Name: a guide to production, crystallization, and structure determination of human ikk1/&#945;
Uploaded: 2018-11-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/ÃŽÂ± at JoVE.com

Vi vill tacka Personalen på de linjer 19ID, 24ID och 13ID på Advanced Photon Source, Lemont, IL, för stöd under datainsamlingen på olika kristaller. Vi är tacksamma mot Dmitry Lyumkis, Salk Institute för att hämta oss låg upplösning cryo-EM karta i tidiga skeden av EM karta/modellbygge, som användes till att bygga den första IKK1 molekylära ersättning Sök modellen. Den forskning som leder till dessa resultat har fått finansiering från NIH grants AI064326, CA141722 och GM071862 till GG. SP är för närvarande en Wellcome Trust DBT Indien mellanliggande Karl.

1. beredning av rekombinanta Virus lämplig för storskaliga uttryck för IKK1/α
<ol><li>
P1 virus förberedelse 32<ol>
<li>Dag 1: Plattan Sf9 celler (~ 6 X 105) (passage nummer mindre än 10) i 2 mL av Sf900 III insekt cell medium i varje brunn 6-well platta och inkubera vid 27 ° C. Passagen celler när de når en densitet på 2 till 3 X 106 celler per mL i suspension genom spädning i färska media på en densitet på ~ 6 X 105.</li>
		<li>Da...

<ol>
	<li>Xia, Y., Shen, S., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB,+an+active+player+in+human+cancers.">NF-kappaB, an active player in human cancers.</a> Cancer immunology research. 2 (9), 823-830 (2014).</li><li>Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity,+inflammation,+and+cancer.">Immunity, inflammation, and cancer.</a> Cell. 140 (6), 883-899 (2010).</li><li>Ben-Neriah, Y., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+meets+cancer,+with+NF-kappaB+as+the+matchmaker.">Inflammation meets cancer, with NF-kappaB as the matchmaker.</a> Nature immunology. 12 (8), 715-723 (2011).</li><li>Hinz, M., Scheidereit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IkappaB+kinase+complex+in+NF-kappaB+regulation+and+beyond.">The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond.</a> EMBO reports. 15 (1), 46-61 (2014).</li><li>Karin, M., Ben-Neriah, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+meets+ubiquitination:+the+control+of+NF-[kappa]B+activity.">Phosphorylation meets ubiquitination: the control of NF-[kappa]B activity.</a> Annu Rev Immunol. 18, 621-663 (2000).</li><li>Ghosh, S., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Missing+pieces+in+the+NF-kappaB+puzzle.">Missing pieces in the NF-kappaB puzzle.</a> Cell. 109, S81-S96 (2002).</li><li>Sun, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+noncanonical+NF-kappaB+pathway.">The noncanonical NF-kappaB pathway.</a> Immunol Rev. 246 (1), 125-140 (2012).</li><li>Bonizzi, G., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+NF-kappaB+activation+pathways+and+their+role+in+innate+and+adaptive+immunity.">The two NF-kappaB activation pathways and their role in innate and adaptive immunity.</a> Trends Immunol. 25 (6), 280-288 (2004).</li><li>DiDonato, J. A., Hayakawa, M., Rothwarf, D. M., Zandi, E., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cytokine-responsive+IkappaB+kinase+that+activates+the+transcription+factor+NF-kappaB.">A cytokine-responsive IkappaB kinase that activates the transcription factor NF-kappaB.</a> Nature. 388 (6642), 548-554 (1997).</li><li>Werner, S. L., Barken, D., Hoffmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulus+specificity+of+gene+expression+programs+determined+by+temporal+control+of+IKK+activity.">Stimulus specificity of gene expression programs determined by temporal control of IKK activity.</a> Science. 309 (5742), 1857-1861 (2005).</li><li>Zandi, E., Rothwarf, D. M., Delhase, M., Hayakawa, M., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IkappaB+kinase+complex+(IKK)+contains+two+kinase+subunits,+IKKalpha+and+IKKbeta,+necessary+for+IkappaB+phosphorylation+and+NF-kappaB+activation.">The IkappaB kinase complex (IKK) contains two kinase subunits, IKKalpha and IKKbeta, necessary for IkappaB phosphorylation and NF-kappaB activation.</a> Cell. 91 (2), 243-252 (1997).</li><li>Rothwarf, D. M., Zandi, E., Natoli, G., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IKK-gamma+is+an+essential+regulatory+subunit+of+the+IkappaB+kinase+complex.">IKK-gamma is an essential regulatory subunit of the IkappaB kinase complex.</a> Nature. 395 (6699), 297-300 (1998).</li><li>Yamaoka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementation+cloning+of+NEMO,+a+component+of+the+IkappaB+kinase+complex+essential+for+NF-kappaB+activation.">Complementation cloning of NEMO, a component of the IkappaB kinase complex essential for NF-kappaB activation.</a> Cell. 93 (7), 1231-1240 (1998).</li><li>Li, Z. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IKKbeta+subunit+of+IkappaB+kinase+(IKK)+is+essential+for+nuclear+factor+kappaB+activation+and+prevention+of+apoptosis.">The IKKbeta subunit of IkappaB kinase (IKK) is essential for nuclear factor kappaB activation and prevention of apoptosis.</a> J Exp Med. 189 (11), 1839-1845 (1999).</li><li>Hayden, M. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shared+principles+in+NF-kappaB+signaling.">Shared principles in NF-kappaB signaling.</a> Cell. 132 (3), 344-362 (2008).</li><li>Sun, S. C., Chang, J. H., Jin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+nuclear+factor-kappaB+in+autoimmunity.">Regulation of nuclear factor-kappaB in autoimmunity.</a> Trends Immunol. 34 (6), 282-289 (2013).</li><li>Claudio, E., Brown, K., Park, S., Wang, H., Siebenlist, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAFF-induced+NEMO-independent+processing+of+NF-kappa+B2+in+maturing+B+cells.">BAFF-induced NEMO-independent processing of NF-kappa B2 in maturing B cells.</a> Nat Immunol. 3 (10), 958-965 (2002).</li><li>Senftleben, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+by+IKKalpha+of+a+second,+evolutionary+conserved,+NF-kappa+B+signaling+pathway.">Activation by IKKalpha of a second, evolutionary conserved, NF-kappa B signaling pathway.</a> Science. 293 (5534), 1495-1499 (2001).</li><li>Coope, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40+regulates+the+processing+of+NF-kappaB2+p100+to+p52.">CD40 regulates the processing of NF-kappaB2 p100 to p52.</a> EMBO J. 21 (20), 5375-5385 (2002).</li><li>Dejardin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lymphotoxin-beta+receptor+induces+different+patterns+of+gene+expression+via+two+NF-kappaB+pathways.">The lymphotoxin-beta receptor induces different patterns of gene expression via two NF-kappaB pathways.</a> Immunity. 17 (4), 525-535 (2002).</li><li>Xiao, G., Fong, A., Sun, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+p100+processing+by+NF-kappaB-inducing+kinase+involves+docking+IkappaB+kinase+alpha+(IKKalpha)+to+p100+and+IKKalpha-mediated+phosphorylation.">Induction of p100 processing by NF-kappaB-inducing kinase involves docking IkappaB kinase alpha (IKKalpha) to p100 and IKKalpha-mediated phosphorylation.</a> The Journal of biological chemistry. 279 (29), 30099-30105 (2004).</li><li>Xiao, G., Harhaj, E. W., Sun, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB-inducing+kinase+regulates+the+processing+of+NF-kappaB2+p100.">NF-kappaB-inducing kinase regulates the processing of NF-kappaB2 p100.</a> Molecular cell. 7 (2), 401-409 (2001).</li><li>Qing, G., Qu, Z., Xiao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+basally+translated+NF-kappaB-inducing+kinase+(NIK)+protein+functions+as+a+molecular+switch+of+processing+of+NF-kappaB2+p100.">Stabilization of basally translated NF-kappaB-inducing kinase (NIK) protein functions as a molecular switch of processing of NF-kappaB2 p100.</a> J Biol Chem. 280 (49), 40578-40582 (2005).</li><li>Zarnegar, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncanonical+NF-kappaB+activation+requires+coordinated+assembly+of+a+regulatory+complex+of+the+adaptors+cIAP1,+cIAP2,+TRAF2+and+TRAF3+and+the+kinase+NIK.">Noncanonical NF-kappaB activation requires coordinated assembly of a regulatory complex of the adaptors cIAP1, cIAP2, TRAF2 and TRAF3 and the kinase NIK.</a> Nat Immunol. 9 (12), 1371-1378 (2008).</li><li>Vallabhapurapu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonredundant+and+complementary+functions+of+TRAF2+and+TRAF3+in+a+ubiquitination+cascade+that+activates+NIK-dependent+alternative+NF-kappaB+signaling.">Nonredundant and complementary functions of TRAF2 and TRAF3 in a ubiquitination cascade that activates NIK-dependent alternative NF-kappaB signaling.</a> Nat Immunol. 9 (12), 1364-1370 (2008).</li><li>Annunziata, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequent+engagement+of+the+classical+and+alternative+NF-kappaB+pathways+by+diverse+genetic+abnormalities+in+multiple+myeloma.">Frequent engagement of the classical and alternative NF-kappaB pathways by diverse genetic abnormalities in multiple myeloma.</a> Cancer cell. 12 (2), 115-130 (2007).</li><li>Keats, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promiscuous+mutations+activate+the+noncanonical+NF-kappaB+pathway+in+multiple+myeloma.">Promiscuous mutations activate the noncanonical NF-kappaB pathway in multiple myeloma.</a> Cancer cell. 12 (2), 131-144 (2007).</li><li>Staudt, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+activation+of+NF-kappaB.">Oncogenic activation of NF-kappaB.</a> Cold Spring Harbor perspectives in biology. 2 (6), a000109 (2010).</li><li>Polley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structural+basis+for+IkappaB+kinase+2+activation+via+oligomerization-dependent+trans+auto-phosphorylation.">A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation.</a> PLoS Biol. 11 (6), e1001581 (2013).</li><li>Hinz, M., Scheidereit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IkappaB+kinase+complex+in+NF-kappaB+regulation+and+beyond.">The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond.</a> EMBO Rep. 15 (1), 46-61 (2014).</li><li>Scheidereit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IkappaB+kinase+complexes:+gateways+to+NF-kappaB+activation+and+transcription.">IkappaB kinase complexes: gateways to NF-kappaB activation and transcription.</a> Oncogene. 25 (51), 6685-6705 (2006).</li><li>Luckow, V. A., Lee, S. C., Barry, G. F., Olins, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+infectious+recombinant+baculoviruses+by+site-specific+transposon-mediated+insertion+of+foreign+genes+into+a+baculovirus+genome+propagated+in+Escherichia+coli.">Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli.</a> J Virol. 67 (8), 4566-4579 (1993).</li><li>Polley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Basis+for+the+Activation+of+IKK1/alpha.">Structural Basis for the Activation of IKK1/alpha.</a> Cell reports. 17 (8), 1907-1914 (2016).</li><li>Otwinowski, Z. a. M., W, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+X-ray+Diffraction+Data+Collected+in+Oscillation+Mode.">Processing of X-ray Diffraction Data Collected in Oscillation Mode.</a> Methods in Enzymology. 276 (Macromolecular Crystallography, part A), 307-326 (1997).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+human+IkappaB+kinase+beta+asymmetric+dimer.">Crystal structure of a human IkappaB kinase beta asymmetric dimer.</a> J Biol Chem. 288 (31), 22758-22767 (2013).</li><li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+development+of+Coot.">Features and development of Coot.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).</li><li>McCoy, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phaser+crystallographic+software.">Phaser crystallographic software.</a> Journal of applied crystallography. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).</li><li>Vagin, A. T., Teplyakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MOLREP:+an+automated+program+for+molecular+replacement.">MOLREP: an automated program for molecular replacement.</a> J. Appl. Cryst. 30, 1022-1025 (1997).</li><li>Brunger, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Version+1.2+of+the+Crystallography+and+NMR+system.">Version 1.2 of the Crystallography and NMR system.</a> Nature protocols. 2 (11), 2728-2733 (2007).</li><li>Brunger, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallography+&amp;+NMR+system:+A+new+software+suite+for+macromolecular+structure+determination.">Crystallography &amp; NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological. 54 (Pt 5), 905-921 (1998).</li><li>McRee, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XtalView:+a+visual+protein+crystallographic+software+system+for+X11/Xview.">XtalView: a visual protein crystallographic software system for X11/Xview.</a> J. Mol Graph. 10, 44-47 (1992).</li><li>Schroder, G. F., Levitt, M., Brunger, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+biomolecular+crystallography+with+low-resolution+data.">Super-resolution biomolecular crystallography with low-resolution data.</a> Nature. 464 (7292), 1218-1222 (2010).</li><li>Polley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structural+basis+for+IkappaB+kinase+2+activation+via+oligomerization-dependent+trans+auto-phosphorylation.">A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation.</a> PLoS biology. 11 (6), e1001581 (2013).</li><li>Christopher, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+discovery+of+2-amino-3,5-diarylbenzamide+inhibitors+of+IKK-alpha+and+IKK-beta+kinases.">The discovery of 2-amino-3,5-diarylbenzamide inhibitors of IKK-alpha and IKK-beta kinases.</a> Bioorganic &amp; medicinal chemistry letters. 17 (14), 3972-3977 (2007).</li><li>Karplus, P. A., Diederichs, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+crystallographic+model+and+data+quality.">Linking crystallographic model and data quality.</a> Science. 336 (6084), 1030-1033 (2012).</li><li>Chen, V. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MolProbity:+all-atom+structure+validation+for+macromolecular+crystallography.">MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 1), 12-21 (2010).</li></ol>

Produktion, kristallisering och struktur lösning av två relaterade IKK proteiner Vi fastställde för att bestämma röntgen kristallstrukturen av IKK1/α med uppfattningen att det skulle vara en relativt enkel övning som gett vår erfarenhet med IKK2/β proteinproduktion, kristallisering och strukturbestämning. Vi var dock mycket förvånad över att dessa två relaterade proteiner betett sig mycket annorlunda när det gäller användarvänlighet kristallisering. Trots ansträngningar från flera...

Transkriptionell aktiviteter i familjen NF-κB dimeriskt transkriptionsfaktorer som krävs för olika cellulära funktioner alltifrån inflammation och immunitet till överlevnad och död. Dessa aktiviteter är strikt kontrollerade i celler och en förlust av förordning leder till olika sjukdomstillstånd, inklusive autoimmuna sjukdomar och cancer1,2,3. I avsaknad av ett stimulus hålls NF-κB verksamhet hämmade av IκB (hämmare av - κB) proteiner4. Fosforyleringen av specifika Ser rester på IκB proteiner markerar dem för ubikvitinering och efterföljande proteasomen nedbrytning eller selektiv bearbetning5. Två mycket homologa Ser/Thr kinaser, IKK2/β och IKK1/α, fungera som central regulatorer av NF-κB aktiviteter genom att utföra dessa fosforylering händelser6,7.
Interaktioner mellan en ligand och en receptor transduces en signal genom en serie av mediatorer som leder till aktivering av NF-κB faktorer. NF-κB signalering processen kan i huvudsak delas in i två distinkta vägar – kanoniska och icke-kanoniska (alternativa)8. Aktiviteten av IKK2/β reglerar främst NF-κB signaleringen av canonical-vägen som är väsentlig för inflammatoriska och medfödda immunsvar9. Ett distinkt inslag i denna väg är en snabb och kortvarig aktivering av IKK2/β10 inom en hittills biokemiskt uncharacterized IKK komplexa — förmodas vara sammansatt av IKK1 och IKK2, samt en reglerande komponent, NEMO (NF-κB viktig Modulator )11,12,13. Mellan två katalytisk IKK subunitsna av komplexet IKK, IKK2 är primärt ansvarig14 för fosforyleringen av specifika rester av prototypiska IκBs (α, - β, & -γ) bundna till NF-κB och också en atypisk IκB protein, NF-κB1/p105, vilket är en föregångare av NF-κB p50 subenhet5. Fosforylering inducerad ubikvitinering och proteasomen nedbrytning av IκB (eller bearbetning av p105) leder till frigörande och aktivering av en specifik uppsättning av NF-κB dimerer15. Avvikande NF-κB aktivitet på grund av mis reglerad funktion av IKK2 har observerats i många cancerformer samt som autoimmuna sjukdomar2,3,16.
I motsats till IKK2/β reglerar aktiviteten av IKK1/α NF-κB signalering av icke-kanoniska väg, vilket är nödvändigt för utveckling och immunitet. IKK1 phosphorylates specifika rester av NF-κB2/p100 på sitt C-terminal IκBδ segment, vilket leder till dess bearbetning och generering av p52. Bildandet av transcriptionally aktiva p52:RelB heterodimer initierar en långsam och ihållande svar till utvecklingsmässiga signaler7,17,18,19,20. Intressant, är generering av den centrala NF-κB faktor p52 av denna väg kritiskt beroende av en annan faktor, NF-κB inducerande Kinase (NIK)21,22, men inte på IKK2 eller NEMO. I vilande celler, NIK är fortsatt låg på grund av dess konstant proteasom-beroende nedbrytning23,24,25. Vid stimulering av celler av 'icke-kanoniska' ligander och i vissa maligna celler, NIK blir stabiliserad för att rekrytera och aktivera IKK1 / α. Kinas verksamheter av både NIK och IKK1 är avgörande för effektiv bearbetning av p100 till p527. IKK1 och NIK fosforylera tre serines (Ser866, 870 och 872) av NF-κB2/p100 på sitt C-terminal IκBδ segment leder till dess bearbetning och generering av p52. Avvikande aktivering av den icke-kanoniska vägen har varit inblandad i många maligniteter inklusive multipelt myelom26,27,28.
Flera mycket effektiv och specifika hämmare för IKK2/β är kända, även om ingen har hittills visat sig vara ett effektivt läkemedel. Däremot är IKK1/α-specifika hämmare gles. Detta kan bero dels från vår brist på strukturella och biokemiska information på IKK1/α, som begränsar vår förståelse av den mekanistiska grunden för aktivering av NF-κB av IKK1 i celler och rationell läkemedelsdesign. Röntga strukturerar av IKK2/β gett oss insikter om aktiveringsmekanismen av IKK2/β29; dessa strukturer kan dock inte avslöja hur olika uppströms stimuli utlösa aktivering av IKK1/α eller IKK2/β för att reglera olika uppsättningar av NF-κB verksamhet 30,31. Att förstå den mekanistiska grunden underliggande funktionen distinct signalering av IKK1/α, och att inrätta en plattform för rationell läkemedelsdesign, fokuserade vi på att bestämma strukturen av IKK1/α.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cellfectin/Cellfectin II</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10362100</td>
			<td>Cellfectin is now discontinued, replaced by Cellfectin II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf900 III Insect cell medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12658-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SF9 cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12659017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-IKK1 antibody</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB100-56704</td>
			<td>Previously sold by Imgenex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PentaHis antibody</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>34460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>Nitrocellulose can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford assay reagent</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>500001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28989335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon concentrator</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC801008, UFC803008, UFC201024, UFC203024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound A</td>
			<td>Bayer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calbiochem IKK-inhibitor XII</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>401491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staurosporine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>S4400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLN120B</td>
			<td>Millenium</td>
			<td>Gift item</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPPNP</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A2647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulfate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>51227, 42867, 31404,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulfate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>93593, 81210, 88276, 95904, 81255, 89510, 92897, 81285, 95172</td>
			<td>Some of them are new Cat # on SIGMA catalogue. What we had was originally from Fluka that had different Cat #.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystallization Screens</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Screen I and II (Crystal Screen HT)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index HT</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG/Ion and PEG/Ion2 (PEG/Ion HT)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEGRX 1 and PEGRx 2 (PEGRx HT)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SaltRx 1 and SaltRx 2 (SaltRx HT)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal mounts</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR8-188, 190, 192, 194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synchrotron</td>
			<td>The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy&#8217;s Argonne National Laboratory</td>
			<td>Beamline 19 ID</td>
			<td>The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy&#8217;s Argonne National Laboratory provides ultra-bright, high-energy storage ring-generated X-ray beams for research in almost all scientific disciplines.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a guide to production, crystallization, and structure determination of human ikk1/&#945;

En klass av extracellulära stimuli kräver aktivering av IKK1/α att inducera generation av en NF-κB subenhet, p52, genom bearbetning av dess föregångare p100. P52 fungerar som en homodimer eller en heterodimer med en annan NF-κB subenhet, RelB. Dessa dimerer reglerar i sin tur uttrycket av hundratals gener involverade i inflammation, cellöverlevnad och cellcykeln. IKK1/α återstår primärt associerade med IKK2/β och NEMO som en ternär komplex. Dock har en liten pool av det också observerats som en låg molekylvikt complex(es). Det är okänt om p100 bearbetning aktiviteten utlöses av aktivering av IKK1/α inom den större eller mindre komplexa poolen. Konstituerande aktiviteten av IKK1/α har upptäckts i flera cancer och inflammatoriska sjukdomar. För att förstå mekanismen för aktivering av IKK1/α och aktivera dess användning som drog mål, vi uttryckte rekombinant IKK1/α i olika värdsystem, exempelvis E. coli, insekt, och däggdjursceller. Vi lyckats uttrycka lösliga IKK1/α i baculoviridae infekterade insekt celler, att erhålla mg mängder mycket rent protein, utkristalliseras det i närvaro av hämmare och bestämma dess röntgen kristallstruktur. Här beskriver vi de detaljerade anvisningarna för att producera rekombinant protein, dess kristallisering och dess röntgen kristall struktur beslutsamhet.

Kloning och uttryck för olika konstruktioner av IKK1/α Full längd mänskliga IKK1/α var klonade in i baculoviridae uttryck vektor pFastBacHTa inom dess mina och NotI begränsning platser att erhålla en N-terminal hexa-histidin märkta IKK1. Etiketten kan avlägsnas genom TEV proteas matsmältningen. Eftersom full längd IKK1/α innehåller flexibla regioner i båda ändarna, och flexibla regioner brukar göra ett protein svårt att kristallisera, klonade vi olika ...

Watch this Scientific Journal Video about A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/ÃŽÂ± at JoVE.com

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

IκB Kinase 1/α (IKK1/α CHUK) är en Ser/Thr proteinkinas som är inblandad i en myriad av cellulära aktiviteter främst genom aktivering av NF-κB transkriptionsfaktorer. Här beskriver vi de viktigaste stegen som krävs för produktion och crystal strukturbestämning av detta protein.

En Guide till produktion, kristallisering och strukturbestämning av mänskliga IKK1/α

A class of extracellular stimuli requires activation of IKK1/&#945; to induce generation of an NF-&#954;B subunit, p52, through processing of its ...

Målet med detta förfarande är att ge vägledning för produktion, kristallisering och strukturell bestämning av mänskliga IKK1-alfa för att förstå den mekanistiska grunden för dess signaleringsfunktion och att upprätta plattformar för rationell läkemedelsdesign. Denna metod bör hjälpa forskare att fastställa strukturen för IKK1, vilket skulle ge svar på viktiga frågor inom området immunsignalering. Denna teknik beskriver en strömlinjeformad väg till att erhålla kristaller av IKK-proteiner, som är ganska eldfasta till kristallisering och att ge olika kritisk information för att övervinna flaskhalsar vid fastställandet av strukturerna.Generellt, individer nya till denna metod kommer att kämpa, eftersom generera milligram mängder lösliga, väluppfostrat protein, kräver sitt uttryck i insektsceller, och kristallisering kan göras under endast ett mycket smalt fönster av villkor. Det molekylära ersättningsförfarandet som används vid bestämningen av strukturen för IKK1 kan också vara mycket knepigt, särskilt på grund av dålig avböjningsegenskap hos kristallerna, inte på platsen för den asymmetriska enheten som innehåller många IKK1-molekyler i avsaknad av lämpliga sökmodeller. Demonstrera förfarandena kommer att Kyle Shumate och Sonjiala Hotchkiss, studenter från mitt laboratorium.På dag ett, tallrik Sf9 celler i två milliliter av Sf903 insektscell medium, i varje brunn av en sex-brunn tallrik och inkubera vid 27 grader Celsius. Passage cellerna när de når en densitet av två till tre gånger 10 till de sex cellerna per milliliter i suspension genom att späda ut den till färska medier, med en densitet av cirka sex gånger 10 till fem. På dag två, späd åtta mikroliter av Sf9 transfection reagens i 100 mikroliter av SF-903 eller Grace's Insect Medium.Då virvel blandningen kort. I ett separat rör, späd ett mikrogram kit-renad rekombinant bacmid i 100 mikroliter av samma medium. Kombinera det utspädda DNA- och transfektionsreagensen.Efter inkubering i rumstemperatur i 15 till 30 minuter, ta bort mediet från brunnen. Tillsätt sedan en milliliter färskt medium. Därefter tillsätt den utspädda DNA-transfektionsreagensblandningen droppvis på cellerna, justera droppstorleken så att den inte rubbar vidhäftande celler.Efter sex timmar, tillsätt 1,5 milliliter färskt medium ovanpå cellerna. Inkubera cellerna vid 27 grader Celsius, kontrollera brunnarna regelbundet var 12 timmar för tecken på virusinfektion. På dag fem, ta bort mediet som innehåller celler, 60 till 72 timmar efter infektion.Efter överföring av mediet i rör, centrifug i fem minuter vid 500 gånger g och fyra grader Celsius. När du är klar, spara supernatanten, som är P1-virusstacken. På dag ett, resuspend den tidigare beredda His-IKK1 cell pellet i 40 milliliter av lysbuffert.Placera cellen suspension på is och lysa cellerna genom ultraljudsbehandling på 60%till 70%tull cykler och fem till 10 pulser på 30-sekunders varaktighet med ett intervall större än en minut. Klargöra lysate genom centrifugeringen vid större än eller lika med 28, 000 g i 45 minuter vid fyra grader Celsius. Efter att ha förberett en Nickel-NTA Agarose harts, enligt textprotokollet, elute den Hans-taggade IKK1 alfa protein under gravitationen flöde med 20 milliliter eluering buffert.Samla en till 1,5 milliliter fraktioner. Efter att ha kombinerat de fraktioner som innehåller proteinet, smälta provet med TEV proteas över natten vid fyra grader Celsius. På morgonen dag två, inkubera proteinet med en millimolar av ATP, i närvaro av magnesiumklorid, beta-glycerofosfat, natriumfluorid och natrium ortovanadate i en timme vid 27 grader Celsius.Efter inkubation, filtrera proteinlösningen genom ett 0,45 mikronfilter. Sedan lasta cirka sex milliliter av provet på en 120 milliliter preparativ storlek-uteslutning kolumn, fäst vid en automatiserad vätskekromatografi system. Efter jämvikt, kör storleken-exclusion kromatografi med en flödeshastighet på en milliliter per minut och samla två-milliliter fraktioner.Under körningen, övervaka eluering vid 280 och 254 nanometer. Efter att ha dragit de rena fraktionerna, koncentrera dig i en 30-kilodalton, molekylvikt cut-off centrifugalkoncentrator, efter tillverkarens instruktioner. Sedan dispensera 25-mikroliter alikvoter av det koncentrerade proteinet och flash-freeze i flytande kväve.Med hjälp av en robot, pipetter 80 till 100 mikroliter av en kristallisering reagens i reservoaren av en 96-brunns platta. Med hjälp av en kristalliseringsrobot, dispensera och blanda 0,2 till 0,25 mikroliter av IKK1 och dess hämmarkomplex med samma volym reservoarlösning. Omedelbart efter inställning av dropparna, försegla varje platta med optiskt tydliga filmer för att undvika avdunstning.Inkubera en platta vid 18 grader Celsius och den andra plattan vid fyra grader Celsius i ett kallt rum. Använd ett stereomikroskop med en polarisator för att kontrollera om det finns kristall i varje droppe, varje dag, under de första sju dagarna och sedan med längre intervall. Efter att ha förberett IKK1 och dess inhibitorkomplex som tidigare beskrivits, överför du brunnslösningarna till varje brunn av en 24-brunnsplatta.Placera en till 1,5 mikroliter av väl lösning på en ren glasöverdrag. Tillsätt en lika stor volym av IKK1 och dess hämmarkomplex till glasöverdrag och blanda försiktigt genom pipettering upp och ner tre till fyra gånger. Efter applicering av fett på ringarna i varje brunn av plattan, vänd glaset täck över och placera på respektive brunn med tutens.Sedan försegla brunnen genom att trycka ner på glaset täck. Efter att ha satt upp alla droppar i 24-brunnsplattan, inkubera i kylrummet, i mörkret. Ibland kontrollera dropparna under ett mikroskop för utseende och tillväxt av kristaller.När kristalltillväxten är klar tar du försiktigt bort glaskåpan som innehåller kristallen och placerar den på en fast yta med kristalldropin uppåt. Tillsätt försiktigt 10 mikroliter kryo A-lösning ovanpå droppen och blanda försiktigt genom pipettering så att kristallen inte vidrörs. Med hjälp av ett mikroskop, långsamt ta bort lite vätska från kristallen och hålla cirka fem till åtta mikroliter av lösningen.Tillsätt försiktigt 2,5 till fyra mikroliter kryo B-lösning på droppen och blanda försiktigt genom pipettering. Täck glaset coverslip med en liten Petrie skålen för att undvika direkt luftflöde över kristallen. Efter att ha väntat fem minuter, välj försiktigt en enda kristall från droppen i en lämplig kryoby monterad på en ordentlig bas.Flash-frysa kristallen i flytande kväve. Förvara sedan kristallen som innehåller kryoby i en puck nedsänkt i flytande kväve i en Dewar-kolv tills den är redo för röntgendiffraktion vid synkrotronen. Efter omfattande försök med flera olika IKK1-varianter erhölls kristaller med en stympad konstruktör, som visade lämpliga röntgenegenskaper endast i närvaro av IKK-hämmaren XII.Den kombinerade effekten av röntgendata med lågupplösning med svag intensitet, ett stort antal IKK1-molekyler i den asymmetriska enheten och konformationsvariationen av IKK1 monomerisk-dimerisk modell, jämfört med kända IKK2-modeller, gjorde det svårt att få tag på en molekylär ersättningslösning, IKK1, och bestämma dess struktur. Olika IKK2-strukturer indikerade olika intermonomerorientering inom dess dimers så att avståndet mellan alfakolerna i P578 i de två kinasdomänerna, i fyra olika dimermodeller, varierade mellan 39 och 61 ångström. Att få en användbar sökmodell var möjligt på grund av den lågupplösta kryoelektronmikroskopikartan och en högnoggrann modell av IKK1-domäner som kunde genereras baserat på en högupplöst IKK2-struktur.Den ursprungliga modellen anges en orientering av Kinas domän roteras 24 grader i förhållande till en IKK2 monomer och en N-terminal öppning av 58 ångström. Med hjälp av en av dimers med 52-ångströmsöppningen som modell, var sex dimers i den asymmetriska enheten belägna. När behärskar, kan denna teknik utföras i ett par månader, om det utförs på rätt sätt.Medan du försöker detta förfarande, Det är viktigt att komma ihåg att erhållandet av en löslig, aktiv och väluppfostrad protein är det första kritiska steget. Efter att ha sett den här videon, bör du ha en god allmän förståelse för alla de steg som måste följas i noggranna detaljer, för att vara framgångsrik i kristallisera och bestämma strukturen av IKK1 protein. Att lära sig detta förfarande, det finns fortfarande strukturer av andra IKK familj proteiner som också kan fastställas för att svara på ytterligare frågor om kinas-mitogen signalering.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/&#945;

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, rening och kristallisation av den mänskliga Serotonin Transporter Bound till<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Combining Wet and Dry Lab Techniques to Guide the Crystallization of Large Coiled-coil Containing Proteins

Kombinera våta och torra Lab Tekniker Guide kristallisation av stora coiled-coil proteiner

Obtaining crystals for structure determination can be a difficult and time consuming proposition for any protein. Coiled-coil proteins and domains are ...

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Produktion, Kristallisering och strukturbestämning av<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-en via Microseeding och zink-SAD

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

Hög precision FRET vid en-molekylnivå för biomolekylstrukturbestämning

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO

Produktion, kristallisering och strukturbestämning av IKK-bindande domän för NEMO

NEMO is a scaffolding protein which plays an essential role in the NF-&#954;B pathway by assembling the IKK-complex with the kinases IKK&#945; and ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

Kristallisering och strukturell bestämning av ett enzym:Substratkomplex genom seriell kristallografi i ett mångsidigt mikrofluidiskt chip

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

The Extraction of Liver Glycogen Molecules for Glycogen Structure Determination

Liver glycogen is a hyperbranched glucose polymer that is involved in the maintenance of blood sugar levels in animals. The properties of glycogen are ...

Efficient and Scalable Production of Full-length Human Huntingtin Variants in Mammalian Cells using a Transient Expression System

Full-length huntingtin (FL HTT) is a large (aa 1-3,144), ubiquitously expressed, polyglutamine (polyQ)-containing protein with a mass of approximately 350 ...

High-Throughput Screening for Protein Crystallization

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography (Video) | JoVE 

High-throughput screening för att erhålla kristallträffar för proteinkristallografi

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into ...

A Fibrinolytic Enzyme-Based Method to Study Cerebral Thrombus Cell Components

A Comprehensive Approach to Analyze the Cell Components of Cerebral Blood Clots

A Novel Method for Comprehensive Cell Component Analysis of Cerebral Blood Clots (Video) | JoVE

Ett omfattande tillvägagångssätt för att analysera cellkomponenterna i cerebrala blodproppar

Cerebral thrombosis, a blood clot in a cerebral artery or vein, is the most common type of cerebral infarction. The study of the cell components of ...