Name: a guide to production, crystallization, and structure determination of human ikk1/&#945;
Uploaded: 2018-11-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/ÃŽÂ± at JoVE.com

Vi takker ansatte ved beamlines 19ID, 24ID og 13ID på Avansert Foton kilde, Lemont, IL, støtte under datainnsamlingen på forskjellige krystaller. Vi er takknemlige for Dmitry Lyumkis, Salk Institute for henting oss lav oppløsning cryo-EM kartet i tidlige stadier av EM kart/modell bygning som ble brukt til å bygge den første IKK1 molekylære erstatning søk modellen. Forskningen førte til disse resultatene har mottatt finansiering fra NIH tilskudd AI064326, CA141722 og GM071862 til GG. SP er Wellcome Trust DBT India mellomliggende Fellow.

1. forberedelse av rekombinant Virus egnet for storskala uttrykk for IKK1/α
<ol><li>
P1 virus forberedelse 32<ol>
<li>Dag 1: Plate Sf9 celler (~ 6 X 105) (passasje tall mindre enn 10) i 2 mL Sf900 III insekt celle medium i hver godt av en 6-vel plate og ruge på 27 ° C. Passasje celler når de når en tetthet av 2 til 3 X 106 celler per mL i suspensjon fortynne i frisk media på en tetthet av ~ 6 X 105.</li>
		<li>Dag 2: Fortynne 8 µL av Sf9-h...

<ol>
	<li>Xia, Y., Shen, S., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB,+an+active+player+in+human+cancers.">NF-kappaB, an active player in human cancers.</a> Cancer immunology research. 2 (9), 823-830 (2014).</li><li>Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity,+inflammation,+and+cancer.">Immunity, inflammation, and cancer.</a> Cell. 140 (6), 883-899 (2010).</li><li>Ben-Neriah, Y., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+meets+cancer,+with+NF-kappaB+as+the+matchmaker.">Inflammation meets cancer, with NF-kappaB as the matchmaker.</a> Nature immunology. 12 (8), 715-723 (2011).</li><li>Hinz, M., Scheidereit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IkappaB+kinase+complex+in+NF-kappaB+regulation+and+beyond.">The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond.</a> EMBO reports. 15 (1), 46-61 (2014).</li><li>Karin, M., Ben-Neriah, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+meets+ubiquitination:+the+control+of+NF-[kappa]B+activity.">Phosphorylation meets ubiquitination: the control of NF-[kappa]B activity.</a> Annu Rev Immunol. 18, 621-663 (2000).</li><li>Ghosh, S., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Missing+pieces+in+the+NF-kappaB+puzzle.">Missing pieces in the NF-kappaB puzzle.</a> Cell. 109, S81-S96 (2002).</li><li>Sun, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+noncanonical+NF-kappaB+pathway.">The noncanonical NF-kappaB pathway.</a> Immunol Rev. 246 (1), 125-140 (2012).</li><li>Bonizzi, G., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+NF-kappaB+activation+pathways+and+their+role+in+innate+and+adaptive+immunity.">The two NF-kappaB activation pathways and their role in innate and adaptive immunity.</a> Trends Immunol. 25 (6), 280-288 (2004).</li><li>DiDonato, J. A., Hayakawa, M., Rothwarf, D. M., Zandi, E., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cytokine-responsive+IkappaB+kinase+that+activates+the+transcription+factor+NF-kappaB.">A cytokine-responsive IkappaB kinase that activates the transcription factor NF-kappaB.</a> Nature. 388 (6642), 548-554 (1997).</li><li>Werner, S. L., Barken, D., Hoffmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulus+specificity+of+gene+expression+programs+determined+by+temporal+control+of+IKK+activity.">Stimulus specificity of gene expression programs determined by temporal control of IKK activity.</a> Science. 309 (5742), 1857-1861 (2005).</li><li>Zandi, E., Rothwarf, D. M., Delhase, M., Hayakawa, M., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IkappaB+kinase+complex+(IKK)+contains+two+kinase+subunits,+IKKalpha+and+IKKbeta,+necessary+for+IkappaB+phosphorylation+and+NF-kappaB+activation.">The IkappaB kinase complex (IKK) contains two kinase subunits, IKKalpha and IKKbeta, necessary for IkappaB phosphorylation and NF-kappaB activation.</a> Cell. 91 (2), 243-252 (1997).</li><li>Rothwarf, D. M., Zandi, E., Natoli, G., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IKK-gamma+is+an+essential+regulatory+subunit+of+the+IkappaB+kinase+complex.">IKK-gamma is an essential regulatory subunit of the IkappaB kinase complex.</a> Nature. 395 (6699), 297-300 (1998).</li><li>Yamaoka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementation+cloning+of+NEMO,+a+component+of+the+IkappaB+kinase+complex+essential+for+NF-kappaB+activation.">Complementation cloning of NEMO, a component of the IkappaB kinase complex essential for NF-kappaB activation.</a> Cell. 93 (7), 1231-1240 (1998).</li><li>Li, Z. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IKKbeta+subunit+of+IkappaB+kinase+(IKK)+is+essential+for+nuclear+factor+kappaB+activation+and+prevention+of+apoptosis.">The IKKbeta subunit of IkappaB kinase (IKK) is essential for nuclear factor kappaB activation and prevention of apoptosis.</a> J Exp Med. 189 (11), 1839-1845 (1999).</li><li>Hayden, M. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shared+principles+in+NF-kappaB+signaling.">Shared principles in NF-kappaB signaling.</a> Cell. 132 (3), 344-362 (2008).</li><li>Sun, S. C., Chang, J. H., Jin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+nuclear+factor-kappaB+in+autoimmunity.">Regulation of nuclear factor-kappaB in autoimmunity.</a> Trends Immunol. 34 (6), 282-289 (2013).</li><li>Claudio, E., Brown, K., Park, S., Wang, H., Siebenlist, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAFF-induced+NEMO-independent+processing+of+NF-kappa+B2+in+maturing+B+cells.">BAFF-induced NEMO-independent processing of NF-kappa B2 in maturing B cells.</a> Nat Immunol. 3 (10), 958-965 (2002).</li><li>Senftleben, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+by+IKKalpha+of+a+second,+evolutionary+conserved,+NF-kappa+B+signaling+pathway.">Activation by IKKalpha of a second, evolutionary conserved, NF-kappa B signaling pathway.</a> Science. 293 (5534), 1495-1499 (2001).</li><li>Coope, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40+regulates+the+processing+of+NF-kappaB2+p100+to+p52.">CD40 regulates the processing of NF-kappaB2 p100 to p52.</a> EMBO J. 21 (20), 5375-5385 (2002).</li><li>Dejardin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lymphotoxin-beta+receptor+induces+different+patterns+of+gene+expression+via+two+NF-kappaB+pathways.">The lymphotoxin-beta receptor induces different patterns of gene expression via two NF-kappaB pathways.</a> Immunity. 17 (4), 525-535 (2002).</li><li>Xiao, G., Fong, A., Sun, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+p100+processing+by+NF-kappaB-inducing+kinase+involves+docking+IkappaB+kinase+alpha+(IKKalpha)+to+p100+and+IKKalpha-mediated+phosphorylation.">Induction of p100 processing by NF-kappaB-inducing kinase involves docking IkappaB kinase alpha (IKKalpha) to p100 and IKKalpha-mediated phosphorylation.</a> The Journal of biological chemistry. 279 (29), 30099-30105 (2004).</li><li>Xiao, G., Harhaj, E. W., Sun, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB-inducing+kinase+regulates+the+processing+of+NF-kappaB2+p100.">NF-kappaB-inducing kinase regulates the processing of NF-kappaB2 p100.</a> Molecular cell. 7 (2), 401-409 (2001).</li><li>Qing, G., Qu, Z., Xiao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+basally+translated+NF-kappaB-inducing+kinase+(NIK)+protein+functions+as+a+molecular+switch+of+processing+of+NF-kappaB2+p100.">Stabilization of basally translated NF-kappaB-inducing kinase (NIK) protein functions as a molecular switch of processing of NF-kappaB2 p100.</a> J Biol Chem. 280 (49), 40578-40582 (2005).</li><li>Zarnegar, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncanonical+NF-kappaB+activation+requires+coordinated+assembly+of+a+regulatory+complex+of+the+adaptors+cIAP1,+cIAP2,+TRAF2+and+TRAF3+and+the+kinase+NIK.">Noncanonical NF-kappaB activation requires coordinated assembly of a regulatory complex of the adaptors cIAP1, cIAP2, TRAF2 and TRAF3 and the kinase NIK.</a> Nat Immunol. 9 (12), 1371-1378 (2008).</li><li>Vallabhapurapu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonredundant+and+complementary+functions+of+TRAF2+and+TRAF3+in+a+ubiquitination+cascade+that+activates+NIK-dependent+alternative+NF-kappaB+signaling.">Nonredundant and complementary functions of TRAF2 and TRAF3 in a ubiquitination cascade that activates NIK-dependent alternative NF-kappaB signaling.</a> Nat Immunol. 9 (12), 1364-1370 (2008).</li><li>Annunziata, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequent+engagement+of+the+classical+and+alternative+NF-kappaB+pathways+by+diverse+genetic+abnormalities+in+multiple+myeloma.">Frequent engagement of the classical and alternative NF-kappaB pathways by diverse genetic abnormalities in multiple myeloma.</a> Cancer cell. 12 (2), 115-130 (2007).</li><li>Keats, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promiscuous+mutations+activate+the+noncanonical+NF-kappaB+pathway+in+multiple+myeloma.">Promiscuous mutations activate the noncanonical NF-kappaB pathway in multiple myeloma.</a> Cancer cell. 12 (2), 131-144 (2007).</li><li>Staudt, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+activation+of+NF-kappaB.">Oncogenic activation of NF-kappaB.</a> Cold Spring Harbor perspectives in biology. 2 (6), a000109 (2010).</li><li>Polley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structural+basis+for+IkappaB+kinase+2+activation+via+oligomerization-dependent+trans+auto-phosphorylation.">A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation.</a> PLoS Biol. 11 (6), e1001581 (2013).</li><li>Hinz, M., Scheidereit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IkappaB+kinase+complex+in+NF-kappaB+regulation+and+beyond.">The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond.</a> EMBO Rep. 15 (1), 46-61 (2014).</li><li>Scheidereit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IkappaB+kinase+complexes:+gateways+to+NF-kappaB+activation+and+transcription.">IkappaB kinase complexes: gateways to NF-kappaB activation and transcription.</a> Oncogene. 25 (51), 6685-6705 (2006).</li><li>Luckow, V. A., Lee, S. C., Barry, G. F., Olins, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+infectious+recombinant+baculoviruses+by+site-specific+transposon-mediated+insertion+of+foreign+genes+into+a+baculovirus+genome+propagated+in+Escherichia+coli.">Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli.</a> J Virol. 67 (8), 4566-4579 (1993).</li><li>Polley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Basis+for+the+Activation+of+IKK1/alpha.">Structural Basis for the Activation of IKK1/alpha.</a> Cell reports. 17 (8), 1907-1914 (2016).</li><li>Otwinowski, Z. a. M., W, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+X-ray+Diffraction+Data+Collected+in+Oscillation+Mode.">Processing of X-ray Diffraction Data Collected in Oscillation Mode.</a> Methods in Enzymology. 276 (Macromolecular Crystallography, part A), 307-326 (1997).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+human+IkappaB+kinase+beta+asymmetric+dimer.">Crystal structure of a human IkappaB kinase beta asymmetric dimer.</a> J Biol Chem. 288 (31), 22758-22767 (2013).</li><li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+development+of+Coot.">Features and development of Coot.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).</li><li>McCoy, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phaser+crystallographic+software.">Phaser crystallographic software.</a> Journal of applied crystallography. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).</li><li>Vagin, A. T., Teplyakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MOLREP:+an+automated+program+for+molecular+replacement.">MOLREP: an automated program for molecular replacement.</a> J. Appl. Cryst. 30, 1022-1025 (1997).</li><li>Brunger, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Version+1.2+of+the+Crystallography+and+NMR+system.">Version 1.2 of the Crystallography and NMR system.</a> Nature protocols. 2 (11), 2728-2733 (2007).</li><li>Brunger, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallography+&amp;+NMR+system:+A+new+software+suite+for+macromolecular+structure+determination.">Crystallography &amp; NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological. 54 (Pt 5), 905-921 (1998).</li><li>McRee, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XtalView:+a+visual+protein+crystallographic+software+system+for+X11/Xview.">XtalView: a visual protein crystallographic software system for X11/Xview.</a> J. Mol Graph. 10, 44-47 (1992).</li><li>Schroder, G. F., Levitt, M., Brunger, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+biomolecular+crystallography+with+low-resolution+data.">Super-resolution biomolecular crystallography with low-resolution data.</a> Nature. 464 (7292), 1218-1222 (2010).</li><li>Polley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structural+basis+for+IkappaB+kinase+2+activation+via+oligomerization-dependent+trans+auto-phosphorylation.">A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation.</a> PLoS biology. 11 (6), e1001581 (2013).</li><li>Christopher, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+discovery+of+2-amino-3,5-diarylbenzamide+inhibitors+of+IKK-alpha+and+IKK-beta+kinases.">The discovery of 2-amino-3,5-diarylbenzamide inhibitors of IKK-alpha and IKK-beta kinases.</a> Bioorganic &amp; medicinal chemistry letters. 17 (14), 3972-3977 (2007).</li><li>Karplus, P. A., Diederichs, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+crystallographic+model+and+data+quality.">Linking crystallographic model and data quality.</a> Science. 336 (6084), 1030-1033 (2012).</li><li>Chen, V. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MolProbity:+all-atom+structure+validation+for+macromolecular+crystallography.">MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 1), 12-21 (2010).</li></ol>

Produksjon, krystallisering og struktur løsning av to relaterte IKK proteiner Vi begynte for å bestemme X-ray krystall strukturen av IKK1/α med forestillingen om at det ville være en relativt enkel øvelse gitt vår erfaring med IKK2/β protein produksjon, krystallisering og proteinstrukturer. Men var vi svært overrasket over at disse to relaterte proteiner oppførte seg veldig annerledes om enkel krystallisering. Til tross for forsøk fra flere høyprofilerte laboratorier tok fastsettelse av IKK...

Transcriptional aktiviteter av NF-κB dimeric transkripsjonsfaktorer kreves for mangfoldig cellulære funksjoner, fra betennelse og immunitet til overlevelse og død. Disse aktivitetene er strengt kontrollert i celler og tap av forordning fører til ulike pathological betingelser, inkludert autoimmune sykdommer og kreft1,2,3. I fravær av en stimulus holdes aktivitetene til NF-κB hemmet av IκB (Inhibitor av - κB) proteiner4. Fosforylering av bestemte Ser rester på IκB proteiner merkes for ubiquitination og senere proteasomal fornedrelse eller Selektiv behandling5. To svært homologe Ser/Thr kinaser, IKK2/β og IKK1/α, opptre som sentral regulatorer av NF-κB ved å utføre disse fosforylering hendelser6,7.
Interaksjoner mellom en ligand og en reseptor transduces et signal gjennom en rekke meglere fører til aktivering av NF-κB faktorer. NF-κB signal prosessen kan grovt klassifiseres i to forskjellige baner-godkjent og ikke-kanoniske (alternativ)8. Aktiviteten til IKK2/β regulerer primært NF-κB noe av den kanoniske veien som er avgjørende for inflammatoriske og medfødte immunreaksjoner9. En distinkt funksjon i denne veien er en rask og kortvarige aktivering av IKK2/β10 innenfor en hittil biokjemisk uncharacterized IKK komplekse, antas å være sammensatt av IKK1 og IKK2, samt en regulerende komponent, NEMO (NF-κB viktig Modulator )11,12,13. Mellom de to katalytisk IKK underenheter av IKK komplekset, IKK2 er primært ansvarlig14 for fosforylering av bestemte rester av prototypiske IκBs (α, - β, og -γ) bundet til NF-κB, og også en atypisk IκB protein, NF-κB1/p105, som er et forløperen til NF-κB p50 delenhet5. Fosforylering indusert ubiquitination og proteasomal nedbrytning av IκB (eller behandling av p105) fører til utgivelsen og aktivering av et bestemt sett med NF-κB dimers15. Avvikende NF-κB aktivitet på grunn av mis regulert funksjon av IKK2 har blitt observert i mange kreft samt som autoimmune sykdommer2,3,16.
I motsetning til IKK2/β regulerer aktiviteten til IKK1/α NF-κB noe av den ikke-kanoniske veien, som er avgjørende for utvikling og immunitet. IKK1 phosphorylates bestemt rester av NF-κB2/p100 på sitt C-terminalen IκBδ segment, som fører til behandlingen og generering av p52. Dannelsen av transcriptionally aktive p52:RelB heterodimer starter en langsom og vedvarende svar utviklingsmessige signaler,7,,17,,18,,19,,20. Interessant, er generering av den sentrale NF-κB faktor p52 av denne veien kritisk avhengig av en annen faktor, NF-κB Inducing Kinase (NIK)21,22, men ikke på IKK2 eller NEMO. I hvile celler fortsatt nivået på NIK lav grunnet sin konstant proteasome-avhengige fornedrelse23,24,25. Ved stimulering av celler av "ikke-kanoniske" ligander, og i enkelte ondartede celler, NIK blir stabilisert for å rekruttere og aktivere IKK1 / α. Kinase aktiviteter både NIK og IKK1 er avgjørende for effektiv behandling av p100 i p527. IKK1 og NIK phosphorylate tre serines (Ser866, 870 og 872) av NF-κB2/p100 på sitt C-terminalen IκBδ segment fører til behandlingen og generering av p52. Avvikende aktivering av den ikke-kanoniske veien har vært innblandet i mange malignitet inkludert myelom26,27,28.
Flere svært effektiv og spesifikke hemmere mot IKK2/β er kjent, selv om ingen så langt har vist seg for å være et effektivt medikament. IKK1/α-spesifikke hemmere er sparsom. Dette kan stammer delvis fra vår mangel på strukturelle og biokjemiske informasjon på IKK1/α, som begrenser vår forståelse av mekanistisk grunnlaget for aktivering av NF-κB av IKK1 i cellene og rasjonell stoff design. X-ray strukturer av IKK2/β gitt oss innsikt i mekanismen aktivisering IKK2/β29; men disse strukturene ikke kunne avsløre hvordan ulike oppstrøms stimuli utløse aktivering av IKK1/α eller IKK2/β å regulere adskilt apparater av NF-κB aktiviteter 30,31. Å forstå grunnlag mekanistisk underliggende distinkte signalerer funksjon IKK1/α, og å etablere en plattform for rasjonell narkotika design, fokuserte vi på å bestemme strukturen til IKK1/α.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cellfectin/Cellfectin II</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10362100</td>
			<td>Cellfectin is now discontinued, replaced by Cellfectin II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf900 III Insect cell medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12658-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SF9 cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12659017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-IKK1 antibody</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB100-56704</td>
			<td>Previously sold by Imgenex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PentaHis antibody</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>34460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>Nitrocellulose can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford assay reagent</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>500001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28989335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon concentrator</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC801008, UFC803008, UFC201024, UFC203024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound A</td>
			<td>Bayer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calbiochem IKK-inhibitor XII</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>401491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staurosporine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>S4400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLN120B</td>
			<td>Millenium</td>
			<td>Gift item</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPPNP</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A2647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulfate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>51227, 42867, 31404,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulfate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>93593, 81210, 88276, 95904, 81255, 89510, 92897, 81285, 95172</td>
			<td>Some of them are new Cat # on SIGMA catalogue. What we had was originally from Fluka that had different Cat #.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystallization Screens</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Screen I and II (Crystal Screen HT)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index HT</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG/Ion and PEG/Ion2 (PEG/Ion HT)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEGRX 1 and PEGRx 2 (PEGRx HT)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SaltRx 1 and SaltRx 2 (SaltRx HT)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal mounts</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR8-188, 190, 192, 194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synchrotron</td>
			<td>The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy&#8217;s Argonne National Laboratory</td>
			<td>Beamline 19 ID</td>
			<td>The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy&#8217;s Argonne National Laboratory provides ultra-bright, high-energy storage ring-generated X-ray beams for research in almost all scientific disciplines.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a guide to production, crystallization, and structure determination of human ikk1/&#945;

En klasse ekstracellulære stimuli krever aktivering av IKK1/α å indusere generasjon av en NF-κB-underenheten, p52, gjennom behandling av sin forløper p100. p52 fungerer som en homodimer eller heterodimer med en annen NF-κB-underenheten, RelB. Disse dimers regulere igjen uttrykk for hundrevis av gener involvert i betennelser, celle overlevelse og celle syklus. IKK1/α fortsatt hovedsakelig forbundet med IKK2/β og NEMO som en trefoldig kompleks. Men er et lite basseng av det også observert som en lav molekylvekt complex(es). Det er ukjent om p100 behandling aktiviteten utløses av aktivering av IKK1/α i større eller mindre komplekse bassenget. Konstituerende aktiviteten til IKK1/α påvist i flere kreft og inflammatory lidelser. For å forstå mekanismen av aktivering av IKK1/α, og aktivere bruken som narkotika mål, uttrykte vi rekombinant IKK1/α i andre systemer, som E. coli, insekt, og pattedyrceller. Vi lyktes i å uttrykke løselig IKK1/α i baculovirus infisert insekt celler, skaffe mg mengder av svært ren protein, bandets det i nærvær av hemmere og å bestemme dens X-ray krystallstruktur. Her beskriver vi detaljerte trinn for å produsere rekombinant protein og dens krystallisering sin X-ray krystall proteinstrukturer.

Kloning og uttrykk for ulike konstruksjoner av IKK1/α Full lengde menneskelige IKK1/α ble klonet i baculovirus uttrykk vektor pFastBacHTa i sin EcoRI og NotI begrensning områder å få en N-terminal hexa-histidin merket IKK1. Koden kan fjernes av TEV protease fordøyelse. Siden full lengde IKK1/α inneholder fleksible områder i begge ender, og fleksibel områder vanligvis gjengi et protein vanskelig å utkrystallisere, klonet vi ulike avkortet fragmenter av IKK1/α...

Watch this Scientific Journal Video about A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/ÃŽÂ± at JoVE.com

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

IκB Kinase 1/î± (IKK1/α CHUK) er en Ser/Thr protein kinase som er involvert i et mylder av mobilnettet aktiviteter primært gjennom aktivering av NF-κB transkripsjonsfaktorer. Her beskriver vi de viktigste trinnene som er nødvendig for produksjon og krystall proteinstrukturer av dette proteinet.

En Guide til produksjon, krystallisering og proteinstrukturer av menneskelig IKK1/α

A class of extracellular stimuli requires activation of IKK1/&#945; to induce generation of an NF-&#954;B subunit, p52, through processing of its ...

Målet med denne prosedyren er å gi veiledning for produksjon, krystallisering og strukturell bestemmelse av menneskelig IKK1-alfa for å forstå det mekanistiske grunnlaget for signalfunksjonen og å etablere plattformer for rasjonell legemiddeldesign. Denne metoden bør hjelpe forskere med å bestemme strukturen i IKK1, som ville gi svar på viktige spørsmål innen immunsignalering. Denne teknikken beskriver en strømlinjeformet vei til å skaffe krystaller av IKK-proteiner, som er ganske ildfaste til krystallisering og å gi ulike kritiske opplysninger i å overvinne flaskehalser for å bestemme strukturene.Generelt vil personer som er nye til denne metoden slite, fordi generering av milligram mengder løselig, veloppdragent protein, krever uttrykk i insektceller, og krystallisering kan gjøres under bare et svært smalt vindu av forhold. Den molekylære erstatningsprosedyren som brukes til å bestemme strukturen til IKK1 kan også være svært vanskelig, spesielt på grunn av dårlig nedbøyningsegenskap av krystallene, ikke på stedet av den asymmetriske enheten som inneholder mange IKK1 molekyler i fravær av passende søkemodeller. Demonstrere prosedyrene vil være Kyle Shumate og Sonjiala Hotchkiss, studenter fra laboratoriet mitt.På dag én, plate Sf9 celler i to milliliter av Sf903 insektcelle medium, i hver brønn av en seks-brønns plate og inkubere ved 27 grader Celsius. Pass cellene når de når en tetthet på to til tre ganger 10 til de seks cellene per milliliter i suspensjon ved å fortynne den til friske medier, med en tetthet på omtrent seks ganger 10 til de fem. På dag to fortynner du åtte mikroliter sf9 transfection reagens i 100 mikroliter sF-903 eller Grace's Insect Medium.Deretter virvler blandingen kort. I et eget rør fortynner du ett mikrogram kit-renset rekombinant bacmid i 100 mikroliter av samme medium. Kombiner fortynnet DNA og transfection reagens.Etter inkubering ved romtemperatur i 15 til 30 minutter, fjern mediet fra brønnen. Tilsett deretter en milliliter friskt medium. Deretter legger du til den fortynnede DNA transfection reagensblandingen dropwise på cellene, justerer dråpestørrelsen slik at den ikke løsner tilhengerceller.Etter seks timer, legg til 1,5 milliliter friskt medium på toppen av cellene. Inkuber cellene ved 27 grader Celsius, og kontroller brønnene med jevne mellomrom hver 12. På dag fem fjerner du mediet som inneholder celler, 60 til 72 timer etter infeksjon.Etter overføring av mediet til rør, sentrifuge i fem minutter på 500 ganger g og fire grader Celsius. Når du er ferdig, lagre supernatant, som er P1 virus stabel. På dag én, resuspend den tidligere forberedt His-IKK1 celle pellet i 40 milliliter lysis buffer.Plasser cellesuspensjonen på is og lyse cellene ved sonikering på 60% til 70% plikt sykluser og fem til 10 pulser på 30-sekunders varighet med et intervall større enn ett minutt. Klargjør lysatet ved sentrifugering på større enn eller lik 28,000 g i 45 minutter ved fire grader Celsius. Etter å ha forberedt en Nickel-NTA Agarose harpiks, i henhold til tekstprotokollen, elute His-merket IKK1 alfa protein under tyngdekraften flyt ved hjelp av 20 milliliter elution buffer.Samle en til 1,5 milliliter brøker. Etter å ha kombinert fraksjonene som inneholder proteinet, fordøye prøven med TEV protease over natten på fire grader Celsius. Om morgenen på dag to inkuber proteinet med en millimolar ATP, i nærvær av magnesiumklorid, beta-glyserofosfat, natriumfluorid og natriumorthovanadate i en time ved 27 grader Celsius.Etter inkubasjon filtrerer du proteinoppløsningen gjennom et 0,45 mikronfilter. Deretter laster du omtrent seks milliliter av prøven på en 120 milliliter forberedende størrelsesekskluderingskolonne, festet til et automatisert flytende kromatografisystem. Etter likevekt kjører du størrelsesekskluderingskromatografien med en strømningshastighet på én milliliter per minutt og samler to milliliterfraksjoner.Under løpet, overvåke elution på 280 og 254 nanometer. Etter å ha trukket de rene fraksjonene, konsentrat i en 30-kilodalton, molekylvekt cut-off sentrifugalkonsentrator, etter produsentens instruksjoner. Dispenser deretter 25-mikroliter aliquots av konsentrert protein og flash-fryse i flytende nitrogen.Ved hjelp av en robot, pipette 80 til 100 mikroliter av en krystallisering reagens i reservoaret av en 96-brønns plate. Bruk en krystalliseringsrobot, dispenser og bland 0,2 til 0,25 mikroliter IKK1 og dets inhibitorkompleks med samme volum reservoarløsning. Umiddelbart etter at du har satt dråpene, forsegler du hver plate med optisk klare filmer for å unngå fordampning.Inkuber en plate ved 18 grader Celsius og den andre platen ved fire grader Celsius i et kaldt rom. Bruk et stereomikroskop med en polarisator for å se etter utseende av krystall i hver dråpe, hver dag, de første syv dagene og deretter med lengre intervaller. Etter å ha forberedt IKK1 og dets inhibitorkompleks som tidligere beskrevet, overfører du brønnløsningene til hver brønn på en 24-brønnsplate.Plasser ett til 1,5 mikroliter brønnoppløsning på en ren glassdeksler. Tilsett et likt volum av IKK1 og dets inhibitor kompleks til glassdeksler og bland forsiktig ved å pipettere opp og ned tre til fire ganger. Etter påføring av fett på ringene på hver brønn av platen, snu glassdeksleglasset og plasser på den respektive brønnen med tang.Tet deretter brønnen ved å trykke ned på glassdeksleglasset. Etter å ha satt opp alle dråpene i 24-brønnsplaten, inkuber i det kalde rommet, i mørket. Av og til sjekke dråpene under et mikroskop for utseende og vekst av krystaller.Når krystallveksten er fullført, fjern forsiktig glassdeksleglasset som inneholder krystallen og plasserer den på en fast overflate med krystallfallet vendt oppover. Tilsett forsiktig 10 mikroliter cryo A-løsning på toppen av dråpen og bland forsiktig ved å pipetter slik at krystallen ikke berøres. Bruk et mikroskop, fjern sakte litt væske fra krystallen og hold omtrent fem til åtte mikroliter av løsningen.Tilsett forsiktig 2,5 til fire mikroliter cryo B-oppløsning på dråpen og bland forsiktig ved pipettering. Dekk glassdeksleglasset med en liten petriskål for å unngå direkte luftstrøm over krystallen. Etter å ha ventet fem minutter, velg forsiktig en enkelt krystall fra fallet i en passende kryoloop montert på en riktig base.Flash-fryse krystallen i flytende nitrogen. Oppbevar deretter krystallen som inneholder kryoloop i en puck nedsenket i flytende nitrogen i en Dewar kolbe til den er klar for røntgendiffraksjon ved synchrotron. Etter omfattende studier med flere forskjellige IKK1-varianter ble krystaller oppnådd med en avkortet konstruksjon, som viste egnede røntgenegenskaper bare i nærvær av IKK-hemmeren XII.Den kombinerte effekten av røntgendata med lav oppløsning med svake intensiteter, et stort antall IKK1-molekyler i den asymmetriske enheten og konformasjonsvariasjonen av IKK1 monomerisk-dimerisk modell, sammenlignet med kjente IKK2-modeller, gjorde det vanskelig å få tak i en molekylær erstatningsløsning, IKK1, og bestemme strukturen. Ulike IKK2-strukturer indikerte forskjellig inter-monomer orientering innenfor sine dimers slik at avstanden mellom alfakarbonene til P578 i de to kinasedomenene, i fire forskjellige dimer-modeller, varierte mellom 39 og 61 angstroms. Å skaffe en nyttig søkemodell var mulig på grunn av lavoppløsnings kryoelektronmikroskopikartet og en høy nøyaktighetsmodell av IKK1-domener som kan genereres basert på en høyoppløselig IKK2-struktur.Den første modellen indikerte en orientering av kinase domene rotert 24 grader i forhold til en IKK2 monomer og en N-terminal åpning av 58 angstroms. Ved hjelp av en av dimers med 52-angstrom åpningen som modell, seks dimers i asymmetrisk enhet ble plassert. Når mestret, kan denne teknikken utføres om et par måneder, hvis den utføres riktig.Mens du prøver denne prosedyren, er det viktig å huske at oppnåelse av et løselig, aktivt og veloppdragent protein er det første kritiske trinnet. Etter å ha sett denne videoen, bør du ha en god generell forståelse av alle trinnene som må følges i omhyggelig detalj, for å lykkes i å krystallisere og bestemme strukturen av IKK1 protein. Lære denne prosedyren, Det er fortsatt strukturer av andre IKK familie proteiner som også kan bestemmes for å svare på flere spørsmål om kinase-mitogen signalering.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/&#945;

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Rensing, og Krystallisering av Human Serotonin Transporter Bound til<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Combining Wet and Dry Lab Techniques to Guide the Crystallization of Large Coiled-coil Containing Proteins

Kombinere våte og tørre lab teknikker for å lede Krystallisering av Store Coiled-spiral inneholder proteiner

Obtaining crystals for structure determination can be a difficult and time consuming proposition for any protein. Coiled-coil proteins and domains are ...

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Produksjon, krystallisering og struktur Bestemmelse av<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-en via Microseeding og sink-SAD

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

Høy presisjon FRET ved enkeltmolekylivå for biomolekylstrukturbestemmelse

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO

Produksjon, krystallisering og struktur bestemmelse av det IKK-bindende domenet til NEMO

NEMO is a scaffolding protein which plays an essential role in the NF-&#954;B pathway by assembling the IKK-complex with the kinases IKK&#945; and ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

Krystallisering og strukturell bestemmelse av et enzym:Substrat kompleks av seriell krystallografi i en allsidig mikrofluidisk chip

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

The Extraction of Liver Glycogen Molecules for Glycogen Structure Determination

Liver glycogen is a hyperbranched glucose polymer that is involved in the maintenance of blood sugar levels in animals. The properties of glycogen are ...

Efficient and Scalable Production of Full-length Human Huntingtin Variants in Mammalian Cells using a Transient Expression System

Full-length huntingtin (FL HTT) is a large (aa 1-3,144), ubiquitously expressed, polyglutamine (polyQ)-containing protein with a mass of approximately 350 ...

High-Throughput Screening for Protein Crystallization

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography (Video) | JoVE 

Høy gjennomstrømningsscreening for å oppnå krystalltreff for proteinkrystallografi

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into ...

A Fibrinolytic Enzyme-Based Method to Study Cerebral Thrombus Cell Components

A Comprehensive Approach to Analyze the Cell Components of Cerebral Blood Clots

A Novel Method for Comprehensive Cell Component Analysis of Cerebral Blood Clots (Video) | JoVE

En omfattende tilnærming for å analysere cellekomponentene i cerebrale blodpropper

Cerebral thrombosis, a blood clot in a cerebral artery or vein, is the most common type of cerebral infarction. The study of the cell components of ...