Name: a guide to production, crystallization, and structure determination of human ikk1/&#945;
Uploaded: 2018-11-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/ÃŽÂ± at JoVE.com

Мы благодарим сотрудников на излучение 19ID, 24ID и 13ID на расширенный источник фотон, Лемонт, Иллинойс, для поддержки во время сбора данных о различных кристаллов. Мы благодарны Lyumkis Дмитрий, Солка институт для выборки нас низким разрешением крио Эм карта на ранних стадиях Эм карта/построения модели, которая использовалась для построения начального IKK1 молекулярные замена Поиск модели. Исследований, приведших к эти результаты получил финансирование от НИЗ грантов, AI064326, CA141722 и GM071862 гг. SP в настоящее время Добро пожаловать доверять DBT Индии промежуточных парень.

1. Подготовка рекомбинантных вирус подходит для больших масштабах выражение IKK1/α
<ol><li>
Подготовка вирус P1 32<ol>
<li>День 1: Плита Sf9 клетки (~ 6 X 105) (проход число меньше 10) в 2 мл среды насекомых клеток Sf900 III в каждом также 6-ну плиты и Инкубируйте на 27 ° C. Проход клеток,...

<ol>
	<li>Xia, Y., Shen, S., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB,+an+active+player+in+human+cancers.">NF-kappaB, an active player in human cancers.</a> Cancer immunology research. 2 (9), 823-830 (2014).</li><li>Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity,+inflammation,+and+cancer.">Immunity, inflammation, and cancer.</a> Cell. 140 (6), 883-899 (2010).</li><li>Ben-Neriah, Y., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+meets+cancer,+with+NF-kappaB+as+the+matchmaker.">Inflammation meets cancer, with NF-kappaB as the matchmaker.</a> Nature immunology. 12 (8), 715-723 (2011).</li><li>Hinz, M., Scheidereit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IkappaB+kinase+complex+in+NF-kappaB+regulation+and+beyond.">The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond.</a> EMBO reports. 15 (1), 46-61 (2014).</li><li>Karin, M., Ben-Neriah, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+meets+ubiquitination:+the+control+of+NF-[kappa]B+activity.">Phosphorylation meets ubiquitination: the control of NF-[kappa]B activity.</a> Annu Rev Immunol. 18, 621-663 (2000).</li><li>Ghosh, S., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Missing+pieces+in+the+NF-kappaB+puzzle.">Missing pieces in the NF-kappaB puzzle.</a> Cell. 109, S81-S96 (2002).</li><li>Sun, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+noncanonical+NF-kappaB+pathway.">The noncanonical NF-kappaB pathway.</a> Immunol Rev. 246 (1), 125-140 (2012).</li><li>Bonizzi, G., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+NF-kappaB+activation+pathways+and+their+role+in+innate+and+adaptive+immunity.">The two NF-kappaB activation pathways and their role in innate and adaptive immunity.</a> Trends Immunol. 25 (6), 280-288 (2004).</li><li>DiDonato, J. A., Hayakawa, M., Rothwarf, D. M., Zandi, E., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cytokine-responsive+IkappaB+kinase+that+activates+the+transcription+factor+NF-kappaB.">A cytokine-responsive IkappaB kinase that activates the transcription factor NF-kappaB.</a> Nature. 388 (6642), 548-554 (1997).</li><li>Werner, S. L., Barken, D., Hoffmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulus+specificity+of+gene+expression+programs+determined+by+temporal+control+of+IKK+activity.">Stimulus specificity of gene expression programs determined by temporal control of IKK activity.</a> Science. 309 (5742), 1857-1861 (2005).</li><li>Zandi, E., Rothwarf, D. M., Delhase, M., Hayakawa, M., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IkappaB+kinase+complex+(IKK)+contains+two+kinase+subunits,+IKKalpha+and+IKKbeta,+necessary+for+IkappaB+phosphorylation+and+NF-kappaB+activation.">The IkappaB kinase complex (IKK) contains two kinase subunits, IKKalpha and IKKbeta, necessary for IkappaB phosphorylation and NF-kappaB activation.</a> Cell. 91 (2), 243-252 (1997).</li><li>Rothwarf, D. M., Zandi, E., Natoli, G., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IKK-gamma+is+an+essential+regulatory+subunit+of+the+IkappaB+kinase+complex.">IKK-gamma is an essential regulatory subunit of the IkappaB kinase complex.</a> Nature. 395 (6699), 297-300 (1998).</li><li>Yamaoka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementation+cloning+of+NEMO,+a+component+of+the+IkappaB+kinase+complex+essential+for+NF-kappaB+activation.">Complementation cloning of NEMO, a component of the IkappaB kinase complex essential for NF-kappaB activation.</a> Cell. 93 (7), 1231-1240 (1998).</li><li>Li, Z. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IKKbeta+subunit+of+IkappaB+kinase+(IKK)+is+essential+for+nuclear+factor+kappaB+activation+and+prevention+of+apoptosis.">The IKKbeta subunit of IkappaB kinase (IKK) is essential for nuclear factor kappaB activation and prevention of apoptosis.</a> J Exp Med. 189 (11), 1839-1845 (1999).</li><li>Hayden, M. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shared+principles+in+NF-kappaB+signaling.">Shared principles in NF-kappaB signaling.</a> Cell. 132 (3), 344-362 (2008).</li><li>Sun, S. C., Chang, J. H., Jin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+nuclear+factor-kappaB+in+autoimmunity.">Regulation of nuclear factor-kappaB in autoimmunity.</a> Trends Immunol. 34 (6), 282-289 (2013).</li><li>Claudio, E., Brown, K., Park, S., Wang, H., Siebenlist, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAFF-induced+NEMO-independent+processing+of+NF-kappa+B2+in+maturing+B+cells.">BAFF-induced NEMO-independent processing of NF-kappa B2 in maturing B cells.</a> Nat Immunol. 3 (10), 958-965 (2002).</li><li>Senftleben, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+by+IKKalpha+of+a+second,+evolutionary+conserved,+NF-kappa+B+signaling+pathway.">Activation by IKKalpha of a second, evolutionary conserved, NF-kappa B signaling pathway.</a> Science. 293 (5534), 1495-1499 (2001).</li><li>Coope, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40+regulates+the+processing+of+NF-kappaB2+p100+to+p52.">CD40 regulates the processing of NF-kappaB2 p100 to p52.</a> EMBO J. 21 (20), 5375-5385 (2002).</li><li>Dejardin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lymphotoxin-beta+receptor+induces+different+patterns+of+gene+expression+via+two+NF-kappaB+pathways.">The lymphotoxin-beta receptor induces different patterns of gene expression via two NF-kappaB pathways.</a> Immunity. 17 (4), 525-535 (2002).</li><li>Xiao, G., Fong, A., Sun, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+p100+processing+by+NF-kappaB-inducing+kinase+involves+docking+IkappaB+kinase+alpha+(IKKalpha)+to+p100+and+IKKalpha-mediated+phosphorylation.">Induction of p100 processing by NF-kappaB-inducing kinase involves docking IkappaB kinase alpha (IKKalpha) to p100 and IKKalpha-mediated phosphorylation.</a> The Journal of biological chemistry. 279 (29), 30099-30105 (2004).</li><li>Xiao, G., Harhaj, E. W., Sun, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB-inducing+kinase+regulates+the+processing+of+NF-kappaB2+p100.">NF-kappaB-inducing kinase regulates the processing of NF-kappaB2 p100.</a> Molecular cell. 7 (2), 401-409 (2001).</li><li>Qing, G., Qu, Z., Xiao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+basally+translated+NF-kappaB-inducing+kinase+(NIK)+protein+functions+as+a+molecular+switch+of+processing+of+NF-kappaB2+p100.">Stabilization of basally translated NF-kappaB-inducing kinase (NIK) protein functions as a molecular switch of processing of NF-kappaB2 p100.</a> J Biol Chem. 280 (49), 40578-40582 (2005).</li><li>Zarnegar, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncanonical+NF-kappaB+activation+requires+coordinated+assembly+of+a+regulatory+complex+of+the+adaptors+cIAP1,+cIAP2,+TRAF2+and+TRAF3+and+the+kinase+NIK.">Noncanonical NF-kappaB activation requires coordinated assembly of a regulatory complex of the adaptors cIAP1, cIAP2, TRAF2 and TRAF3 and the kinase NIK.</a> Nat Immunol. 9 (12), 1371-1378 (2008).</li><li>Vallabhapurapu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonredundant+and+complementary+functions+of+TRAF2+and+TRAF3+in+a+ubiquitination+cascade+that+activates+NIK-dependent+alternative+NF-kappaB+signaling.">Nonredundant and complementary functions of TRAF2 and TRAF3 in a ubiquitination cascade that activates NIK-dependent alternative NF-kappaB signaling.</a> Nat Immunol. 9 (12), 1364-1370 (2008).</li><li>Annunziata, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequent+engagement+of+the+classical+and+alternative+NF-kappaB+pathways+by+diverse+genetic+abnormalities+in+multiple+myeloma.">Frequent engagement of the classical and alternative NF-kappaB pathways by diverse genetic abnormalities in multiple myeloma.</a> Cancer cell. 12 (2), 115-130 (2007).</li><li>Keats, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promiscuous+mutations+activate+the+noncanonical+NF-kappaB+pathway+in+multiple+myeloma.">Promiscuous mutations activate the noncanonical NF-kappaB pathway in multiple myeloma.</a> Cancer cell. 12 (2), 131-144 (2007).</li><li>Staudt, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+activation+of+NF-kappaB.">Oncogenic activation of NF-kappaB.</a> Cold Spring Harbor perspectives in biology. 2 (6), a000109 (2010).</li><li>Polley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structural+basis+for+IkappaB+kinase+2+activation+via+oligomerization-dependent+trans+auto-phosphorylation.">A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation.</a> PLoS Biol. 11 (6), e1001581 (2013).</li><li>Hinz, M., Scheidereit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IkappaB+kinase+complex+in+NF-kappaB+regulation+and+beyond.">The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond.</a> EMBO Rep. 15 (1), 46-61 (2014).</li><li>Scheidereit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IkappaB+kinase+complexes:+gateways+to+NF-kappaB+activation+and+transcription.">IkappaB kinase complexes: gateways to NF-kappaB activation and transcription.</a> Oncogene. 25 (51), 6685-6705 (2006).</li><li>Luckow, V. A., Lee, S. C., Barry, G. F., Olins, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+infectious+recombinant+baculoviruses+by+site-specific+transposon-mediated+insertion+of+foreign+genes+into+a+baculovirus+genome+propagated+in+Escherichia+coli.">Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli.</a> J Virol. 67 (8), 4566-4579 (1993).</li><li>Polley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Basis+for+the+Activation+of+IKK1/alpha.">Structural Basis for the Activation of IKK1/alpha.</a> Cell reports. 17 (8), 1907-1914 (2016).</li><li>Otwinowski, Z. a. M., W, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+X-ray+Diffraction+Data+Collected+in+Oscillation+Mode.">Processing of X-ray Diffraction Data Collected in Oscillation Mode.</a> Methods in Enzymology. 276 (Macromolecular Crystallography, part A), 307-326 (1997).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+human+IkappaB+kinase+beta+asymmetric+dimer.">Crystal structure of a human IkappaB kinase beta asymmetric dimer.</a> J Biol Chem. 288 (31), 22758-22767 (2013).</li><li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+development+of+Coot.">Features and development of Coot.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).</li><li>McCoy, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phaser+crystallographic+software.">Phaser crystallographic software.</a> Journal of applied crystallography. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).</li><li>Vagin, A. T., Teplyakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MOLREP:+an+automated+program+for+molecular+replacement.">MOLREP: an automated program for molecular replacement.</a> J. Appl. Cryst. 30, 1022-1025 (1997).</li><li>Brunger, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Version+1.2+of+the+Crystallography+and+NMR+system.">Version 1.2 of the Crystallography and NMR system.</a> Nature protocols. 2 (11), 2728-2733 (2007).</li><li>Brunger, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallography+&amp;+NMR+system:+A+new+software+suite+for+macromolecular+structure+determination.">Crystallography &amp; NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological. 54 (Pt 5), 905-921 (1998).</li><li>McRee, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XtalView:+a+visual+protein+crystallographic+software+system+for+X11/Xview.">XtalView: a visual protein crystallographic software system for X11/Xview.</a> J. Mol Graph. 10, 44-47 (1992).</li><li>Schroder, G. F., Levitt, M., Brunger, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+biomolecular+crystallography+with+low-resolution+data.">Super-resolution biomolecular crystallography with low-resolution data.</a> Nature. 464 (7292), 1218-1222 (2010).</li><li>Polley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structural+basis+for+IkappaB+kinase+2+activation+via+oligomerization-dependent+trans+auto-phosphorylation.">A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation.</a> PLoS biology. 11 (6), e1001581 (2013).</li><li>Christopher, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+discovery+of+2-amino-3,5-diarylbenzamide+inhibitors+of+IKK-alpha+and+IKK-beta+kinases.">The discovery of 2-amino-3,5-diarylbenzamide inhibitors of IKK-alpha and IKK-beta kinases.</a> Bioorganic &amp; medicinal chemistry letters. 17 (14), 3972-3977 (2007).</li><li>Karplus, P. A., Diederichs, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+crystallographic+model+and+data+quality.">Linking crystallographic model and data quality.</a> Science. 336 (6084), 1030-1033 (2012).</li><li>Chen, V. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MolProbity:+all-atom+structure+validation+for+macromolecular+crystallography.">MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 1), 12-21 (2010).</li></ol>

Производство, кристаллизации и структура решение двух родственных белков IKK Мы задались целью определить рентгеновского Кристаллическая структура IKK1/α с понятием, что было бы относительно просто упражнения, учитывая наш опыт работы с IKK2/β производства белка, кристаллизации...

Транскрипционный анализ деятельность в семейства NF-κB димерной транскрипционных факторов, необходимых для различных клеточных функций, начиная от воспаления и иммунитет для выживания и смерти. Эти мероприятия строго контролируются в клетки и потеря регулирование приводит к различных патологических состояний, включая аутоиммунных заболеваний и рака1,2,3. В отсутствие стимула деятельность NF-κB хранятся тормозится IκB (ингибитор - κB) белки4. Фосфорилирование конкретных Ser остатков на белки IκB помечает их ubiquitination и последующего протеосомной деградации или выборочной обработки5. Два весьма гомологичных Ser/Чет киназы, IKK2/β и IKK1/α, выступать в качестве центрального регуляторы деятельности NF-κB осуществляя эти события фосфорилирование6,7.
Взаимодействия лигандов и рецептор передает сигнал через ряд посредников, ведущие к активации NF-κB факторов. NF-κB сигнализации процесс широко можно подразделить на два различных пути – канонические и нестандартные (альтернативных)8. Деятельность IKK2/β главным образом регулирует NF-κB сигнализации канонический путь, который имеет важное значение для воспалительных и врожденный иммунный ответ9. Отличительная черта этого пути является быстрое и недолго активации10 IKK2/β в пределах до сих пор биохимически uncharacterized IKK комплекс — предположительно будет состоять из IKK1 и IKK2, а также нормативно-правовой компонент, Немо (NF-κB основные модулятор )11,12,13. Между двумя каталитического IKK подразделений комплекса IKK, IKK2 является главным образом ответственный14 для фосфорилирование конкретных остатков прототип IκBs (α, - β и - γ) обязан NF-κB, а также нетипичные IκB белок, NF-κB1/p105, который является предшественником NF-κB p50 Субблок5. Фосфорилирование индуцированной ubiquitination и деградации протеосомной IκB (или обработки p105) приводит к выпуска и активации определенного набора NF-κB димеры15. Аберрантное NF-κB активности из-за неправильного регулируемой функции IKK2 наблюдается во многих раках, также как и аутоиммунных расстройств2,3,16.
В отличие от IKK2/β активность IKK1/α регулирует NF-κB сигнализации нестандартные пути, который имеет важное значение для развития и иммунитет. IKK1 фосфорилирует конкретные остатки NF-κB2/p100 на ее сегмент C-терминала IκBδ, что приводит к ее обработка и генерация p52. Формирование транскрипционно активных p52:RelB гетеродимера инициирует медленно и устойчивого реагирования на развития сигналы7,,1718,19,20. Интересно, что поколения Центральной p52 фактора NF-κB этот путь зависит от другой фактор, NF-κB вызывая киназы (ник)21,22, но не на IKK2 или Немо. В клетках отдых уровень NIK остается низким из-за его постоянной протеасом зависимой деградации23,24,25. После стимуляции клеток «не канонических» лигандов и в некоторых злокачественных клеток Ник стабилизируется набирать и активировать IKK1 / α. киназы деятельности Ник и IKK1 имеют важное значение для эффективной обработки p100 в p527. IKK1 и Ник фосфорилировать трех serines (Ser866, 870 и 872) NF-κB2/p100 приводит к ее обработка и генерация p52 сегмента IκBδ C-терминала. Ошибочной активации нестандартные пути были причастны многих злокачественных опухолей, включая множественной миеломы26,27,28.
Известны несколько весьма эффективные и конкретные ингибиторы для IKK2/β, хотя никто до настоящего времени оказались быть эффективный препарат. В отличие от IKK1/α-специфические ингибиторы являются скудными. Это может частично обусловлены нашего отсутствия структурных и биохимических информации о IKK1/α, который ограничивает наше понимание механистический основы активацию NF-κB, IKK1 в клетки и рациональных наркотиков дизайн. Структуры рентгеновского IKK2/β предоставил нам взглянуть на механизм активации IKK2/β29; Однако, эти структуры не могут выявить как различных вышестоящих раздражителей вызвать срабатывание IKK1/α или IKK2/β регулировать различные наборы NF-κB деятельности 30,31. Чтобы понять механистический основания, лежащие в основе функции distinct сигнализации IKK1/α и создать платформу для рационального наркотиков дизайн, мы сосредоточены на определении структуры IKK1/α.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cellfectin/Cellfectin II</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10362100</td>
			<td>Cellfectin is now discontinued, replaced by Cellfectin II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf900 III Insect cell medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12658-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SF9 cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12659017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-IKK1 antibody</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB100-56704</td>
			<td>Previously sold by Imgenex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PentaHis antibody</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>34460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>Nitrocellulose can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford assay reagent</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>500001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28989335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon concentrator</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC801008, UFC803008, UFC201024, UFC203024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound A</td>
			<td>Bayer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calbiochem IKK-inhibitor XII</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>401491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staurosporine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>S4400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLN120B</td>
			<td>Millenium</td>
			<td>Gift item</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPPNP</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A2647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulfate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>51227, 42867, 31404,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulfate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>93593, 81210, 88276, 95904, 81255, 89510, 92897, 81285, 95172</td>
			<td>Some of them are new Cat # on SIGMA catalogue. What we had was originally from Fluka that had different Cat #.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystallization Screens</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Screen I and II (Crystal Screen HT)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index HT</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG/Ion and PEG/Ion2 (PEG/Ion HT)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEGRX 1 and PEGRx 2 (PEGRx HT)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SaltRx 1 and SaltRx 2 (SaltRx HT)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal mounts</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR8-188, 190, 192, 194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synchrotron</td>
			<td>The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy&#8217;s Argonne National Laboratory</td>
			<td>Beamline 19 ID</td>
			<td>The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy&#8217;s Argonne National Laboratory provides ultra-bright, high-energy storage ring-generated X-ray beams for research in almost all scientific disciplines.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a guide to production, crystallization, and structure determination of human ikk1/&#945;

Класс внеклеточного раздражителей требует активации IKK1/α побудить поколения NF-κB Субблок p52, путем обработки его предшественник p100. P52 функции как Антуану или гетеродимера с другой NF-κB Субблок, RelB. Эти димеры в свою очередь регулируют выражение сотен генов, участвующих в воспаление, выживаемость клеток и клеточного цикла. IKK1/α главным образом остается связанной с IKK2/β и Немо как третичный комплекс. Однако небольшой бассейн это наблюдается также как низкой молекулярной массой complex(es). Неизвестно, если действие обработки p100 инициируется активации IKK1/α в течение большего или меньшего комплекс бассейна. Учредительный активность IKK1/α была обнаружена в нескольких раковых заболеваний и воспалительных заболеваний. Чтобы понять механизм активации IKK1/α и включить его использования в качестве целевого наркотиков, мы выразили рекомбинантных IKK1/α в различных хост-систем, таких как кишечная палочка, насекомых и млекопитающих клетки. Нам удалось выразить растворимых IKK1/α в бакуловирусы инфицированных насекомых клеток, получение количества мг чистого белка, кристаллизующийся в присутствии ингибиторов и определение его кристаллической структуры рентгеновского. Здесь мы описываем подробные шаги для получения рекомбинантных белков, его кристаллизации и его определения структуры рентгеновских кристалл.

Клонирование и выражения различных конструкций IKK1/α Полная длина, которую человеческий IKK1/α был клонирован в pFastBacHTa вектор бакуловирусы выражение в его EcoRI и Ноти места ограничения для получения N-терминальный гекса гистидина с меткой IKK1. Тег может быть удал?...

Watch this Scientific Journal Video about A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/ÃŽÂ± at JoVE.com

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

IκB киназы 1/α (IKK1/α CHUK) является Ser/Чет протеинкиназы, которая участвует в бесчисленных клеточной деятельности, главным образом через активацию NF-κB транскрипционных факторов. Здесь мы опишем основные шаги, необходимые для производства и определения структуры кристалла этого белка.

Руководство по продукции, кристаллизации и определения структуры человеческого IKK1/α

A class of extracellular stimuli requires activation of IKK1/&#945; to induce generation of an NF-&#954;B subunit, p52, through processing of its ...

Цель этой процедуры заключается в том, чтобы обеспечить руководство для производства, кристаллизации и структурной решимости человека IKK1-альфа для того, чтобы понять механистическую основу своей сигнальной функции и создать платформы для рационального проектирования наркотиков. Этот метод должен помочь исследователям определить структуру IKK1, которая даст ответы на ключевые вопросы в области иммунной сигнализации. Этот метод описывает обтекаемый путь к получению кристаллов белков IKK, которые являются довольно огнеупорными для кристаллизации и предоставления различной критической информации в преодолении узких мест в определении структур.Как правило, люди, новые для этого метода будет бороться, потому что генерации миллиграммовых количеств растворимого, хорошо себя белок, требует его выражения в клетках насекомых, и кристаллизации может быть сделано только в очень узком окне условий. Процедура молекулярной замены, используемая при определении структуры IKK1, также может быть очень сложной, особенно из-за плохого свойства отклонения кристаллов, а не в месте асимметричного блока, содержащего много молекул IKK1 в отсутствие соответствующих моделей поиска. Демонстрацией процедур будут Кайл Шумат и Сонджиала Хотчкис, студенты из моей лаборатории.На первый день, пластины Sf9 клетки в двух миллилитров Sf903 насекомых клеточной среды, в каждом хорошо из шести хорошо пластины и инкубировать при 27 градусов по Цельсию. Прохождение клеток, когда они достигают плотности от двух до трех раз от 10 до шести клеток на миллилитр в подвеске, разбавляя его свежими средствами массовой информации, при плотности примерно шесть раз от 10 до пяти. На второй день разбавляют восемь микролитров трансфектного реагента Sf9 в 100 микролитров SF-903 или Grace's Insect Medium.Затем вихрь смесь кратко. В отдельной трубке разбавьте один микрограмм очищенной комплектом рекомбинантной бакмиды в 100 микролитров той же среды. Объедините разбавленную ДНК и трансфектный реагент.После инкубации при комнатной температуре в течение 15-30 минут, удалите среду из колодец. Затем добавьте один миллилитр свежей среды. Затем добавьте разбавленную смесь трансфекции ДНК на клетки, регулируя размер капли таким образом, чтобы она не вытесняла клетки-адепты.Через шесть часов добавьте 1,5 миллилитров свежей среды поверх клеток. Инкубировать клетки при 27 градусах по Цельсию, периодически проверяя колодцы каждые 12 часов на наличие признаков вирусной инфекции. На пятый день удалите среду, содержащую клетки, через 60-72 часа после заражения.После переноса среды в трубки, центрифуга в течение пяти минут при 500 раз г и четыре градуса по Цельсию. После завершения, сохранить супернатант, который является P1 вирус стек. В первый день, resuspend ранее подготовленных Его-IKK1 ячейки гранулы в 40 миллилитров лиза буфера.Поместите подвеску клетки на лед и высасыв клетки с помощью звуковых данных на 60%-70% циклов и от пяти до 10 импульсов 30-секундной продолжительности с интервалом более одной минуты. Уточните лисат центрифугой при большем или равном 28 000 г в течение 45 минут при четырех градусах Цельсия. После подготовки никель-НТА Агароза смолы, в соответствии с текстовым протоколом, elute его помечены IKK1 альфа-белка под гравитационным потоком с использованием 20 миллилитров элюционного буфера.Соберите от 1 до 1,5 миллилитров фракций. После объединения фракций, содержащих белок, переварить образец с TEV protease ночь на четыре градуса по Цельсию. Утром второй день инкубировать белок с одним миллимоляном АТФ, в присутствии хлорида магния, бета-глицерофосфата, фтора натрия и ортованата натрия в течение одного часа при 27 градусах Цельсия.После инкубации фильтруем белковый раствор через фильтр 0,45 микрона. Затем загрузите около шести миллилитров образца на 120-миллилитровую препаративную колонку с исключением размеров, прикрепленную к автоматизированной жидкой хроматографической системе. После эквилибрации запустите хроматографию с исключением размеров со скоростью потока в один миллилитр в минуту и соберите двухми миллилитровые фракции.Во время бега монитор elution на 280 и 254 нанометров. Потянув чистые фракции, сосредоточьтесь в 30-килодальтонном молекулярном центробежном концентраторе, следуя инструкциям производителя. Затем обойтись без 25-микролитровых алицитов концентрированного белка и флэш-заморозки в жидком азоте.Используя робота, пипетка от 80 до 100 микролитров кристаллизации реагента в резервуар 96-ну пластины. Используя кристаллизацию робота, обойтись и смешать от 0,2 до 0,25 микролитров IKK1 и его тормозной комплекс с тем же объемом раствора резервуара. Сразу же после установки капель, печать каждой пластины с оптически чистой пленки, чтобы избежать испарения.Инкубировать одну пластину при 18 градусах по Цельсию, а другую тарелку при четырех градусах по Цельсию в холодной комнате. Используйте стерео микроскоп с поляризатором, чтобы проверить появление кристалла в каждой капле, каждый день, в течение первых семи дней, а затем с более длительными интервалами. После подготовки IKK1 и его ингибитор комплекса, как описано ранее, передать хорошо решения для каждой колодец 24-хорошо пластины.Поместите от 1 до 1,5 микролитров раствора хорошо на чистую стеклянную крышку. Добавьте равный объем IKK1 и его ингибиторный комплекс в стеклянную крышку и аккуратно перемешайте, трубя вверх и вниз три-четыре раза. После нанесения смазки на кольца каждого колодец пластины, поверните стеклянную крышку и поместите на соответствующий колодец с типсами.Затем запечатайте колодец, нажав на стеклянную крышку. После настройки всех капель в 24-хорошо пластины, инкубировать в холодной комнате, в темноте. Иногда проверяйте капли под микроскопом на внешний вид и рост кристаллов.После того, как рост кристалла завершен, аккуратно удалите стеклянную крышку, содержащую кристалл, и поместите его на твердую поверхность с хрустальным падением вверх. Аккуратно добавьте 10 микролитров раствора крио А поверх капли и аккуратно перемешайте с помощью пипетки, чтобы кристалл не коснулся. Используя микроскоп, медленно удалить жидкость из кристалла и держать около пяти-восьми микролитров раствора.Аккуратно добавьте от 2,5 до четырех микролитров раствора крио В на каплю и аккуратно перемешайте с помощью пипетки. Обложка стеклянная крышка с небольшой чашкой Петри, чтобы избежать прямого воздушного потока над кристаллом. Прожгов пять минут, тщательно выберите один кристалл из капли в соответствующем криолупе, установленном на надлежащей основе.Вспышка заморозить кристалл в жидком азоте. Затем храните кристалл, содержащий криолуп, в шайбе, погруженной в жидкий азот, в колбе Dewar до готовности к рентгеновской дифракции на синхротроне. После обширных испытаний с несколькими различными вариантами IKK1 кристаллы были получены с одной усеченной конструкцией, которая отображала подходящие рентгеновские свойства только в присутствии ингибитора IKK XII.Совокупный эффект рентгеновских данных низкого разрешения со слабой интенсивности, большое количество молекул IKK1 в асимметричной единице и конформациальная вариация мономерно-димерикальной модели IKK1, по сравнению с известными моделями IKK2, затухлили получение молекулярно-заместительного раствора IKK1 и определение его структуры. Различные структуры IKK2 указывали на различную межмономерную ориентацию в пределах своих димеров, так что расстояние между альфа-углеродами P578 в двух областях киназы, в четырех различных моделях димера, варьировалось между 39 и 61 ангстремами. Получение полезной модели поиска стало возможным благодаря карте криоэлектронные микроскопии с низким разрешением и высокото точности модели доменов IKK1, которые могут быть созданы на основе структуры IKK2 с высоким разрешением.Первоначальная модель указывала на ориентацию домена киназы на 24 градуса по сравнению с мономером IKK2 и N-терминальным отверстием 58 ангстремов. Используя один из димеров с 52-ангстрем открытия в качестве модели, шесть димеров в асимметричный блок были расположены. После освоения, эта техника может быть выполнена в течение нескольких месяцев, если она выполняется должным образом.При попытке этой процедуры, важно помнить, что получение растворимого, активного и хорошо себя белок является первым важным шагом. После просмотра этого видео, вы должны иметь хорошее общее понимание всех шагов, которые должны следовать в кропотливой детали, чтобы быть успешным в кристаллизации и определения структуры белка IKK1. Изучая эту процедуру, все еще существуют структуры других белков семьи IKK, которые также могут быть определены для того, чтобы ответить на дополнительные вопросы о сигнализации киназы-митогена.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/&#945;

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Термостабилизации, Expression, очистки и кристаллизации Серотонин Transporter человека Обязанный<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Combining Wet and Dry Lab Techniques to Guide the Crystallization of Large Coiled-coil Containing Proteins

Сочетание мокрой и сухой методы Lab в Руководстве по кристаллизации больших биспиральных, содержащих белки

Obtaining crystals for structure determination can be a difficult and time consuming proposition for any protein. Coiled-coil proteins and domains are ...

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Производство, Кристаллизация и структура Определение<em&gt; C. несговорчивый</em&gt; PPEP-1 с помощью Microseeding и цинк-SAD

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

Высокая точность FRET на уровне одиночной молекулы для определения структуры биомолекулы

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO

Производство, кристаллизация и структурное определение мкножеского домена NEMO, имеющего обязательную силу IKK

NEMO is a scaffolding protein which plays an essential role in the NF-&#954;B pathway by assembling the IKK-complex with the kinases IKK&#945; and ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

Кристаллизация и структурное определение фермента: Субстратный комплекс по серийной кристаллографии в универсальном микрофлюидной чипе

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

The Extraction of Liver Glycogen Molecules for Glycogen Structure Determination

Liver glycogen is a hyperbranched glucose polymer that is involved in the maintenance of blood sugar levels in animals. The properties of glycogen are ...

Efficient and Scalable Production of Full-length Human Huntingtin Variants in Mammalian Cells using a Transient Expression System

Full-length huntingtin (FL HTT) is a large (aa 1-3,144), ubiquitously expressed, polyglutamine (polyQ)-containing protein with a mass of approximately 350 ...

High-Throughput Screening for Protein Crystallization

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography (Video) | JoVE 

Высокопроизводительный скрининг для получения кристаллических попаданий для кристаллографии белка

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into ...

A Fibrinolytic Enzyme-Based Method to Study Cerebral Thrombus Cell Components

A Comprehensive Approach to Analyze the Cell Components of Cerebral Blood Clots

A Novel Method for Comprehensive Cell Component Analysis of Cerebral Blood Clots (Video) | JoVE

Комплексный подход к анализу клеточных компонентов церебральных тромбов

Cerebral thrombosis, a blood clot in a cerebral artery or vein, is the most common type of cerebral infarction. The study of the cell components of ...