Name: a guide to production, crystallization, and structure determination of human ikk1/&#945;
Uploaded: 2018-11-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/ÃŽÂ± at JoVE.com

Agradecemos al personal de las líneas 19ID, 24ID y 13ID en avanzada fuente de fotones, Lemont, Illinois, para apoyo en la recopilación de datos sobre varios cristales. Agradecemos a Dmitry Lyumkis, Salk Institute para nosotros obtener el mapa de cryo-EM de baja resolución en las primeras etapas del EM mapa/modelo del edificio, que fue utilizado para construir el modelo inicial de búsqueda de recambio molecular de IKK1. La investigación conduce a estos resultados ha recibido financiación de subvenciones de NIH AI064326, CA141722 y GM071862 a GG. SP es actualmente un Wellcome Trust DBT India intermedio.

1. preparación de Virus recombinante adecuado para la expresión a gran escala de IKK1/α
<ol><li>
Preparación de virus de P1 32<ol>
<li>Día 1: Las células Sf9 placa (~ 6 X 105) (paso número menos de 10) en 2 mL de medio de insectos celular de III Sf900 en cada pozo de una placa de 6 pozos e incubar a 27 ° C. Las células de paso al llegar a una densidad de 2 a 3 X 106 células / mL en suspensión diluyendo en medio fresco con una densidad de ~ 6 X 10...

<ol>
	<li>Xia, Y., Shen, S., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB,+an+active+player+in+human+cancers.">NF-kappaB, an active player in human cancers.</a> Cancer immunology research. 2 (9), 823-830 (2014).</li><li>Grivennikov, S. I., Greten, F. 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M., Zandi, E., Natoli, G., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IKK-gamma+is+an+essential+regulatory+subunit+of+the+IkappaB+kinase+complex.">IKK-gamma is an essential regulatory subunit of the IkappaB kinase complex.</a> Nature. 395 (6699), 297-300 (1998).</li><li>Yamaoka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementation+cloning+of+NEMO,+a+component+of+the+IkappaB+kinase+complex+essential+for+NF-kappaB+activation.">Complementation cloning of NEMO, a component of the IkappaB kinase complex essential for NF-kappaB activation.</a> Cell. 93 (7), 1231-1240 (1998).</li><li>Li, Z. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IKKbeta+subunit+of+IkappaB+kinase+(IKK)+is+essential+for+nuclear+factor+kappaB+activation+and+prevention+of+apoptosis.">The IKKbeta subunit of IkappaB kinase (IKK) is essential for nuclear factor kappaB activation and prevention of apoptosis.</a> J Exp Med. 189 (11), 1839-1845 (1999).</li><li>Hayden, M. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shared+principles+in+NF-kappaB+signaling.">Shared principles in NF-kappaB signaling.</a> Cell. 132 (3), 344-362 (2008).</li><li>Sun, S. C., Chang, J. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncanonical+NF-kappaB+activation+requires+coordinated+assembly+of+a+regulatory+complex+of+the+adaptors+cIAP1,+cIAP2,+TRAF2+and+TRAF3+and+the+kinase+NIK.">Noncanonical NF-kappaB activation requires coordinated assembly of a regulatory complex of the adaptors cIAP1, cIAP2, TRAF2 and TRAF3 and the kinase NIK.</a> Nat Immunol. 9 (12), 1371-1378 (2008).</li><li>Vallabhapurapu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonredundant+and+complementary+functions+of+TRAF2+and+TRAF3+in+a+ubiquitination+cascade+that+activates+NIK-dependent+alternative+NF-kappaB+signaling.">Nonredundant and complementary functions of TRAF2 and TRAF3 in a ubiquitination cascade that activates NIK-dependent alternative NF-kappaB signaling.</a> Nat Immunol. 9 (12), 1364-1370 (2008).</li><li>Annunziata, C. 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B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MolProbity:+all-atom+structure+validation+for+macromolecular+crystallography.">MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 1), 12-21 (2010).</li></ol>

Solución de producción, estructura y cristalización de dos proteínas relacionadas de IKK Nos propusimos para determinar la estructura de cristal de rayos x de IKK1/α con la idea de que sería un ejercicio relativamente sencillo dado nuestra experiencia con la producción de proteínas, cristalización y determinación estructural de IKK2/β. Sin embargo, nos quedamos muy sorprendidos que estas dos proteínas relacionadas se comportaron muy diferentemente con respecto a la facilidad de cristalizac...

Actividades transcripcionales de la familia del NF-κB de factores de transcripción dimérico son necesarias para diversas funciones celulares que van desde la inflamación y la inmunidad a la supervivencia y muerte. Estas actividades son rigurosamente controladas en las células y una pérdida de regulación conduce a diversas condiciones patológicas, incluyendo enfermedades autoinmunes y cáncer1,2,3. En la ausencia de un estímulo, la actividad de NF-κB se mantiene inhibida de proteínas IκB (inhibidor de - KB)4. La fosforilación de residuos de Ser específicos en proteínas IκB marca por ubiquitinación y degradación proteasomal posterior o procesamiento selectivo5. Dos quinasas Ser/Thr altamente homólogas, IKK2/β y IKK1/α, actúan como reguladores de la central de actividades de NF-κB por llevar a cabo estos eventos de fosforilación6,7.
Interacción entre un ligando y un receptor transmite una señal a través de una serie de mediadores que conducen a la activación de factores NF-κB. El proceso de señalización de NF-κB se puede clasificar ampliamente en dos distintas vías – canónico y no canónico (alternativa)8. La actividad de IKK2/β regula principalmente la señalización de NF-κB de la vía canónica que es esencial para la respuesta inmune inflamatoria y naturales9. Una característica distintiva de esta vía es una activación rápida y de corta duración de IKK2/β10 dentro de un complejo de IKK desacostumbrado hasta entonces bioquímicamente — se presume para ser compuesto de IKK1 IKK2, como un componente regulatorio, NEMO (modulador esencial de NF-κB )11,12,13. Entre las dos subunidades catalíticas de IKK del complejo IKK, IKK2 es sobre todo responsable14 para la fosforilación de los residuos específicos del prototipo IκBs (α, - β y γ-) unido a NF-κB y también una proteína anormal de IκB, NF-κB1/p105, que es un precursor de la de subunidad p50 de NF-κB5. La fosforilación inducida por ubiquitinación y degradación proteasomal de IκB (o procesamiento de p105) conduce a la liberación y activación de un conjunto específico de NF-κB dímeros15. Actividad de NF-κB aberrante debido a función mal regulada de IKK2 se ha observado en muchos tipos de cáncer, así como en trastornos autoinmunitarios2,3,16.
A diferencia de IKK2/β, actividad de IKK1/α regula la señalización de NF-κB de la vía no canónica, que es esencial para el desarrollo y la inmunidad. IKK1 fosforila residuos específicos de NF-κB2/p100 en su segmento terminal C IκBδ, que conduce a su transformación y la generación de p52. La formación del heterodímero p52:RelB transcripcionalmente activo inicia una lenta y sostenida ante las señales del desarrollo7,17,18,19,20. Curiosamente, la generación de la central p52 de factor NF-κB de esta vía es críticamente dependiente de otro factor, cinasa de la inducción de NF-κB (NIK)21,22, pero no en IKK2 o NEMO. En las células de reclinación, el NIK sigue siendo bajo debido a su constante degradación dependiente del proteosoma23,24,25. Sobre el estímulo de las células por ligandos 'no canónico' y en ciertas células malignas, NIK se convierte estabilizado para reclutar y activar IKK1 / α. actividades quinasa de NIK y IKK1 son esenciales para la transformación eficiente de p100 en p527. IKK1 y NIK fosforilan tres serinas (Ser866, 870 y 872) de NF-κB2/p100 en su segmento terminal C IκBδ a su procesamiento y la generación de p52. Activación aberrante de la vía no canónica se ha implicado en muchas neoplasias como mieloma múltiple26,27,28.
Se conocen varios inhibidores altamente eficientes y específicos de IKK2/β, aunque ninguno hasta ahora han resultado para ser un fármaco efectivo. Por el contrario, los inhibidores específicos de IKK1/α son escasos. Esto puede deberse en parte a la falta de información estructural y bioquímica de IKK1/α, que limita nuestra comprensión de la base mecanicista de la activación de NF-κB por IKK1 en las células y el diseño racional de medicamentos. Las estructuras de rayos x de IKK2/β nos proporcionan penetraciones en el mecanismo de activación de IKK2/β29; sin embargo, estas estructuras no podían revelar cómo los diferentes estímulos arriba activar activación de IKK1/α o β/IKK2 regular conjuntos distintos de NF-κB actividades 30,31. Entender las bases mecanicistas subyacentes a la función de señalización distintiva de IKK1/α y para establecer una plataforma para el diseño racional de medicamentos, nos enfocamos en determinar la estructura de IKK1/α.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cellfectin/Cellfectin II</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10362100</td>
			<td>Cellfectin is now discontinued, replaced by Cellfectin II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf900 III Insect cell medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12658-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SF9 cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12659017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-IKK1 antibody</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB100-56704</td>
			<td>Previously sold by Imgenex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PentaHis antibody</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>34460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>Nitrocellulose can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford assay reagent</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>500001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28989335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon concentrator</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC801008, UFC803008, UFC201024, UFC203024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound A</td>
			<td>Bayer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calbiochem IKK-inhibitor XII</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>401491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staurosporine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>S4400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLN120B</td>
			<td>Millenium</td>
			<td>Gift item</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPPNP</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A2647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulfate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>51227, 42867, 31404,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulfate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>93593, 81210, 88276, 95904, 81255, 89510, 92897, 81285, 95172</td>
			<td>Some of them are new Cat # on SIGMA catalogue. What we had was originally from Fluka that had different Cat #.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystallization Screens</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Screen I and II (Crystal Screen HT)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index HT</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG/Ion and PEG/Ion2 (PEG/Ion HT)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEGRX 1 and PEGRx 2 (PEGRx HT)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SaltRx 1 and SaltRx 2 (SaltRx HT)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal mounts</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR8-188, 190, 192, 194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synchrotron</td>
			<td>The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy&#8217;s Argonne National Laboratory</td>
			<td>Beamline 19 ID</td>
			<td>The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy&#8217;s Argonne National Laboratory provides ultra-bright, high-energy storage ring-generated X-ray beams for research in almost all scientific disciplines.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a guide to production, crystallization, and structure determination of human ikk1/&#945;

Una clase de estímulos extracelulares requiere activación de IKK1/α para inducir la generación de una subunidad de NF-κB, p52, por medio del procesamiento de su precursor p100. p52 funciona como un homodímero o un heterodímero con otra subunidad de NF-κB, RelB. Estos dímeros a su vez regulan la expresión de cientos de genes implicados en la inflamación, la supervivencia de la célula y ciclo celular. IKK1/α permanece principalmente asociado con IKK2/β y NEMO como un complejo ternario. Sin embargo, una pequeña piscina de la también se observa como un complex(es) de bajo peso molecular. Se desconoce si la actividad de procesamiento de la p100 es desencadenada por la activación de IKK1/α dentro del más grande o la más pequeña piscina complejo. Actividad constitutiva de IKK1/α se ha detectado en varios tipos de cáncer y enfermedades inflamatorias. Para entender el mecanismo de activación de IKK1/α y permiten su uso como una diana farmacológica, expresamos IKK1/α recombinante en diferentes hosts, como e. coli, insectos y células de mamíferos. Hemos logrado expresar IKK1/α soluble en baculovirus infectan células de los insectos, obtener cantidades de mg de proteína de alta pureza, cristalización en presencia de inhibidores y determinar su estructura de cristal de rayos x. Aquí, describimos los pasos detallados para producir la proteína recombinante, su cristalización y su determinación de estructura cristalina por rayos x.

Clonación y expresión de diferentes construcciones de IKK1/α Longitud total que ikk1/α humana fue clonada en el pFastBacHTa de vector de expresión de baculovirus en sus sitios de restricción EcoRI y NotI para obtener un N-terminal hexa-histidina tagged IKK1. La etiqueta podría ser quitada por la digestión de proteasa TEV. Longitud total IKK1/α contiene regiones flexibles en ambos extremos, y regiones flexibles generalmente representar una proteína difícil de...

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A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

IκB cinasa 1/α (CHUK IKK1/α) es una Ser/Thr quinasa que participa en un sinnúmero de actividades celulares principalmente a través de la activación de factores de transcripción NF-κB. Aquí, describimos los principales pasos necesarios para la producción y determinación de estructura cristalina de esta proteína.

Una guía para la producción, cristalización y determinación de la estructura de IKK1/α humano

A class of extracellular stimuli requires activation of IKK1/&#945; to induce generation of an NF-&#954;B subunit, p52, through processing of its ...

El objetivo de este procedimiento es proporcionar orientación para la producción, cristalización y determinación estructural de IKK1-alfa humano con el fin de comprender la base mecanicista de su función de señalización y establecer plataformas para el diseño racional de fármacos. Este método debe ayudar a los investigadores a determinar la estructura de IKK1, que proporcionaría respuestas a las consultas clave en el campo de la señalización inmune. Esta técnica describe un camino simplificado para obtener cristales de proteínas IKK, que son bastante refractarios a la cristalización y para proporcionar diversa información crítica en la superación de cuellos de botella en la determinación de las estructuras.Generalmente, los individuos nuevos en este método lucharán, porque la generación de cantidades de miligramos de proteína soluble, bien portado, requiere su expresión en las células de insectos, y la cristalización se puede hacer bajo sólo una ventana muy estrecha de condiciones. El procedimiento de reemplazo molecular utilizado para determinar la estructura de IKK1 también puede ser muy complicado, especialmente debido a la mala propiedad de desviación de los cristales, no en el sitio de la unidad asimétrica que contiene muchas moléculas IKK1 en ausencia de modelos de búsqueda adecuados. Demostrando los procedimientos estarán Kyle Shumate y Sonjiala Hotchkiss, estudiantes de mi laboratorio.En el primer día, placa Sf9 células en dos mililitros de medio de células de insecto Sf903, en cada pozo de una placa de seis pozos e incubar a 27 grados centígrados. Pasar las células cuando alcanzan una densidad de dos a tres veces 10 a las seis células por mililitro en suspensión diluyéndolas a medios frescos, a una densidad de aproximadamente seis veces 10 a las cinco. En el segundo día, diluir ocho microlitros de reactivo de transfección Sf9 en 100 microlitros de SF-903 o Grace's Insect Medium.A continuación, vórtice la mezcla brevemente. En un tubo separado, diluir un microgramo de bacmid recombinante purificado en 100 microlitros del mismo medio. Combine el ADN diluido y el reactivo de transfección.Después de incubar a temperatura ambiente durante 15 a 30 minutos, retire el medio del pozo. A continuación, agregue un mililitro de medio fresco. A continuación, agregue la mezcla de reactivo de transfección de ADN diluido a gota en las células, ajustando el tamaño de la gota de manera que no desaloja las células adherentes.Después de seis horas, agregue 1,5 mililitros de medio fresco encima de las células. Incubar las células a 27 grados centígrados, revisando los pozos periódicamente cada 12 horas en busca de signos de infección viral. En el día cinco, retire el medio que contiene las células, 60 a 72 horas después de la infección.Después de transferir el medio a tubos, centrifugar durante cinco minutos a 500 veces g y cuatro grados Celsius. Cuando haya terminado, guarde el sobrenadante, que es la pila de virus P1. En el primer día, resuspender el pellet celular His-IKK1 previamente preparado en 40 mililitros de tampón de lelisis.Coloque la suspensión celular sobre hielo y anlice las células por sonicación en 60%a 70%ciclos de trabajo y cinco a 10 pulsos de 30 segundos de duración en un intervalo superior a un minuto. Aclarar el lesate por centrifugación a mayor o igual a 28.000 g durante 45 minutos a cuatro grados centígrados. Después de preparar una resina de agarosa de níquel-NTA, de acuerdo con el protocolo de texto, eluir la proteína alfa IKK1 etiquetada con su etiqueta bajo flujo de gravedad utilizando 20 mililitros de tampón de elución.Recoger una a 1,5 fracciones mililitros. Después de combinar las fracciones que contienen la proteína, digiere la muestra con TEV proteasa durante la noche a cuatro grados centígrados. En la mañana del segundo día, incubar la proteína con un milimotor de ATP, en presencia de cloruro de magnesio, betagluerofosfato, fluoruro de sodio y ortovanato de sodio durante una hora a 27 grados centígrados.Después de la incubación, filtre la solución proteica a través de un filtro de 0,45 micras. A continuación, cargue aproximadamente seis mililitros de la muestra en una columna de exclusión de tamaño preparativo de 120 mililitros, unida a un sistema automatizado de cromatografía líquida. Después del equilibrio, ejecute la cromatografía de exclusión de tamaño a un caudal de un mililitro por minuto y recoja fracciones de dos mililitros.Durante la ejecución, monitoree la elución a 280 y 254 nanómetros. Después de tirar de las fracciones puras, concéntrese en un concentrador centrífugo de corte de peso molecular de 30 kilos, siguiendo las instrucciones del fabricante. A continuación, dispensar alícuotas de 25 microlitros de la proteína concentrada y congelación del flash en nitrógeno líquido.Usando un robot, pipetee 80 a 100 microlitros de un reactivo de cristalización en el depósito de una placa de 96 pozos. Usando un robot de cristalización, dispensar y mezclar 0.2 a 0.25 microlitros de IKK1 y su complejo inhibidor con el mismo volumen de solución de depósito. Inmediatamente después de ajustar las gotas, selle cada placa con películas ópticamente transparentes para evitar la evaporación.Incubar una placa a 18 grados centígrados y la otra placa a cuatro grados centígrados en una sala fría. Utilice un microscopio estéreo con un polarizador para comprobar la apariencia del cristal en cada gota, todos los días, durante los primeros siete días y luego a intervalos más largos. Después de preparar IKK1 y su complejo inhibidor como se ha descrito anteriormente, transfiera las soluciones de pozo a cada pozo de una placa de 24 pozos.Coloque de una a 1,5 microlitros de solución de pozo en un cubreobjetos de vidrio limpio. Agregue un volumen igual de IKK1 y su complejo de inhibidores al cubreobjetos de vidrio y mezcle suavemente en pipeteando hacia arriba y hacia abajo de tres a cuatro veces. Después de aplicar grasa en los anillos de cada pocero de la placa, gire el cubreobjetos de vidrio y colóquelo en el pozo respectivo con fórceps.A continuación, selle el pozo presionando hacia abajo en el cubreobjetos de vidrio. Después de poner todas las gotas en el plato de 24 pozos, incubar en la sala fría, en la oscuridad. Ocasionalmente comprobar las gotas bajo un microscopio para la apariencia y el crecimiento de los cristales.Una vez que el crecimiento del cristal esté completo, retire suavemente el cubreobjetos de vidrio que contiene el cristal y colóquelo sobre una superficie sólida con el cristal hacia arriba. Añadir suavemente 10 microlitros de crio Solución en la parte superior de la gota y mezclar suavemente por pipeteo para que el cristal no se toque. Con un microscopio, retire lentamente un poco de líquido del cristal y mantenga alrededor de cinco a ocho microlitros de la solución.Agregue suavemente 2,5 a cuatro microlitros de solución crio B en la gota y mezcle suavemente en pipeteando. Cubra el cubreobjetos de vidrio con un pequeño plato petrie para evitar el flujo de aire directo sobre el cristal. Después de esperar cinco minutos, escoge cuidadosamente un solo cristal de la gota en una crioda apropiada montada sobre una base adecuada.Congela el cristal en nitrógeno líquido. A continuación, guarde el cristal que contiene crioolopo en un disco sumergido en nitrógeno líquido en un matraz Dewar hasta que esté listo para la difracción de rayos X en el sincrotrón. Después de extensos ensayos con varias variantes diferentes de IKK1, se obtuvieron cristales con una construcción truncada, que mostraba propiedades adecuadas de rayos X sólo en presencia del inhibidor IKK XII.El efecto combinado de los datos de rayos X de baja resolución con intensidades débiles, un gran número de moléculas IKK1 en la unidad asimétrica y la variación conformacional del modelo monomérico-dimerico IKK1, en comparación con los modelos conocidos IKK2, hizo difícil obtener una solución de reemplazo molecular, IKK1, y determinar su estructura. Diferentes estructuras IKK2 indicaban una orientación inter monómero diferente dentro de sus dimers de modo que la distancia entre los carbonos alfa de P578 en los dos dominios de quinasa, en cuatro modelos de dimer diferentes, variaba entre 39 y 61 angstroms. La obtención de un modelo de búsqueda útil era posible gracias al mapa de microscopía de crioelectrón de baja resolución y a un modelo de alta precisión de dominios IKK1 que se podía generar basado en una estructura IKK2 de alta resolución.El modelo inicial indicaba una orientación del dominio de la quinasa rotada 24 grados en relación con la de un monómero IKK2 y una abertura N-terminal de 58 angstroms. Usando uno de los dimers con la apertura de 52-angstrom como modelo, se localizaron seis dimers en la unidad asimétrica. Una vez masterada, esta técnica se puede ejecutar en un par de meses, si se realiza correctamente.Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la obtención de una proteína soluble, activa y bien portado es el primer paso crítico. Después de ver este video, usted debe tener una buena comprensión general de todos los pasos que deben seguirse con minucioso detalle, para tener éxito en la cristalización y determinación de la estructura de la proteína IKK1. Al aprender este procedimiento, todavía hay estructuras de otras proteínas de la familia IKK que también se pueden determinar para responder preguntas adicionales sobre la señalización kinasa-mitógeno.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/&#945;

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Termoestabilización, Expresión, purificación y cristalización del transportador de serotonina humano enlazado a<em&gt; S</em&gt; citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Investigación

Bioquímica

Combining Wet and Dry Lab Techniques to Guide the Crystallization of Large Coiled-coil Containing Proteins

Combinando húmedo y Técnicas de laboratorio de simulación para guiar la cristalización de proteínas grandes que contengan espiral de la bobina

Obtaining crystals for structure determination can be a difficult and time consuming proposition for any protein. Coiled-coil proteins and domains are ...

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Producción, Cristalización y determinación de la estructura de<em&gt; C. difícil</em&gt; PPEP-1 a través de microsiembra y Zinc-SAD

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

FRET de alta precisión a nivel de molécula única para la determinación de estructuras de biomoléculas

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO

Producción, cristalización y determinación de la estructura del dominio vinculante iKK de NEMO

NEMO is a scaffolding protein which plays an essential role in the NF-&#954;B pathway by assembling the IKK-complex with the kinases IKK&#945; and ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

Cristalización y determinación estructural de una enzima: complejo de sustratos por cristalografía serie en un chip microfluídico versátil

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

The Extraction of Liver Glycogen Molecules for Glycogen Structure Determination

Liver glycogen is a hyperbranched glucose polymer that is involved in the maintenance of blood sugar levels in animals. The properties of glycogen are ...

Efficient and Scalable Production of Full-length Human Huntingtin Variants in Mammalian Cells using a Transient Expression System

Full-length huntingtin (FL HTT) is a large (aa 1-3,144), ubiquitously expressed, polyglutamine (polyQ)-containing protein with a mass of approximately 350 ...

High-Throughput Screening for Protein Crystallization

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography (Video) | JoVE 

Cribado de alto rendimiento para obtener golpes de cristal para cristalografía de proteínas

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into ...

A Fibrinolytic Enzyme-Based Method to Study Cerebral Thrombus Cell Components

A Comprehensive Approach to Analyze the Cell Components of Cerebral Blood Clots

A Novel Method for Comprehensive Cell Component Analysis of Cerebral Blood Clots (Video) | JoVE

Un enfoque integral para analizar los componentes celulares de los coágulos sanguíneos cerebrales

Cerebral thrombosis, a blood clot in a cerebral artery or vein, is the most common type of cerebral infarction. The study of the cell components of ...