Name: a guide to production, crystallization, and structure determination of human ikk1/&#945;
Uploaded: 2018-11-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/ÃŽÂ± at JoVE.com

ビームライン 19ID、24ID、および様々 な結晶でのデータ収集の間にサポートのための高度な光子源、レモント、イリノイ州で 13ID でスタッフに感謝いたします。EM 地図/モデルの構築、初期 IKK1 分子置換検索モデルの作成に使用された初期の段階での低分解能の低温電子顕微鏡マップを取得私たちのドミトリー ・ Lyumkis、ソーク研究所に感謝しております。これらの結果につながる研究は、GG に NIH 助成金 AI064326、CA141722、および GM071862 から資金を受けています。SP は、Wellcome の信頼 DBT インド中間。

1 大規模な IKK1/α 発現に適した遺伝子組換えウイルスの作製
<ol><li>
P1 ウイルス作製32<ol>
<li>1 日目: プレート Sf9 細胞 (10 X 6 〜5) (通路番号 10 未満) 各 Sf900 III 昆虫細胞用培地 2 mL に 6 ウェル プレートのもし、27 ° c. で孵化させなさい6 〜 10 倍の密度で新鮮なメディアに希釈することによって懸濁液 mL あたり 2 に 3 X 10 の6セルの密度に達すると細?...

<ol>
	<li>Xia, Y., Shen, S., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB,+an+active+player+in+human+cancers.">NF-kappaB, an active player in human cancers.</a> Cancer immunology research. 2 (9), 823-830 (2014).</li><li>Grivennikov, S. I., Greten, F. 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M., Delhase, M., Hayakawa, M., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IkappaB+kinase+complex+(IKK)+contains+two+kinase+subunits,+IKKalpha+and+IKKbeta,+necessary+for+IkappaB+phosphorylation+and+NF-kappaB+activation.">The IkappaB kinase complex (IKK) contains two kinase subunits, IKKalpha and IKKbeta, necessary for IkappaB phosphorylation and NF-kappaB activation.</a> Cell. 91 (2), 243-252 (1997).</li><li>Rothwarf, D. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IKKbeta+subunit+of+IkappaB+kinase+(IKK)+is+essential+for+nuclear+factor+kappaB+activation+and+prevention+of+apoptosis.">The IKKbeta subunit of IkappaB kinase (IKK) is essential for nuclear factor kappaB activation and prevention of apoptosis.</a> J Exp Med. 189 (11), 1839-1845 (1999).</li><li>Hayden, M. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shared+principles+in+NF-kappaB+signaling.">Shared principles in NF-kappaB signaling.</a> Cell. 132 (3), 344-362 (2008).</li><li>Sun, S. C., Chang, J. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40+regulates+the+processing+of+NF-kappaB2+p100+to+p52.">CD40 regulates the processing of NF-kappaB2 p100 to p52.</a> EMBO J. 21 (20), 5375-5385 (2002).</li><li>Dejardin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lymphotoxin-beta+receptor+induces+different+patterns+of+gene+expression+via+two+NF-kappaB+pathways.">The lymphotoxin-beta receptor induces different patterns of gene expression via two NF-kappaB pathways.</a> Immunity. 17 (4), 525-535 (2002).</li><li>Xiao, G., Fong, A., Sun, S. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncanonical+NF-kappaB+activation+requires+coordinated+assembly+of+a+regulatory+complex+of+the+adaptors+cIAP1,+cIAP2,+TRAF2+and+TRAF3+and+the+kinase+NIK.">Noncanonical NF-kappaB activation requires coordinated assembly of a regulatory complex of the adaptors cIAP1, cIAP2, TRAF2 and TRAF3 and the kinase NIK.</a> Nat Immunol. 9 (12), 1371-1378 (2008).</li><li>Vallabhapurapu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonredundant+and+complementary+functions+of+TRAF2+and+TRAF3+in+a+ubiquitination+cascade+that+activates+NIK-dependent+alternative+NF-kappaB+signaling.">Nonredundant and complementary functions of TRAF2 and TRAF3 in a ubiquitination cascade that activates NIK-dependent alternative NF-kappaB signaling.</a> Nat Immunol. 9 (12), 1364-1370 (2008).</li><li>Annunziata, C. 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2 つの関連する IKK タンパク質の生産、結晶化・構造ソリューション IKK2/β タンパク生産、結晶化、構造決定と私たちの経験を与えられる比較的簡単な運動であろう概念と IKK1/α の x 線結晶構造を決定するのに着手しました。ただし、我々 はこれら 2 つの関連蛋白質は結晶化のしやすさに関する非常に異なる振る舞いこと非常に驚いていた。いくつかの知名度の高い所から努力...

二量体転写因子の NF κ B 家族の転写活性は、炎症と免疫生存と死に至るまで多様な細胞機能に必要です。これらの活動は、細胞と自己免疫疾患や癌1,2,3を含む様々 な病理学の条件に規制つながるの損失に厳しく制御されます。刺激がないと、NF-κ B の活性抑制 IκB (κ B の阻害剤) 蛋白質4で保持されます。IκB タンパク質特定 Ser 残基のリン酸化ユビキチン化とそれに続くプロテアソームまたは選択的処理5のマークを付けます。セリン/スレオニンの 2 つの高い相同性キナーゼ IKK2/β と IKK1/α はこれらのリン酸化イベント6、7の遂行によって NF-κ B の活動の調節因子として機能します。
リガンドと受容体の相互作用は、一連の仲介因子 NF-κ B の活性化につながる信号をペリプラズムします。NF-κ B シグナル伝達プロセスは、2 つの異なる経路-正規と非正規 (代替)8に広く分類できます。IKK2/β の活動は主に、炎症性と生得免疫応答9に不可欠な標準的な経路の NF-κ B シグナル伝達を調節します。この経路の特徴はこれまで生化学メタボライト IKK 複雑な内 IKK2/β10の迅速かつ短時間活性化-IKK1、IKK2、規制成分、ネモ (NF-κ B 重要な変調器で構成されると推定)11,12,13。IKK 複合体の 2 つの触媒 IKK サブユニット、間 IKK2 主担当です14原型 IκBs (α ・ β ・ γ) の特定の残基のリン酸化のため NF-κ B とも非定型の IκB 蛋白質にバインド NF-κB1/p105 である、NF-κ B p50 サブユニット5の前駆体。リン酸化によるユビキチンとプロテアソームの IκB (または p105 の処理) がリリースと NF-κ B 二量体15の特定のセットの活性化に 。IKK2 の誤規制機能による異常な NF-κ B 活性は、自己免疫疾患2,3,16のように同様に多くの癌で観察されています。
IKK2/β と対照をなして IKK1/α の活動は、NF-κ B が開発と耐性のために不可欠である非正規の経路のシグナル伝達を調節します。IKK1 は、C 末端 IκBδ のセグメントについては、その処理と p52 の生成につながる NF-κB2/p100 の特定残基を廃止します。転写活性状態 p52:RelB ヘテロダイマーの形成発達信号7,17,18,19,20をゆっくりと持続的な応答を開始します。興味深いことに、この経路の中央 NF-κ 係数 p52 の世代はもう一つの要因は、NF-κ B を誘発するキナーゼ (NIK)21,22ではなく、IKK2 またはネモに大きく依存します。静止期細胞のニックのレベルがその一定のプロテアソーム依存低下23,24,25により低いまま。'非正規' の配位子と特定の悪性の細胞で細胞の刺激、ニック化を採用して IKK1 をアクティブにするが安定/ニック ・ IKK1 α キナーゼ活動が p527に p100 の効率的な処理に不可欠であります。IKK1 とニックはに対する 3 セリン (Ser866、870 と 872) NF-κB2/p100 の処理と p52 の世代につながる、C 末端 IκBδ セグメント上です。非正規の経路の異常な活性化は、多発性骨髄腫26,27,28を含む多くの癌に関与しています。
IKK2/β のいくつかの非常に効率的かつ特定阻害剤が知られているが、どれもはこれまで有効な薬剤であると判明しています。対照的に、IKK1/α-特定の阻害剤は、まばら。これは、部分的に構造および生化学的 IKK1/α、セル、および合理的な薬剤設計の IKK1 によって NF-κ B の活性化の機構の基礎を理解することについての私達の欠如から幹があります。IKK2/β の x 線構造は、IKK2/β29; の活性化機構への洞察を提供してくれましたしかし、これらの構造がどのように異なる上流の刺激を明らかに IKK1/α または IKK2/β NF-κ B 活動30,31の異なるセットを規制するためのアクティブ化をトリガーします。IKK1/α の異なるシグナル伝達関数の基になる機構の基礎を理解して、合理的な薬剤設計のためのプラットフォームを確立するには、我々 は IKK1/α の構造決定に焦点を当てた。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cellfectin/Cellfectin II</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10362100</td>
			<td>Cellfectin is now discontinued, replaced by Cellfectin II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf900 III Insect cell medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12658-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SF9 cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12659017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-IKK1 antibody</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB100-56704</td>
			<td>Previously sold by Imgenex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PentaHis antibody</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>34460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>Nitrocellulose can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford assay reagent</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>500001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28989335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon concentrator</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC801008, UFC803008, UFC201024, UFC203024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound A</td>
			<td>Bayer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calbiochem IKK-inhibitor XII</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>401491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staurosporine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>S4400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLN120B</td>
			<td>Millenium</td>
			<td>Gift item</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPPNP</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A2647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulfate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>51227, 42867, 31404,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulfate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>93593, 81210, 88276, 95904, 81255, 89510, 92897, 81285, 95172</td>
			<td>Some of them are new Cat # on SIGMA catalogue. What we had was originally from Fluka that had different Cat #.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystallization Screens</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Screen I and II (Crystal Screen HT)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index HT</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG/Ion and PEG/Ion2 (PEG/Ion HT)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEGRX 1 and PEGRx 2 (PEGRx HT)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SaltRx 1 and SaltRx 2 (SaltRx HT)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal mounts</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR8-188, 190, 192, 194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synchrotron</td>
			<td>The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy&#8217;s Argonne National Laboratory</td>
			<td>Beamline 19 ID</td>
			<td>The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy&#8217;s Argonne National Laboratory provides ultra-bright, high-energy storage ring-generated X-ray beams for research in almost all scientific disciplines.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a guide to production, crystallization, and structure determination of human ikk1/&#945;

細胞外刺激のクラスには、NF-κ B サブユニット、p52、その前駆体の p100 の処理による生成を誘導する IKK1/α の活性化が必要です。p52 ホモまたはヘテロダイマー別 NF-κ B サブユニット、RelB ととして機能します。これらの二量体はターンでは何百もの炎症、細胞生存率、細胞周期に関与する遺伝子の発現を調節します。IKK1/α 三元複合体として主に IKK2/β とネモに関連付けられたままです。しかし、それの小さなプールがまた低分子量 complex(es) として観察されます。P100 処理アクティビティが大きく内 IKK1/α の活性化または小さい複雑なプールによってトリガーされる場合は不明です。IKK1/α の構成アクティビティがいくつかの癌や炎症性疾患で検出されました。IKK1/α の活性化のメカニズムを理解し、創薬のターゲットとしての使用を有効にする、我々 は大腸菌など、別のホスト システムでの組換え IKK1/α を表明した昆虫および哺乳類細胞。成功したバキュロ ウイルスで水溶性 IKK1/α を表現する感染昆虫細胞、非常に純粋な蛋白質の mg 量を取得、阻害剤の存在下で結晶化、x 線結晶構造を決定します。ここでは、組換えタンパク質、その結晶の x 線結晶構造解析を生成する詳細な手順について述べる。

IKK1/α の異なる構造体のクローニングと発現 タグ付き IKK1 の N 末端ヘキサ ヒスチジンを取得するその EcoRI とノッティ制限サイト内バキュロ ウイルス発現ベクター pFastBacHTa に人間 IKK1/α のクローンだった完全な長さ。タグは、TEV プロテアーゼ消化によって削除でした。全長 IKK1/α に両端に柔軟な地域が含まれているので、柔軟な地域によってレンダリ...

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A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

IκB キナーゼ 1/α (IKK1/α CHUK) は主に転写因子の NF-κ B の活性化を介して細胞活動の無数に関係するセリン/スレオニン蛋白質キナーゼ。ここでは、生産、この蛋白質の結晶構造解析に必要な主な手順について述べる。

生産、結晶化、および人間 IKK1/α の構造決定へのガイド

A class of extracellular stimuli requires activation of IKK1/&#945; to induce generation of an NF-&#954;B subunit, p52, through processing of its ...

この手順の目的は、シグナル伝達機能の機構基盤を理解し、合理的な薬物設計のためのプラットフォームを確立するために、ヒトIKK1-αの生産、結晶化、構造決定のためのガイダンスを提供することです。この方法は、研究者が免疫シグナル伝達の分野で主要なクエリへの答えを提供するIKK1の構造を決定するのに役立ちます。この技術は、結晶化に対して難治性であり、構造を決定する際のボトルネックを克服する上で様々な重要な情報を提供するIKKタンパク質の結晶を得るための合理化された経路を記述する。一般的に、この方法に新しい個人は、可溶性の、行き届いたタンパク質のミリグラム量を生成するので、昆虫細胞でその発現を必要とし、結晶化は非常に狭い条件の窓の下でのみ行うことができるので、苦労します。IKK1の構造を決定する際に使用される分子置換手順は、特に結晶の偏向特性が悪いため、適切な検索モデルがない場合に多くのIKK1分子を含む非対称ユニットの部位ではなく、非常に難しい場合があります。手順を実証するには、カイル・シュマテとソンジアラ・ホッチキス(私の研究室の学生)がいます。1日目には、Sf903昆虫細胞培地2ミリリットルのSf9細胞を6ウェルプレートの各ウェルにプレートし、摂氏27度でインキュベートする。細胞を2~3倍の密度に達すると、1ミリリットル当たり6個の細胞を新鮮な培地に希釈し、約6倍の濃度で5個まで通過する。2日目には、SF-903またはグレースの昆虫培地の100マイクロリットルにSf9トランスフェクション試薬の8マイクロリットルを希釈します。その後、混合物を短時間渦液します。別のチューブで、同じ媒体の100マイクロリットルにキット精製組換えバクミドの1マイクログラムを希釈します。希釈したDNAとトランスフェクション試薬を組み合わせます。室温で15~30分間インキュベートした後、ウェルから培地を取り出します。その後、新鮮な媒体の1ミリリットルを追加します。次に、希釈したDNAトランスフェクション試薬混合物を細胞上に滴下して添加し、接着細胞を外さないようなドロップサイズを調整する。6時間後、細胞の上に新鮮な培地を1.5ミリリットル加えます。細胞を摂氏27度でインキュベートし、ウイルス感染の兆候がないか12時間ごとに定期的に井戸をチェックする。5日目に、感染後60〜72時間の細胞を含む培地を取り除く。培地をチューブに移した後、500倍gと摂氏4度で5分間遠心分離機。終了したら、P1ウイルススタックである上清を保存します。1日目に、以前に調製したHis-IKK1細胞ペレットを40ミリリットルのリシスバッファーに再中断する。細胞懸濁液を氷の上に置き、60%〜70%のデューティサイクルで超音波処理し、1分以上の間隔で30秒の持続時間の5〜10パルスで細胞をライスします。摂氏4度で45分間、28,000g以上で遠心分離により、リセートを明らかにする。テキストプロトコルに従ってニッケルNTAアガロース樹脂を調製した後、20ミリリットルの溶出バッファーを使用して重力流下でHisタグ付きIKK1アルファタンパク質を溶出する。1から1.5ミリリットルの分数を収集します。タンパク質を含む分画を組み合わせた後、摂氏4度で一晩TEVプロテアーゼでサンプルを消化する。2日目の朝、塩化マグネシウム、β-グリセロリン酸、フッ化ナトリウム、オルトバナジン酸ナトリウムの存在下で、27°Cで1時間、ATPの1ミリモルでタンパク質をインキュベートします。インキュベーション後、0.45ミクロンのフィルターを介してタンパク質溶液を濾過します。その後、サンプルの約6ミリリットルを120ミリリットルの調製サイズ排除カラムに積み込み、自動液体クロマトグラフィーシステムに取り付けます。平衡後、サイズ排除クロマトグラフィーを1分間に1ミリリットルの流量で実行し、2ミリリットル分数を収集します。走行中、280および254ナノメートルで溶出を監視します。純粋な分画を引っ張った後、メーカーの指示に従って、30キロダルトン、分子量カットオフ遠心濃縮器に濃縮します。次に、濃縮タンパク質の25マイクロリットルのアリコートを分配し、液体窒素中でフラッシュフリーズします。ロボットを用いて、96ウェルプレートの貯留槽に結晶化試薬のピペット80〜100マイクロリットル。結晶化ロボットを使用して、0.2~0.25マイクロリットルのIKK1とその阻害剤複合体を同じ体積のリザーバー溶液で分配して混合します。滴を設定した直後に、蒸発を避けるために光学的に透明なフィルムで各プレートを密封する。冷たい部屋で1つのプレートを摂氏18度で、もう一方のプレートを摂氏4度でインキュベートします。偏光板付きのステレオ顕微鏡を使用して、毎日、最初の7日間、そしてより長い間隔で、各ドロップ中の結晶の外観を確認します。先に説明したようにIKK1とその阻害剤複合体を調製した後、24ウェルプレートの各ウェルにウェル溶液を移します。1~1.5マイクロリットルのウェル溶液をきれいなガラスカバースリップに置きます。ガラスカバースリップに等量のIKK1とその阻害剤複合体を加え、上下に3〜4回ピペットで軽く混ぜます。プレートの各ウェルのリングにグリースを塗布した後、ガラスカバースリップを裏返し、各ウェルに鉗子を置きます。その後、ガラスのカバースリップを押し下げて井戸を密封します。24ウェルプレートにすべての滴を設定した後、暗闇の中で、冷たい部屋でインキュベート。時折、結晶の外観と成長のために顕微鏡の下で滴をチェックしてください。結晶の成長が完了したら、クリスタルを含むガラスカバースリップをそっと取り出し、クリスタルドロップを上向きにして固体表面に置きます。10マイクロリットルのクライオA溶液をドロップの上にそっと加え、結晶が触れないようにピペッティングして軽く混ぜます。顕微鏡を使用して、ゆっくりと結晶から液体を取り出し、溶液の約5〜8マイクロリットルを保ちます。2.5~4マイクロリットルのクライオB溶液をドロップにそっと加え、ピペットで軽く混ぜます。クリスタル上の直接の気流を避けるために、小さなペトリー皿でガラスカバースリップを覆います。5分待った後、適切なベースに取り付けられた適切なクライオループのドロップから慎重に単一の結晶を選びます。液晶を液体窒素でフラッシュフリーズします。その後、クライオループを含む結晶を、シンクロトロンでX線回折の準備ができるまで、デュワーフラスコの液体窒素に浸したパックに保管します。いくつかの異なるIKK1変異体を用いた広範な試験の後、結晶は1つの切り捨てられた構造で得られ、IKK阻害剤XIIの存在下でのみ適切なX線特性を示した。低解像度X線データの強度の弱さ、非対称ユニットの多数のIKK1分子、およびIKK1単量体二量体モデルの立体構造変化を組み合わせることで、既知のIKK2モデルと比較して分子置換溶液IKK1を得てその構造を決定することが困難となった。異なるIKK2構造は、2つのキナーゼドメインにおけるP578のアルファ炭素間の距離が、4つの異なるダイマーモデルにおいて、39から61のオングストロームの間で変化するように、そのダイマー内で異なる単量体配向を示した。低解像型のクライオ電子顕微鏡マップと、高解像度IKK2構造に基づいて生成できるIKK1ドメインの高精度モデルにより、有用な探索モデルを得ることが可能でした。最初のモデルは、IKK2モノマーと58オングストロームのN端子開口部に対して24度回転したキナーゼドメインの向きを示した。52オングストローム開口部を持つダイマーの1つをモデルとして使用して、非対称ユニット内に6つのダイマーが配置されました。一度習得すると、この技術は、それが適切に実行されている場合、数ヶ月で実行することができます。この手順を試みる間、可溶性、活性および行行性の高いタンパク質の取得が最初の重要なステップであることを覚えておくことが重要です。このビデオを見た後、IKK1タンパク質の結晶化と構造の決定に成功するために、詳細に従う必要があるすべてのステップをよく理解する必要があります。この手順を学ぶと、キナーゼ-マイトゲンシグナル伝達に関する追加の質問に答えるために決定できる他のIKKファミリータンパク質の構造がまだあります。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/&#945;

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

にバインドされた熱安定、発現、精製、およびヒトセロトニントランスポーターの結晶化<em&gt; S</em&gt; - シタロプラム

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Combining Wet and Dry Lab Techniques to Guide the Crystallization of Large Coiled-coil Containing Proteins

大コイルドコイル含有タンパク質の結晶化を導くためにウェットとドライラボテクニックを組み合わせます

Obtaining crystals for structure determination can be a difficult and time consuming proposition for any protein. Coiled-coil proteins and domains are ...

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

の生産、結晶化と構造決意<em&gt; C。ディフィシル</em&gt; PPEP-1 Microseeding及び亜鉛SADを介しました

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

生体分子構造決定のための単分子レベルでの高精度FRET

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO

NEMOのIKK結合ドメインの生産・結晶化・構造決定

NEMO is a scaffolding protein which plays an essential role in the NF-&#954;B pathway by assembling the IKK-complex with the kinases IKK&#945; and ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

酵素の結晶化と構造決定:多用途マイクロ流体チップにおける連続結晶学による基質複合体

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

The Extraction of Liver Glycogen Molecules for Glycogen Structure Determination

Liver glycogen is a hyperbranched glucose polymer that is involved in the maintenance of blood sugar levels in animals. The properties of glycogen are ...

Efficient and Scalable Production of Full-length Human Huntingtin Variants in Mammalian Cells using a Transient Expression System

Full-length huntingtin (FL HTT) is a large (aa 1-3,144), ubiquitously expressed, polyglutamine (polyQ)-containing protein with a mass of approximately 350 ...

High-Throughput Screening for Protein Crystallization

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography (Video) | JoVE 

タンパク質結晶構造解析のためのクリスタルヒットを得るためのハイスループットスクリーニング(英語)

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into ...

A Fibrinolytic Enzyme-Based Method to Study Cerebral Thrombus Cell Components

A Comprehensive Approach to Analyze the Cell Components of Cerebral Blood Clots

A Novel Method for Comprehensive Cell Component Analysis of Cerebral Blood Clots (Video) | JoVE

脳血栓の細胞成分を包括的に解析する

Cerebral thrombosis, a blood clot in a cerebral artery or vein, is the most common type of cerebral infarction. The study of the cell components of ...