p100 è attivato dall'attivazione di IKK1/α all'interno il più grande o più piccola piscina complessa. Attività costitutiva di IKK1/α è stato rilevato in diversi tumori e malattie infiammatorie. Per capire il meccanismo di attivazione di IKK1/α e consentirne l'utilizzo come un bersaglio di farmaci, abbiamo espresso IKK1/α ricombinante in sistemi host diversi, quali Escherichia coli, insetto e cellule di mammifero. Siamo riusciti a esprimere solubile IKK1/α in baculovirus infetta cellule di insetto, ottenere quantitativi di mg di proteina altamente pura, si cristallizzano in presenza di inibitori e determinare la sua struttura cristallina ai raggi x. Qui, descriviamo la procedura dettagliata per produrre la proteina ricombinante, sua cristallizzazione e sua determinazione di struttura di cristallo dei raggi x.

Clonazione ed espressione di diversi costrutti di IKK1/α Figura intera che umana IKK1/α è stato clonato nel baculovirus espressione vettoriale pFastBacHTa all'interno dei suoi siti di restrizione EcoRI e NotI per ottenere un N-terminale hexa-istidina etichetta IKK1. Il tag poteva essere rimossi da digestione della proteasi TEV. Poiché integrale IKK1/α contiene regioni flessibile su entrambe le estremità e regioni flessibili rendono solitamente una proteina diffic...

Watch this Scientific Journal Video about A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/ÃŽÂ± at JoVE.com

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

IκB Kinase 1/α (IKK1/α CHUK) è una proteina di Ser/Thr chinasi che è coinvolto in una miriade di attività cellulari principalmente attraverso l'attivazione di fattori di trascrizione NF-κB. Qui, descriviamo i principali passaggi necessari per la produzione e la determinazione di struttura di cristallo di questa proteina.

Una guida per la produzione, la cristallizzazione e la determinazione della struttura di umana IKK1/α

A class of extracellular stimuli requires activation of IKK1/&#945; to induce generation of an NF-&#954;B subunit, p52, through processing of its ...

L'obiettivo di questa procedura è fornire indicazioni per la produzione, la cristallizzazione e la determinazione strutturale dell'IKK1-alfa umano al fine di comprendere le basi meccaniche della sua funzione di segnalazione e stabilire piattaforme per la progettazione razionale dei farmaci. Questo metodo dovrebbe aiutare i ricercatori a determinare la struttura di IKK1, che fornirebbe risposte a domande chiave nel campo della segnalazione immunitaria. Questa tecnica descrive un percorso semplificato per ottenere cristalli di proteine IKK, che sono piuttosto refrattarie alla cristallizzazione e per fornire varie informazioni critiche nel superare le strozzature nel determinare le strutture.Generalmente, gli individui nuovi a questo metodo avranno difficoltà, perché generare quantità di milligrammo di proteine solubili e ben educate, richiede la sua espressione nelle cellule degli insetti e la cristallizzazione può essere eseguita solo in una finestra di condizioni altamente stretta. Anche la procedura di sostituzione molecolare utilizzata per determinare la struttura di IKK1 può essere molto complicata, specialmente a causa della scarsa proprietà di deflessione dei cristalli, non nel sito dell'unità asimmetrica contenente molte molecole di IKK1 in assenza di adeguati modelli di ricerca. A dimostrare le procedure saranno Kyle Shumate e Sonjiala Hotchkiss, studenti del mio laboratorio.Il primo giorno, placcare le cellule Sf9 in due millilitri di mezzo cellulare per insetti Sf903, in ogni pozzo di un piatto di sei po 'e incubare a 27 gradi Celsius. Passare le cellule quando raggiungono una densità da due a tre volte 10 alle sei cellule per millilitro in sospensione diluerlo a mezzi freschi, ad una densità di circa sei per 10 a cinque. Il secondo giorno, diluire otto microlitri di reagente di trasfezione Sf9 in 100 microlitri di SF-903 o Grace's Insect Medium.Quindi vortice brevemente la miscela. In un tubo separato, diluire un microgrammo di bacmid ricombinante purificato da kit in 100 microlitri dello stesso mezzo. Unire il DNA diluito e il reagente di trasfezione.Dopo aver incubato a temperatura ambiente per 15-30 minuti, rimuovere il mezzo dal pozzo. Quindi aggiungere un millilitro di mezzo fresco. Successivamente, aggiungere la miscela di reagente di trasfezione del DNA diluita dropwise sulle cellule, regolando la dimensione della goccia in modo che non spodesta le cellule aderenti.Dopo sei ore, aggiungere 1,5 millilitri di mezzo fresco sopra le cellule. Incubare le cellule a 27 gradi Celsius, controllando periodicamente i pozzi ogni 12 ore per i segni di infezione virale. Il quinto giorno, rimuovere il mezzo contenente cellule, da 60 a 72 ore dopo l'infezione.Dopo aver trasferito il mezzo in tubi, centrifugare per cinque minuti a 500 volte g e quattro gradi Celsius. Al termine, salvare il supernatante, che è lo stack di virus P1. Il primo giorno, rimescolare il pellet di cellule His-IKK1 precedentemente preparato in 40 millilitri di tampone di lisi.Posizionare la sospensione cellulare sul ghiaccio e llyse le cellule per sonicazione a cicli di servizio dal 60% al 70% e da cinque a 10 impulsi di durata di 30 secondi ad un intervallo superiore a un minuto. Chiarire il llysato per centrifugazione a maggiore o uguale a 28.000 g per 45 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver preparato una resina di nichel-NTA agarosio, secondo il protocollo di testo, eludere la proteina alfa IKK1 con etichetta His sotto flusso gravitazionale utilizzando 20 millilitri di tampone di eluizione.Raccogliere da una a 1,5 frazioni di millilitro. Dopo aver combinato le frazioni contenenti la proteina, digerire il campione con proteasi TEV durante la notte a quattro gradi Celsius. La mattina del secondo giorno, incubare la proteina con un millimolare di ATP, in presenza di cloruro di magnesio, beta-glicerofosfato, fluoruro di sodio e ortovanato di sodio per un'ora a 27 gradi Celsius.Dopo l'incubazione, filtrare la soluzione proteica attraverso un filtro da 0,45 micron. Quindi caricare circa sei millilitri del campione su una colonna di esclusione delle dimensioni preparativa da 120 millilitri, collegata a un sistema di cromatografia liquida automatizzato. Dopo l'equilibrazione, eseguire la cromatografia ad esclusione di dimensione ad una portata di un millilitro al minuto e raccogliere frazioni di due millilitri.Durante la corsa, monitorare l'eluizione a 280 e 254 nanometri. Dopo aver tirato le frazioni pure, concentrare in un concentratore centrifugo tagliato a peso molecolare da 30 kilodalton, seguendo le istruzioni del produttore. Quindi erogare aliquote a 25 microliter della proteina concentrata e congelare flash nell'azoto liquido.Utilizzando un robot, pipettare da 80 a 100 microlitri di un reagente di cristallizzazione nel serbatoio di una piastra da 96 potte. Utilizzando un robot di cristallizzazione, erogare e mescolare da 0,2 a 0,25 microlitri di IKK1 e il suo complesso inibitore con lo stesso volume di soluzione di serbatoio. Subito dopo aver impostazione le gocce, sigillare ogni piastra con pellicole otticamente chiare per evitare l'evaporazione.Incubare una piastra a 18 gradi Celsius e l'altra piastra a quattro gradi Celsius in una stanza fredda. Utilizzare un microscopio stereo con un polarizzatore per verificare l'aspetto del cristallo in ogni goccia, ogni giorno, per i primi sette giorni e poi a intervalli più lunghi. Dopo aver preparato IKK1 e il suo complesso inibitore come descritto in precedenza, trasferire le soluzioni di pozzo in ogni pozzo di una piastra da 24 po '.Posizionare da uno a 1,5 microlitri di soluzione di pozzo su un coperchio di vetro pulito. Aggiungere un volume uguale di IKK1 e il suo complesso inibitore al coverslip di vetro e mescolare delicatamente pipettando su e giù da tre a quattro volte. Dopo aver applicato il grasso sugli anelli di ogni pozzo della piastra, capovolgere il coperchio del vetro e posizionarlo sul rispettivo pozzo con le forcep.Quindi sigillare il pozzo premendo verso il basso sul coperchio di vetro. Dopo aver sistemato tutte le gocce nella piastra da 24 pozzi, incubare nella stanza fredda, al buio. Occasionalmente controllare le gocce al microscopio per l'aspetto e la crescita dei cristalli.Una volta completata la crescita del cristallo, rimuovere delicatamente il coverslip di vetro contenente il cristallo e posizionarlo su una superficie solida con la goccia di cristallo rivolta verso l'alto. Aggiungere delicatamente 10 microlitri di crio una soluzione sopra la goccia e mescolare delicatamente con pipettazione in modo che il cristallo non sia toccato. Utilizzando un microscopio, rimuovere lentamente del liquido dal cristallo e mantenere circa cinque-otto microlitri della soluzione.Aggiungere delicatamente da 2,5 a quattro microlitri di soluzione crio B sulla goccia e mescolare delicatamente con la pipettazione. Coprire il coperchio in vetro con una piccola piastra petrie per evitare il flusso d'aria diretto sul cristallo. Dopo aver atteso cinque minuti, scegliere con cura un singolo cristallo dalla goccia in un crioloop appropriato montato su una base corretta.Congelare il cristallo in azoto liquido. Quindi conservare il cristallo contenente criopo in un disco immerso nell'azoto liquido in un pallone Dewar fino a quando non è pronto per la diffrazione a raggi X al sincrotrone. Dopo approfonditi studi con diverse varianti di IKK1, i cristalli sono stati ottenuti con un costrutto troncato, che mostrava proprietà a raggi X adatte solo in presenza dell'inibitore IKK XII.L'effetto combinato dei dati a raggi X a bassa risoluzione con intensità deboli, un gran numero di molecole di IKK1 nell'unità asimmetrica e variazione conformazionale del modello monomerico-dimerico IKK1, rispetto ai modelli IKK2 noti, ha reso difficile ottenere una soluzione di sostituzione molecolare, IKK1, e determinarne la struttura. Diverse strutture IKK2 indicavano diversi orientamenti inter-monomeri all'interno dei suoi dimeri in modo che la distanza tra i carboni alfa di P578 nei due domini della chinasi, in quattro diversi modelli di dimero, variasse tra 39 e 61 angstrom. Ottenere un utile modello di ricerca è stato possibile grazie alla mappa di microscopia crioelettronica a bassa risoluzione e a un modello ad alta precisione di domini IKK1 che potevano essere generati sulla base di una struttura IKK2 ad alta risoluzione.Il modello iniziale indicava un orientamento del dominio della chinasi ruotato di 24 gradi rispetto a quello di un monomero IKK2 e un'apertura N-terminale di 58 angstrom. Utilizzando uno dei dimeri con l'apertura a 52 angstrom come modello, sono stati localizzati sei dimeri nell'unità asimmetrica. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in un paio di mesi, se viene eseguita correttamente.Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che l'ottenimento di una proteina solubile, attiva e ben comportata è il primo passo critico. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione generale di tutti i passaggi che devono essere seguiti in modo accurato, per avere successo nel cristallizzare e determinare la struttura della proteina IKK1. Imparando questa procedura, ci sono ancora strutture di altre proteine della famiglia IKK che possono anche essere determinate al fine di rispondere a ulteriori domande sulla segnalazione chinasi-mitogeno.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/&#945;

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Espressione, purificazione e cristallizzazione della umana trasportatore della serotonina associato a<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Ricerca

Biochimica

Combining Wet and Dry Lab Techniques to Guide the Crystallization of Large Coiled-coil Containing Proteins

La combinazione di Wet and Dry tecniche di laboratorio per guidare la cristallizzazione di grandi dimensioni avvolto a spirale contenenti proteine

Obtaining crystals for structure determination can be a difficult and time consuming proposition for any protein. Coiled-coil proteins and domains are ...

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Produzione, Cristallizzazione e struttura Determinazione<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-1 tramite Microseeding e Zinco-SAD

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

FRET di alta precisione a singolo livello molecolare per la determinazione della struttura biomolecola

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO

Produzione, cristallizzazione e determinazione della struttura del dominio iKK-binding di NEMO

NEMO is a scaffolding protein which plays an essential role in the NF-&#954;B pathway by assembling the IKK-complex with the kinases IKK&#945; and ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

Cristallizzazione e determinazione strutturale di un enzima:complesso di substrati mediante cristallografia seriale in un chip microfluidico versatile

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

The Extraction of Liver Glycogen Molecules for Glycogen Structure Determination

Liver glycogen is a hyperbranched glucose polymer that is involved in the maintenance of blood sugar levels in animals. The properties of glycogen are ...

Efficient and Scalable Production of Full-length Human Huntingtin Variants in Mammalian Cells using a Transient Expression System

Full-length huntingtin (FL HTT) is a large (aa 1-3,144), ubiquitously expressed, polyglutamine (polyQ)-containing protein with a mass of approximately 350 ...

High-Throughput Screening for Protein Crystallization

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography (Video) | JoVE 

Screening ad alta produttività per ottenere colpi cristallini per la cristallografia proteica

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into ...

A Fibrinolytic Enzyme-Based Method to Study Cerebral Thrombus Cell Components

A Comprehensive Approach to Analyze the Cell Components of Cerebral Blood Clots

A Novel Method for Comprehensive Cell Component Analysis of Cerebral Blood Clots (Video) | JoVE

Un approccio completo per analizzare i componenti cellulari dei coaguli di sangue cerebrale

Cerebral thrombosis, a blood clot in a cerebral artery or vein, is the most common type of cerebral infarction. The study of the cell components of ...