Name: a guide to production, crystallization, and structure determination of human ikk1/&#945;
Uploaded: 2018-11-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/ÃŽÂ± at JoVE.com

Agradecemos os funcionários a 19ID de Luz Síncroton, 24ID e 13ID no Advanced Photon Source, Lemont, IL, pelo apoio durante a coleta de dados em vários cristais. Nós estamos gratos ao Dmitry Lyumkis, Instituto Salk para buscar-no mapa de cryo-EM baixa resolução em estágios iniciais EM mapa/modelo de edifício, que foi usado para construir o modelo de pesquisa de substituição molecular inicial do IKK1. A pesquisa que conduz a estes resultados recebeu financiamento de bolsas NIH AI064326, CA141722 e GM071862 para GG. SP é atualmente um Wellcome Trust DBT Índia intermediário companheiro.

1. preparação do vírus recombinante apropriado para a expressão de grande escala de IKK1/α
<ol><li>
Preparação de vírus P1 32<ol>
<li>Dia 1: Células placa Sf9 (~ 6 X 105) (passagem número inferior a 10) em 2 mL de meio de inseto celular Sf900 III em cada bem de uma placa de 6 e incubar a 27 ° C. Passagem de células quando eles alcançam uma densidade de 2 a 3 X 106 células por mL em suspensão diluindo em mídia fresca em uma densidade de ~ 6 X...

<ol>
	<li>Xia, Y., Shen, S., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB,+an+active+player+in+human+cancers.">NF-kappaB, an active player in human cancers.</a> Cancer immunology research. 2 (9), 823-830 (2014).</li><li>Grivennikov, S. I., Greten, F. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IKKbeta+subunit+of+IkappaB+kinase+(IKK)+is+essential+for+nuclear+factor+kappaB+activation+and+prevention+of+apoptosis.">The IKKbeta subunit of IkappaB kinase (IKK) is essential for nuclear factor kappaB activation and prevention of apoptosis.</a> J Exp Med. 189 (11), 1839-1845 (1999).</li><li>Hayden, M. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shared+principles+in+NF-kappaB+signaling.">Shared principles in NF-kappaB signaling.</a> Cell. 132 (3), 344-362 (2008).</li><li>Sun, S. C., Chang, J. 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Solução de produção, cristalização e estrutura de duas proteínas IKK relacionadas Partimos para determinar a estrutura de cristal de raio-x de IKK1/α com a noção de que seria um exercício relativamente simples, dado a nossa experiência com a produção de proteína IKK2/β, cristalização e a determinação de estrutura. No entanto, nos surpreendemos altamente que essas duas proteínas relacionadas comportou-se muito diferentemente em relação a facilidade de cristalização. Apesar dos ...

Atividades transcriptional da família NF-κB de factores de transcrição dimérica são necessárias para diversas funções celulares, variando de inflamação e imunidade a sobrevivência e a morte. Estas actividades são rigorosamente controladas em células e uma perda de regulamento conduz a diversas condições patológicas, incluindo doenças auto-imunes e câncer1,2,3. Na ausência de um estímulo, as atividades do NF-κB são mantidas inibidas pelo i-κB (inibidor da - κB) proteínas4. A fosforilação de resíduos específicos de EMISSAO SERIE sobre proteínas i κB marca-los para ubiquitination e degradação proteasomal subsequentes ou processamento seletivo5. As duas cinases Ser/Thr altamente homólogas, IKK2/β e IKK1/α, atuam como centrais reguladores das actividades do NF-κB realizando esses eventos de fosforilação6,7.
Interações entre um ligante e um receptor transduces um sinal através de uma série de mediadores, levando à ativação de fatores de NF-κB. O processo de sinalização do NF-κB pode ser classificado em duas vias distintas – canônica e não-canônicos (alternativo)8. A atividade de IKK2/β regula principalmente o NF-κB sinalização do percurso canônico que é essencial para inflamatória e inata respostas imunes9. Uma característica distinta deste percurso é uma ativação rápida e de curta duração de IKK2/β10 dentro de um complexo de IKK até então bioquimicamente descaracterizada — presume-se que seja composto de IKK1 e IKK2, bem como um componente regulamentar, NEMO (NF-κB modulador essencial )11,12,13. Entre as duas subunidades IKK catalíticas do complexo IKK, IKK2 é principalmente responsável14 para a fosforilação de resíduos específicos de protótipos IκBs (α - β e γ-) vinculado a NF-κB e também uma proteína i κB atípica, NF-κB1/p105, que é um precursor do NF-κB p50 subunidade5. Fosforilação induzido ubiquitination e degradação proteasomal de i κB (ou processamento de p105) leva à liberação e ativação de um conjunto específico de NF-κB dímeros15. Aberrante atividade do NF-κB devido a função mis regulamentada de IKK2 tem sido observada em muitos cânceres, bem como em doenças auto-imunes2,3,16.
Em contraste com IKK2/β, a atividade de IKK1/α regula NF-κB sinalização da via não-canônicos, que é essencial para o desenvolvimento e a imunidade. IKK1 fosforila resíduos específicos da NF-κB2/p100 em seu segmento IκBδ C-terminal, que leva ao seu processamento e geração de p52. A formação de p52:RelB transcricionalmente ativo heterodímero inicia uma resposta lenta e sustentada para sinais do desenvolvimento7,17,18,19,20. Curiosamente, a geração da central NF-κB fator p52 este percurso é criticamente dependente de outro fator,21,NF-κB induzindo quinase (NIK)22, mas não no IKK2 ou NEMO. Nas células de descanso, o nível de NIK permanece baixo devido a sua constante degradação proteossomo dependente23,24,25. Após estimulação das células por ligantes 'não-canônicos' e em certas células malignas, NIK torna-se estabilizada para recrutar e ativar IKK1 / α. atividades da quinase de NIK e IKK1 são essenciais para o processamento eficiente de p100 em p527. IKK1 e NIK fosforilar três serinas (Ser866, 870 e 872) da NF-κB2/p100 em seu segmento IκBδ C-terminal, levando para seu processamento e geração de p52. Aberrante ativação da via não-canônicos tem sido implicada em muitas Neoplasias, incluindo mieloma múltiplo de27,26,28.
Vários inibidores altamente eficientes e específicos para IKK2/β são conhecidos, embora nenhum até agora têm acabou por ser uma droga eficaz. Em contraste, os inibidores específicos/α-IKK1 são escassos. Isto pode se originar em parte de nossa falta de informações estruturais e bioquímicas na IKK1/α, que limita a nossa compreensão da base mecanicista da ativação do NF-κB pelo IKK1 em células e desenho racional de droga. As estruturas de raio-x de IKK2/β nos forneceram insights sobre o mecanismo de ativação de IKK2/β29; no entanto, essas estruturas não poderiam revelar como diferentes estímulos montante desencadear a ativação de IKK1/α ou β/IKK2 para regular a conjuntos distintos de NF-κB atividades 30,31. Para entender a base mecanicista subjacente a distinta função sinalização de IKK1/α e estabelecer uma plataforma para o projeto racional da droga, focamos na determinação da estrutura de IKK1/α.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cellfectin/Cellfectin II</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10362100</td>
			<td>Cellfectin is now discontinued, replaced by Cellfectin II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf900 III Insect cell medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12658-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SF9 cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12659017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-IKK1 antibody</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB100-56704</td>
			<td>Previously sold by Imgenex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PentaHis antibody</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>34460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>Nitrocellulose can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford assay reagent</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>500001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28989335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon concentrator</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC801008, UFC803008, UFC201024, UFC203024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound A</td>
			<td>Bayer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calbiochem IKK-inhibitor XII</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>401491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staurosporine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>S4400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLN120B</td>
			<td>Millenium</td>
			<td>Gift item</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPPNP</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A2647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulfate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>51227, 42867, 31404,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulfate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>93593, 81210, 88276, 95904, 81255, 89510, 92897, 81285, 95172</td>
			<td>Some of them are new Cat # on SIGMA catalogue. What we had was originally from Fluka that had different Cat #.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystallization Screens</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Screen I and II (Crystal Screen HT)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index HT</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG/Ion and PEG/Ion2 (PEG/Ion HT)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEGRX 1 and PEGRx 2 (PEGRx HT)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SaltRx 1 and SaltRx 2 (SaltRx HT)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal mounts</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR8-188, 190, 192, 194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synchrotron</td>
			<td>The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy&#8217;s Argonne National Laboratory</td>
			<td>Beamline 19 ID</td>
			<td>The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy&#8217;s Argonne National Laboratory provides ultra-bright, high-energy storage ring-generated X-ray beams for research in almost all scientific disciplines.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a guide to production, crystallization, and structure determination of human ikk1/&#945;

Uma classe de estímulos extracelulares requer ativação de IKK1/α para induzir a geração de uma subunidade de NF-κB, p52, através do processamento de seu precursor p100. P52 funciona como um homodímero ou heterodímero com outra subunidade de NF-κB, RelB. Esses dímeros regulam, por sua vez, a expressão de centenas de genes envolvidos na inflamação, sobrevivência da pilha e ciclo celular. IKK1/α permanece principalmente associado com IKK2/β e NEMO como um complexo ternário. No entanto, uma pequena piscina de também é observada como um complex(es) de baixo peso molecular. Desconhece-se a actividade de transformação de p100 é desencadeada por ativação de IKK1/α dentro a maior ou a menor piscina complexa. Atividade constitutiva de IKK1/α foi detectada em vários tipos de câncer e doenças inflamatórias. Para entender o mecanismo de ativação de IKK1/α e permitir a sua utilização como um alvo de drogas, manifestámos IKK1/α recombinante em sistemas de host diferentes, tais como Escherichia coli, inseto e células de mamíferos. Conseguimos expressar IKK1/α solúvel em baculovirus infectados células de inseto, obtenção de quantidades de mg de proteína altamente pura, cristaliza na presença de inibidores e determinar sua estrutura de cristal de raio-x. Aqui, descrevemos as etapas detalhadas para produzir a proteína recombinante, sua cristalização e sua determinação de estrutura de cristal de raio-x.

Clonagem e expressão de diferentes construções da IKK1/α Comprimento total que ikk1/α humano foi clonado no pFastBacHTa de vetor de expressão baculovirus dentro de seus sítios de restrição EcoRI e NotI para obter um N-terminal hexa-histidina marcados IKK1. A tag pode ser removida por digestão de protease TEV. Desde que o comprimento total IKK1/α contém regiões flexíveis em ambas as extremidades, e regiões flexíveis geralmente tornam uma proteína difíc...

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A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

I κB quinase 1/α (IKK1/α CHUK) é uma Ser/Thr proteína quinase que está envolvida em uma miríade de atividades celulares, principalmente através da ativação de fatores de transcrição NF-κB. Aqui, descrevemos as principais etapas necessárias para a produção e a determinação de estrutura de cristal desta proteína.

Um guia para a produção, cristalização e determinação da estrutura de IKK1 humana/α

A class of extracellular stimuli requires activation of IKK1/&#945; to induce generation of an NF-&#954;B subunit, p52, through processing of its ...

O objetivo deste procedimento é orientar a produção, cristalização e determinação estrutural do IKK1-alfa humano, a fim de compreender a base mecanicista de sua função de sinalização e estabelecer plataformas para o design racional de drogas. Esse método deve ajudar os pesquisadores a determinar a estrutura do IKK1, que forneceria respostas às principais consultas no campo da sinalização imunológica. Esta técnica descreve um caminho simplificado para a obtenção de cristais de proteínas IKK, que são bastante refratários à cristalização e para fornecer várias informações críticas na superação de gargalos na determinação das estruturas.Geralmente, indivíduos novos neste método lutarão, porque gerar quantidades miligramas de proteína solúvel e bem comportada requer sua expressão em células de insetos, e a cristalização pode ser feita sob apenas uma janela altamente estreita de condições. O procedimento de substituição molecular utilizado na determinação da estrutura do IKK1 também pode ser muito complicado, especialmente devido à má propriedade de deflexão dos cristais, não no local da unidade assimétrica contendo muitas moléculas IKK1 na ausência de modelos de busca adequados. Demonstrando os procedimentos serão Kyle Shumate e Sonjiala Hotchkiss, estudantes do meu laboratório.No primeiro dia, as células de placa Sf9 em dois mililitros de sf903 meio de células de insetos, em cada poço de uma placa de seis poços e incubam a 27 graus Celsius. Passe as células quando atingem uma densidade de duas a três vezes 10 para as seis células por mililitro em suspensão, diluindo-as para mídia fresca, a uma densidade de aproximadamente seis vezes 10 a cinco. No segundo dia, diluem oito microliters de reagente de transfecção Sf9 em 100 microliters de SF-903 ou Grace's Insect Medium.Em seguida, vórtice a mistura brevemente. Em um tubo separado, dilui um micrograma de bacmídeo recombinante purificado em 100 microliters do mesmo meio. Combine o DNA diluído e o reagente de transfecção.Depois de incubar em temperatura ambiente por 15 a 30 minutos, retire o meio do poço. Em seguida, adicione um mililitro de meio fresco. Em seguida, adicione a mistura de reagente de transfecção de DNA diluído nas células, ajustando o tamanho da gota de tal forma que não desaloja células aderentes.Depois de seis horas, adicione 1,5 mililitros de meio fresco em cima das células. Incubar as células a 27 graus Celsius, verificando os poços periodicamente a cada 12 horas para sinais de infecção viral. No quinto dia, remova o meio contendo células, 60 a 72 horas após a infecção.Depois de transferir o meio para tubos, centrífuga por cinco minutos a 500 vezes g e quatro graus Celsius. Quando terminar, salve o supernaspe, que é a pilha de vírus P1. No primeiro dia, resuspende a cápsula de célula His-IKK1 previamente preparada em 40 mililitros de tampão de lise.Coloque a suspensão celular no gelo elise as células por sônica em ciclos de 60% a 70% de serviço e de cinco a 10 pulsos de duração de 30 segundos em um intervalo superior a um minuto. Esclareça o lise por centrifugação maior ou igual a 28.000 g por 45 minutos a quatro graus Celsius. Depois de preparar uma resina Nickel-NTA Agarose, de acordo com o protocolo de texto, elute a proteína alfa IKK1 marcada sob fluxo gravitacional usando 20 mililitros de tampão de elução.Colete de uma a 1,5 mililitro frações. Depois de combinar as frações que contêm a proteína, digerir a amostra com protease TEV durante a noite a quatro graus Celsius. Na manhã do segundo dia, incubar a proteína com um milimolar de ATP, na presença de cloreto de magnésio, beta-glicerofosfato, flúor de sódio e ortovanadato de sódio por uma hora a 27 graus Celsius.Após a incubação, filtre a solução proteica através de um filtro de 0,45 mícnico. Em seguida, carregue aproximadamente seis mililitros da amostra em uma coluna de exclusão de tamanho preparatória de 120 mililitros, anexada a um sistema automatizado de cromatografia líquida. Após o equilíbrio, execute a cromatografia de exclusão de tamanho a uma taxa de fluxo de um mililitro por minuto e colete frações de dois mililitros.Durante a corrida, monitore a elução em 280 e 254 nanômetros. Depois de puxar as frações puras, concentre-se em um concentrador centrífuga de corte de peso molecular de 30 quilos, seguindo as instruções do fabricante. Em seguida, dispense alíquotas de 25 microliter da proteína concentrada e congele em nitrogênio líquido.Usando um robô, pipeta de 80 a 100 microlitres de um reagente de cristalização no reservatório de uma placa de 96 poços. Utilizando um robô de cristalização, dispense e misture 0,2 a 0,25 microliters de IKK1 e seu complexo inibidor com o mesmo volume de solução do reservatório. Imediatamente após a configuração das gotas, sele cada placa com pelísagens opticamente claras para evitar a evaporação.Incubar uma placa a 18 graus Celsius e a outra placa a quatro graus Celsius em uma sala fria. Use um microscópio estéreo com um polarizador para verificar a aparência de cristal em cada gota, todos os dias, durante os primeiros sete dias e depois em intervalos mais longos. Depois de preparar o IKK1 e seu complexo inibidor como descrito anteriormente, transfira as soluções do poço para cada poço de uma placa de 24 poços.Coloque de um a 1,5 microliters de solução de poço em uma mancha de vidro limpa. Adicione um volume igual de IKK1 e seu complexo inibidor ao deslizamento de tampas de vidro e misture suavemente por pipetação para cima e para baixo três a quatro vezes. Depois de aplicar graxa nos anéis de cada poço da placa, gire a tampa de vidro e coloque no poço respectivo com fórceps.Em seguida, sele o poço pressionando para baixo na tampa de vidro. Depois de configurar todas as gotas na placa de 24 poços, incubar na sala fria, no escuro. Ocasionalmente verifique as gotas sob um microscópio para aparência e crescimento de cristais.Uma vez que o crescimento do cristal esteja completo, remova suavemente a tampa de vidro contendo o cristal e coloque-o sobre uma superfície sólida com a gota de cristal voltada para cima. Adicione suavemente 10 microliters de crio uma solução em cima da gota e misture suavemente por pipetação para que o cristal não seja tocado. Usando um microscópio, remova lentamente um pouco de líquido do cristal e mantenha cerca de cinco a oito microlitros da solução.Adicione suavemente 2,5 a quatro microliters de solução crio-B na gota e misture suavemente por pipetação. Cubra a tampa de vidro com uma pequena placa de Petrie para evitar o fluxo de ar direto sobre o cristal. Depois de esperar cinco minutos, escolha cuidadosamente um único cristal da queda em um crioloop apropriado montado em uma base adequada.Congele o cristal em nitrogênio líquido. Em seguida, armazene o cristal contendo crioloop em um disco imerso em nitrogênio líquido em um frasco de Dewar até estar pronto para difração de raios-X no síncrotron. Após extensos ensaios com várias variantes diferentes do IKK1, os cristais foram obtidos com uma construção truncada, que exibia propriedades adequadas de raios-X apenas na presença do inibidor IKK XII.O efeito combinado de dados de raios-X de baixa resolução com intensidades fracas, um grande número de moléculas IKK1 na unidade assimétrica e variação conformacional do modelo monomérico-dimérico IKK1, em comparação com os modelos conhecidos IKK2, dificultou a obtenção de uma solução de substituição molecular, IKK1, e determinar sua estrutura. Diferentes estruturas IKK2 indicaram diferentes orientações inter-monômeros dentro de seus dimers de modo que a distância entre os carbonos alfa de P578 nos dois domínios de quinase, em quatro modelos diferentes dimer, variou entre 39 e 61 angstroms. A obtenção de um modelo de pesquisa útil foi possível devido ao mapa de microscopia crioelétron de baixa resolução e a um modelo de alta precisão dos domínios IKK1 que poderia ser gerado com base em uma estrutura IKK2 de alta resolução.O modelo inicial indicava uma orientação do domínio quinase girada 24 graus em relação ao de um monômero IKK2 e uma abertura n-terminal de 58 angstroms. Usando um dos dimers com a abertura de 52 angstrom como modelo, seis centavos na unidade assimétrica foram localizados. Uma vez dominada, essa técnica pode ser executada em alguns meses, se for executada corretamente.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que a obtenção de uma proteína solúvel, ativa e bem comportada é o primeiro passo crítico. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão geral de todos os passos que precisam ser seguidos em detalhes minuciosos, para ter sucesso em cristalizar e determinar a estrutura da proteína IKK1. Aprendendo este procedimento, ainda há estruturas de outras proteínas familiares IKK que também podem ser determinadas a fim de responder a perguntas adicionais sobre a sinalização quinase-mitogen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/&#945;

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Termoestabilização, expressão, purificação e cristalização do transportador de serotonina humano Bound to<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Bioquímica

Combining Wet and Dry Lab Techniques to Guide the Crystallization of Large Coiled-coil Containing Proteins

Combinando Wet and Dry técnicas de laboratório para orientar a cristalização de grandes espiral enrolada contendo proteínas

Obtaining crystals for structure determination can be a difficult and time consuming proposition for any protein. Coiled-coil proteins and domains are ...

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Produção, cristalização e determinação da estrutura de<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-1 via microdispersão e Zinco-SAD

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

FRET de alta precisão em nível de molécula única para determinação de estrutura de biomoléculas

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO

Produção, cristalização e determinação da estrutura do domínio ikk-obrigatório da NEMO

NEMO is a scaffolding protein which plays an essential role in the NF-&#954;B pathway by assembling the IKK-complex with the kinases IKK&#945; and ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

Cristalização e Determinação Estrutural de uma Enzima:Complexo de Substrato por Cristalografia Serial em um Chip Microfluido Versátil

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

The Extraction of Liver Glycogen Molecules for Glycogen Structure Determination

Liver glycogen is a hyperbranched glucose polymer that is involved in the maintenance of blood sugar levels in animals. The properties of glycogen are ...

Efficient and Scalable Production of Full-length Human Huntingtin Variants in Mammalian Cells using a Transient Expression System

Full-length huntingtin (FL HTT) is a large (aa 1-3,144), ubiquitously expressed, polyglutamine (polyQ)-containing protein with a mass of approximately 350 ...

High-Throughput Screening for Protein Crystallization

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography (Video) | JoVE 

Triagem de alto rendimento para obter hits de cristal para cristalografia de proteínas

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into ...

A Fibrinolytic Enzyme-Based Method to Study Cerebral Thrombus Cell Components

A Comprehensive Approach to Analyze the Cell Components of Cerebral Blood Clots

A Novel Method for Comprehensive Cell Component Analysis of Cerebral Blood Clots (Video) | JoVE

Uma abordagem abrangente para analisar os componentes celulares de coágulos sanguíneos cerebrais

Cerebral thrombosis, a blood clot in a cerebral artery or vein, is the most common type of cerebral infarction. The study of the cell components of ...