Name: a guide to production, crystallization, and structure determination of human ikk1/&#945;
Uploaded: 2018-11-02T13:00:00
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우리 직원을 beamlines 19ID, 24ID, 및 다양 한 결정에는 데이터 수집 중 지원에 대 한 고급 광자 소스, Lemont, 일리노이에서 13ID에 감사합니다. 우리는 우리 안에 지도/모델의 구축, 초기 IKK1 분자 대체 검색 모델을 구축 하는 데 사용 된 초기 단계에서 낮은 해상도 cryo-EM 지도 인출 하기 위한 드미트리 Lyumkis, 솔 크 연구소에 감사. 이러한 결과 연구 GG에 NIH 교부 금 AI064326, CA141722, 및 GM071862에서에서 자금 지원을 받고 있다. SP는 현재 Wellcome 신뢰 DBT 인도 중간 동료.

1. 재조합 형 바이러스 IKK1/α의 대규모 식 적합의 준비
<ol><li>
P1 바이러스 준비 32<ol>
<li>주: 1 격판덮개 Sf9 셀 (6 ~ 10 X5) (통로 번호 10 미만) 각 Sf900 III 곤충 세포 매체의 2 ml에서 6 잘 플레이트의 잘와 27 ° c.에 품 어 6 ~ 10 X의 밀도에 신선한 미디어로 diluting 하 여 정지에 mL 당 2 ~ 3 × 106 셀의 밀도 도달할 때 셀 통로5.</li>
		<li>주 2: 8 µ L 항생제 및...

<ol>
	<li>Xia, Y., Shen, S., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB,+an+active+player+in+human+cancers.">NF-kappaB, an active player in human cancers.</a> Cancer immunology research. 2 (9), 823-830 (2014).</li><li>Grivennikov, S. I., Greten, F. 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M., Delhase, M., Hayakawa, M., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IkappaB+kinase+complex+(IKK)+contains+two+kinase+subunits,+IKKalpha+and+IKKbeta,+necessary+for+IkappaB+phosphorylation+and+NF-kappaB+activation.">The IkappaB kinase complex (IKK) contains two kinase subunits, IKKalpha and IKKbeta, necessary for IkappaB phosphorylation and NF-kappaB activation.</a> Cell. 91 (2), 243-252 (1997).</li><li>Rothwarf, D. M., Zandi, E., Natoli, G., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IKK-gamma+is+an+essential+regulatory+subunit+of+the+IkappaB+kinase+complex.">IKK-gamma is an essential regulatory subunit of the IkappaB kinase complex.</a> Nature. 395 (6699), 297-300 (1998).</li><li>Yamaoka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementation+cloning+of+NEMO,+a+component+of+the+IkappaB+kinase+complex+essential+for+NF-kappaB+activation.">Complementation cloning of NEMO, a component of the IkappaB kinase complex essential for NF-kappaB activation.</a> Cell. 93 (7), 1231-1240 (1998).</li><li>Li, Z. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IKKbeta+subunit+of+IkappaB+kinase+(IKK)+is+essential+for+nuclear+factor+kappaB+activation+and+prevention+of+apoptosis.">The IKKbeta subunit of IkappaB kinase (IKK) is essential for nuclear factor kappaB activation and prevention of apoptosis.</a> J Exp Med. 189 (11), 1839-1845 (1999).</li><li>Hayden, M. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shared+principles+in+NF-kappaB+signaling.">Shared principles in NF-kappaB signaling.</a> Cell. 132 (3), 344-362 (2008).</li><li>Sun, S. C., Chang, J. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40+regulates+the+processing+of+NF-kappaB2+p100+to+p52.">CD40 regulates the processing of NF-kappaB2 p100 to p52.</a> EMBO J. 21 (20), 5375-5385 (2002).</li><li>Dejardin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lymphotoxin-beta+receptor+induces+different+patterns+of+gene+expression+via+two+NF-kappaB+pathways.">The lymphotoxin-beta receptor induces different patterns of gene expression via two NF-kappaB pathways.</a> Immunity. 17 (4), 525-535 (2002).</li><li>Xiao, G., Fong, A., Sun, S. 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두 개의 관련된 IKK 단백질의 구조, 결정 화 및 생산 솔루션 우리 개념 그것은 비교적 간단한 운동 IKK2/β 단백질 생산, 결정 화, 및 구조 결정 우리의 경험을 주어진 것으로 IKK1/α의 x 선 결정 구조를 결정 하기 위해 밖으로 설정 합니다. 그러나, 우리가이 두 가지 관련된 단백질 결정의 용이성에 관한 매우 다르게 행동 매우 놀 랐 다. 여러 높은 프로 파일 실험실에서 노력에도 불구 하 ?...

Dimeric 녹음 방송 요인 NF-κB 가족의 transcriptional 활동은 염증과 면역에서 생존과 죽음에 이르기까지 다양 한 세포 기능에 필요 합니다. 이러한 활동은 세포와 자가 면역 질환, 그리고 암1,2,3를 포함 하 여 다양 한 병 적인 조건에 규제 리드의 손실에 엄격 하 게 제어 됩니다. 자극의 부재에서 NF-κB의 활동 저해 IκB (-κB의 억제제) 단백질4에 의해 유지 됩니다. IκB 단백질에 특정 Ser 잔류물 인 산화 ubiquitination 및 후속 proteasomal 저하 또는 선택적 처리5에 대 한 그들을 표시합니다. 두 개의 높은 동종 Ser/Thr kinases, IKK2/β와 IKK1/α, NF-κB 활동의 중앙 레 귤 레이 터가 인 산화 이벤트6,7을 수행 하 여 역할.
ligand와 수용 체 간의 상호 작용 transduces NF κB 요인의 활성화를 선도 하는 중재자의 시리즈를 통해 신호. NF-κB 신호 과정은 광범위 하 게 두 가지 경로-정규 및 비정규 (대체)8로 나눌 수 있다. IKK2/β의 활동은 주로 염증 성 및 타고 난 면역 반응9필수적인 정식 통로의 NF-κB 신호 통제 한다. 이 통로의 뚜렷한 특징은 지금까지 화학적 새롭거나 IKK 복잡 한 내 IKK2/β10 의 신속 하 고 단기 활성화-IKK1 및 IKK2, 뿐만 아니라 규제 구성 요소, 니 모를 찾아서 (NF κB 필수 변조기의 구성 될 것으로 추정 )11,,1213. 2 개의 촉매 IKK subunits IKK 복합물의, 사이 IKK2는 주로 책임14 원형 IκBs (α-β,-γ)의 특정 잔류물의 인 산화에 대 한 NF-κB, 그리고 또한 비정형 IκB 단백질에 바인딩된은 NF-κB1/p105는 NF-κB p50 소 단위5의 전조 인 산화 유도 ubiquitination 그리고 proteasomal IκB (또는 p105의 처리)의 저하 리드 릴리스 및 NF κB 이합체15의 특정 집합의 활성화. IKK2의 미 규제 기능 때문에 탈 선 NF κB 활동 면역 질환2,,316에서 뿐만 아니라 많은 암에 관찰 되었습니다.
IKK2/β, 달리 IKK1/α의 활동 NF κB 개발 및 내성에 대 한 필수적입니다 정식이 아닌 통로의 신호 조절. IKK1 phosphorylates의 처리, p52의 세대의 C-터미널 IκBδ 세그먼트에 NF-κB2/p100의 특정 잔류물. Transcriptionally 활성 p52:RelB heterodimer 형성 발달 신호7,17,18,,1920느리고 지속적인 응답을 시작합니다. 흥미롭게도,이 통로의 중앙 NF κB 요소 p52의 세대는 또 다른 요인은, NF-κB 유도 니 (닉)21,22에 IKK2 또는 니 비판적으로 의존 합니다. 휴식 셀에 닉의 수준 때문에 상수 프로테아좀 종속 저하23,,2425낮은 남아 있습니다. ' 비정규 ' ligands에 의해 그리고 특정 악성 세포에서 세포의 자극, 시 닉 모집을 활성화 하 고 IKK1 안정 된다/α. 닉의 IKK1 키 니 아 제 활동 p527에 p100의 효율적인 처리를 위해 필수적인. IKK1와 닉 phosphorylate 처리 및 p52의 세대의 C-터미널 IκBδ 세그먼트에 NF-κB2/p100의 3 serines (Ser866, 870, 872). 비정규 통로의 탈 선 활성화 여러 myeloma26,,2728를 포함 하 여 많은 악성 종양에 연루 되었습니다.
비록 아무도 지금까지 것으로 밝혀졌다는 효과적인 약 IKK2/β에 대 한 몇 가지 매우 효율적이 고 구체적인 억제제 알려져 있습니다. 반면, IKK1/α-특정 억제제 스파스 있습니다. 이 일부 IKK1/α, 셀, 및 합리적인 약 디자인에 IKK1에 의해 NF-κB의 활성화의 기계 기초의 우리의 이해를 제한에 대 한 구조 및 생 화 확 적인 정보의 부족에서에서 줄기 수 있습니다. IKK2/β의 엑스레이 구조 IKK2/β29;의 인증 메커니즘에 대 한 통찰력 제공 그러나, 이러한 구조는 어떻게 다른 업스트림 자극 공개 하지 수 IKK1/α 또는 IKK2/β NF κB 활동 30,31의 명료한 세트를 규제의 활성화를 방 아 쇠. 기계적으로 IKK1/α의 뚜렷한 신호 기능을 기본을 이해 하 고 합리적인 약 디자인을 위한 플랫폼을 구축, 우리 IKK1/α의 구조 결정에 집중 했다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cellfectin/Cellfectin II</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10362100</td>
			<td>Cellfectin is now discontinued, replaced by Cellfectin II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf900 III Insect cell medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12658-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SF9 cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12659017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-IKK1 antibody</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB100-56704</td>
			<td>Previously sold by Imgenex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PentaHis antibody</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>34460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>Nitrocellulose can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford assay reagent</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>500001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28989335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon concentrator</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC801008, UFC803008, UFC201024, UFC203024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound A</td>
			<td>Bayer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calbiochem IKK-inhibitor XII</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>401491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staurosporine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>S4400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLN120B</td>
			<td>Millenium</td>
			<td>Gift item</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPPNP</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A2647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulfate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>51227, 42867, 31404,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulfate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>93593, 81210, 88276, 95904, 81255, 89510, 92897, 81285, 95172</td>
			<td>Some of them are new Cat # on SIGMA catalogue. What we had was originally from Fluka that had different Cat #.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystallization Screens</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Screen I and II (Crystal Screen HT)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index HT</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG/Ion and PEG/Ion2 (PEG/Ion HT)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEGRX 1 and PEGRx 2 (PEGRx HT)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SaltRx 1 and SaltRx 2 (SaltRx HT)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal mounts</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR8-188, 190, 192, 194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synchrotron</td>
			<td>The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy&#8217;s Argonne National Laboratory</td>
			<td>Beamline 19 ID</td>
			<td>The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy&#8217;s Argonne National Laboratory provides ultra-bright, high-energy storage ring-generated X-ray beams for research in almost all scientific disciplines.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a guide to production, crystallization, and structure determination of human ikk1/&#945;

세포 외 자극의 클래스는 NF-κB 소 단위, p52의 선구자 p100의 처리를 통해의 생성을 유도 하 IKK1/α의 활성화를 필요 합니다. p52는 homodimer 또는 heterodimer 다른 NF-κB 소 단위, RelB와 함께 작동합니다. 이러한 이합체 차례로 염증, 세포 생존, 및 세포 주기 관련된 유전자의 수백의 표정을 통제 한다. IKK1/α 주로 삼항 복합물으로 니 모 IKK2/β와 관련 된 남아 있습니다. 그러나, 그것의 작은 수영장은 또한 낮은 분자량 complex(es)로 관찰 된다. 그것은 p100 처리 작업 내의 더 큰 IKK1/α의 활성화 또는 작은 복잡 한 수영장에 의해 트리거되는 경우 불명 하다. IKK1/α의 제정 활동 여러 암 및 염증 성 질환에서 발견 되었습니다. IKK1/α의 활성화의 메커니즘을 이해 하 고 약물 표적으로 그것의 사용을 가능 하 게, 우리는 대장균, 다른 호스트 시스템에 재조합 IKK1/α를 표현, 곤충 및 포유류 세포. 에 성공 하는 우리 곤충 세포, 밀리 그램 양의 매우 순수한 단백질을 얻기, 억제제, 존재 crystallizing 및 그것의 x 선 결정 구조를 결정 감염 성 IKK1/α 잠재에 표현. 여기, 우리는 재조합 단백질, 그것의 결정 화 및 그것의 x 선 결정 구조 결정 하는 자세한 단계를 설명 합니다.

복제 및 IKK1/α의 다른 구조 식 인간 IKK1/α는 N 맨끝 hexa-히스티딘을 자사의 EcoRI 및 노트 제한 사이트 내에서 잠재 식 벡터 pFastBacHTa로 복제 하는 전체 길이 IKK1 태그. 태그는 TEV 프로 테아 제 소화에 의해 제거 될 수 있습니다. 전체 길이 IKK1/α 양쪽 끝에 유연한 영역이 있기 때문에 유연한 영역 일반적으로 렌더링 단백질 구체화 하기 어려운, 우리 IKK1/α pFastBacHT...

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A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

IκB 키 1/α (IKK1/α CHUK)는 Ser/Thr 단백질 키 니 아 NF κB 녹음 방송 요인의 활성화를 통해 주로 세포 활동의 무수 한에 관련 된 이다. 여기, 우리가 생산 및이 단백질의 크리스탈 구조 결정에 필요한 주요 단계를 설명합니다.

생산, 결정 화, 및 인간 IKK1/α의 구조 결정에 대 한 안내

A class of extracellular stimuli requires activation of IKK1/&#945; to induce generation of an NF-&#954;B subunit, p52, through processing of its ...

이 절차의 목적은 신호 기능의 기계론적 기초를 이해하고 합리적인 약물 설계를 위한 플랫폼을 구축하기 위해 인간 IKK1-알파의 생산, 결정화 및 구조적 결정에 대한 지침을 제공하는 것입니다. 이 방법은 연구원이 면역 신호 분야의 주요 쿼리에 대한 답변을 제공하는 IKK1의 구조를 결정하는 데 도움이 될 것입니다. 이 기술은 결정화에 다소 내화성인 IKK 단백질의 결정을 얻는 간소화된 경로를 설명하고 구조물을 결정하는 병목 현상을 극복하는 데 있어 다양한 중요한 정보를 제공합니다.일반적으로, 이 방법에 새로운 개별은 가용성, 잘 행동한 단백질의 밀리그램 양을 생성하기 때문에, 곤충 세포에 있는 그것의 발현을 필요로 하고, 결정화는 조건의 단지 높게 좁은 창에서 행해질 수 있기 때문에 투쟁할 것입니다. IKK1의 구조를 결정하는 데 사용되는 분자 교체 절차는 또한 매우 까다로울 수 있으며, 특히 적절한 검색 모델이 없는 경우 많은 IKK1 분자를 함유하는 비대칭 단위의 부위가 아닌 결정의 편향 특성이 좋지 않기 때문에 매우 까다로울 수 있다. 절차를 시연하는 것은 카일 슈메이트와 손지알라 호치키스, 내 실험실에서 학생들이 될 것입니다.첫날, Sf9 세포는 Sf903 곤충 세포 배지의 2밀리리터로, 6웰 플레이트의 각 우물에서 27°C의 배양합니다. 그들은 신선한 매체에 희석하여, 약 6 배 10에서 5의 밀도로, 신선한 매체에 희석하여 현탁액에 밀리리터 당 6 개의 세포에 2 ~ 3 배 10의 밀도에 도달 할 때 세포를 통과. 둘째 날, SF9 경질 시약의 8마이크로리터를 SF-903 또는 그레이스의 곤충 매체 100마이크로리터로 희석시.그런 다음 혼합물을 간략하게 소용돌이시다. 별도의 튜브에서 키트 정제 재조합 바미드 1마이크로그램을 동일한 배지의 100 마이크로리터에 희석시켰다. 희석 된 DNA와 경질 시약을 결합합니다.실온에서 15~30분 동안 배양한 후, 우물에서 배지를 제거합니다. 그런 다음 신선한 매체의 1 밀리리터를 추가합니다. 다음으로, 희석된 DNA 경전 시약 혼합물을 세포에 드롭와이즈로 추가하여, 부착 세포를 배출하지 않도록 낙하 크기를 조정한다.6 시간 후, 세포의 상단에 신선한 배지의 1.5 밀리리터를 추가합니다. 27섭씨에서 세포를 배양하고, 바이러스 감염의 징후는 12시간마다 주기적으로 우물을 검사합니다. 5일째에, 세포를 포함하는 배지를 제거, 60 72 시간 감염 후.배지를 튜브로 옮긴 후 원심분리기는 500배, 섭씨 4도에서 5분간 원심분리기를 사용한다. 완료되면 P1 바이러스 스택인 상체를 저장합니다. 첫날, 이전에 준비된 His-IKK1 세포 펠릿을 40 밀리리터의 용해 완충제에서 재보중단합니다.세포 현탁액을 얼음 위에 놓고 초음파 처리로 세포를 60%에서 70%의 듀티 사이클로, 1분 이상 간격으로 30초 지속시간의 5~10펄스를 제거합니다. 섭씨 4도에서 45분 동안 28g, 000g보다 크거나 동일한 원심분리로 용액을 명확히 하십시오. 텍스트 프로토콜에 따르면 니켈-NTA 아가로즈 수지를 준비한 후, 용출 버퍼 20밀리리터를 사용하여 중력 흐름 하에서 그의 태그가 붙은 IKK1 알파 단백질을 엘테.1~1.5밀리리터 분획을 수집합니다. 단백질을 포함하는 분획을 결합한 후에, 4섭씨에서 하룻밤 동안 TEV 프로테아제와 견본을 소화합니다. 둘째 날 아침, 염화 마그네슘, 베타 글리세로포산염, 불소나트륨, 나트륨 오르토나데이트가 27도에서 1시간 동안 ATP 1밀리머로 단백질을 배양합니다.인큐베이션에 이어 0.45 미크론 필터를 통해 단백질 용액을 필터링합니다. 그런 다음 자동화된 액체 크로마토그래피 시스템에 부착된 120 밀리리터 전소 크기 배제 컬럼에 샘플의 약 6밀리리터를 적재합니다. 평형 후, 분당 1 밀리리터의 유속도로 크기 배제 크로마토그래피를 실행하고 2 밀리리터 분획을 수집합니다.실행 하는 동안, 280 및 254 나노 미터에서 용출을 모니터링. 순수한 분획을 당긴 후 제조업체의 지시에 따라 30킬로달톤, 분자량 컷오프 원심 농축기에 농축합니다. 그런 다음 농축 된 단백질의 25 마이크로 리터 알리쿼트와 액체 질소의 플래시 동결을 분배합니다.로봇을 사용하여 결정화 시약의 파이펫 80~ 100 마이크로리터가 96웰 플레이트의 저수지로 들어갑니다. 결정화 로봇을 사용하여 IKK1의 0.2~ 0.25 마이크로리터와 동일한 양의 저수지 용액을 사용하여 억제제 복합체를 분배하고 혼합합니다. 방울을 설정 한 직후, 증발을 피하기 위해 광학적으로 명확한 필름으로 각 플레이트를 밀봉하십시오.한 접시를 섭씨 18도, 다른 접시는 차가운 방에서 섭씨 4도에 배양합니다. 편광기가 있는 스테레오 현미경을 사용하여 매일, 첫 7일 동안, 그리고 더 긴 간격으로 결정의 모양을 확인합니다. 이전에 설명한 바와 같이 IKK1 및 억제제 복합체를 준비한 후, 24웰 플레이트의 각 웰에 웰 솔루션을 전달한다.깨끗한 유리 커버슬립에 1~1.5 마이크로리터의 웰 액액을 놓습니다. IKK1과 그 억제제 복합체를 유리 커버슬립에 넣고 3~4회 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 섞는다. 접시의 각 우물의 고리에 그리스를 적용 한 후, 위에 유리 커버 슬립을 켜고 집게와 각각 잘 배치.그런 다음 유리 커버 슬립을 눌러 우물을 밀봉합니다. 24웰 플레이트의 모든 방울을 설정 한 후, 어둠 속에서 차가운 방에서 배양하십시오. 때때로 외관과 결정의 성장을 위해 현미경의 밑에 방울을 확인하십시오.크리스탈 성장이 완료되면 크리스탈이 들어있는 유리 커버 슬립을 부드럽게 제거하고 크리스탈 드롭이 위쪽으로 향하여 단단한 표면에 놓습니다. 10 마이크로리터의 저저온 A 용액을 드롭 위에 부드럽게 넣고 파이프팅으로 부드럽게 섞어 크리스탈이 닿지 않도록 합니다. 현미경을 사용하여 결정에서 액체를 천천히 제거하고 용액의 약 5 ~ 8 마이크로 리터를 유지하십시오.2.5~4마이크로리터의 저온 B 용액을 드롭에 넣고 파이펫팅으로 부드럽게 섞습니다. 크리스탈 위에 직접 공기 흐름을 피하기 위해 작은 페트리 접시로 유리 커버 슬립을 덮습니다. 5분을 기다린 후, 적절한 베이스에 장착된 적절한 냉동 루프에서 낙하에서 한 정산을 신중하게 선택합니다.액상 질소로 수정을 플래시 동결합니다. 그런 다음 싱크로트론에서 X선 회절을 준비할 때까지 데워 플라스크에 액체 질소에 담근 퍽에 냉동 루프가 함유 된 크리스탈을 저장합니다. 여러 개의 다른 IKK1 변종으로 광범위한 시험 후, 결정은 IKK 억제제 XII의 존재에서만 적합한 X 선 특성을 표시 한 잘린 구조로 얻어졌다.약한 강도의 저해상도 X선 데이터의 결합 효과, IKK1 단조변형 모델의 비대칭 단위 및 변형 변이에 많은 수의 IKK1 분자는 알려진 IKK2 모델에 비해 분자 대체 솔루션인 IKK1을 획득하고 그 구조를 결정하기 가 어려웠습니다. 다른 IKK2 구조는 4개의 다른 이머 모델에서 두 키나아제 도메인의 P578의 알파 탄소 사이의 거리가 39와 61 angstroms 사이에서 다양할 수 있도록 조광 내에서 서로 다른 단조로운 방향을 나타냈다. 고해상도 IKK2 구조를 기반으로 생성될 수 있는 저해상도 극저온 현미경 검사법과 IKK1 도메인의 고정밀 모델때문에 유용한 검색 모델을 얻을 수 있었습니다.초기 모델은 IKK2 단조량체와 58개의 협소항의 N 단자 개구부를 기준으로 키나아제 도메인의 방향이 24도 회전된 것을 나타냈습니다. 52-angstrom이 열리는 조광기 중 하나를 모델로 사용하여 비대칭 유닛에 6개의 디머가 배치되었습니다. 일단 마스터되면 제대로 수행되는 경우 이 기술을 몇 달 안에 실행할 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안, 수용성, 활성 및 잘 행동 한 단백질의 획득이 첫 번째 중요한 단계임을 기억하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 IKK1 단백질의 구조를 구체화하고 결정하는 데 성공하기 위해 근면한 세부 사항으로 따라야 하는 모든 단계에 대한 일반적인 이해가 필요합니다. 이 절차를 배우는, 키나제 미토겐 신호에 대한 추가 질문에 대답하기 위하여 또한 결정할 수 있는 그밖 IKK 가족 단백질의 아직도 구조물이 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/&#945;

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

항온, 발현, 정제, 인간 세로토닌 전달체 결정화 바운드<em&gt; S</em&gt; 시탈 로프 람

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

연구

생화학

Combining Wet and Dry Lab Techniques to Guide the Crystallization of Large Coiled-coil Containing Proteins

습식 및 건식 연구소의 기술을 결합하면 대형 코일 코일 포함하는 단백질의 결정화를 안내합니다

Obtaining crystals for structure determination can be a difficult and time consuming proposition for any protein. Coiled-coil proteins and domains are ...

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

생산, 결정화 및 구조 결정의<em&gt; C. 남과 어울리지 않는</em&gt; PPEP-1 Microseeding 및 아연 SAD를 통해

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

생체 분자 구조 결정을위한 단일 분자 수준의 고정밀 FRET

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO

NEMO의 IKK 결합 도메인의 생산, 결정화 및 구조 결정

NEMO is a scaffolding protein which plays an essential role in the NF-&#954;B pathway by assembling the IKK-complex with the kinases IKK&#945; and ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

다목적 미세 유체 칩의 직렬 결정학에 의한 효소의 결정화 및 구조적 결정: 기질 복합체

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

The Extraction of Liver Glycogen Molecules for Glycogen Structure Determination

Liver glycogen is a hyperbranched glucose polymer that is involved in the maintenance of blood sugar levels in animals. The properties of glycogen are ...

Efficient and Scalable Production of Full-length Human Huntingtin Variants in Mammalian Cells using a Transient Expression System

Full-length huntingtin (FL HTT) is a large (aa 1-3,144), ubiquitously expressed, polyglutamine (polyQ)-containing protein with a mass of approximately 350 ...

High-Throughput Screening for Protein Crystallization

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography (Video) | JoVE 

단백질 결정학을 위한 결정 적중을 얻기 위한 고처리량 스크리닝

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into ...

A Fibrinolytic Enzyme-Based Method to Study Cerebral Thrombus Cell Components

A Comprehensive Approach to Analyze the Cell Components of Cerebral Blood Clots

A Novel Method for Comprehensive Cell Component Analysis of Cerebral Blood Clots (Video) | JoVE

뇌혈전의 세포 성분을 분석하기 위한 포괄적인 접근법

Cerebral thrombosis, a blood clot in a cerebral artery or vein, is the most common type of cerebral infarction. The study of the cell components of ...