Name: a guide to production, crystallization, and structure determination of human ikk1/&#945;
Uploaded: 2018-11-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/ÃŽÂ± at JoVE.com

Personel beamlines 19ID, 24ID ve 13ID kaynağında Gelişmiş foton, Lemont, IL, çeşitli kristalleri veri toplama sırasında destek için teşekkür ediyoruz. Düşük çözünürlüklü cryo-EM harita EM harita/bina, ilk IKK1 moleküler yerine arama model oluşturmak için kullanılan modeli erken aşamalarında bize alma için Dmitry Lyumkis, Salk Enstitüsü için minnettarız. Bu sonuçlar için önde gelen araştırma gelen NIH hibe AI064326, CA141722 ve GM071862 GG için fon aldı. SP Şu anda bir hoş geldiniz güven DBT Hindistan ara biri.

1. rekombinant virüs IKK1/α büyük ölçekli ifade için uygun hazırlanması
<ol><li>
P1 virüs hazırlık 32<ol>
<li>1. gün: Plaka Sf9 hücreleri (~ 6 10 X5) (geçiş sayısı az 10) 2 ml Sf900 III böcek cep orta her iyi bir 6-şey tabak ve 27 ° C'de kuluçkaya Geçiş hücreleri mL süspansiyon başına 2-3 X 106 hücre yoğunluğu ~ 6 X 10 yoğunluğu, taze medya içine sulandrarak ulaştığınızda5.</li>
		<li>2. gün: Sf9-transfecti...

<ol>
	<li>Xia, Y., Shen, S., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB,+an+active+player+in+human+cancers.">NF-kappaB, an active player in human cancers.</a> Cancer immunology research. 2 (9), 823-830 (2014).</li><li>Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity,+inflammation,+and+cancer.">Immunity, inflammation, and cancer.</a> Cell. 140 (6), 883-899 (2010).</li><li>Ben-Neriah, Y., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+meets+cancer,+with+NF-kappaB+as+the+matchmaker.">Inflammation meets cancer, with NF-kappaB as the matchmaker.</a> Nature immunology. 12 (8), 715-723 (2011).</li><li>Hinz, M., Scheidereit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IkappaB+kinase+complex+in+NF-kappaB+regulation+and+beyond.">The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond.</a> EMBO reports. 15 (1), 46-61 (2014).</li><li>Karin, M., Ben-Neriah, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+meets+ubiquitination:+the+control+of+NF-[kappa]B+activity.">Phosphorylation meets ubiquitination: the control of NF-[kappa]B activity.</a> Annu Rev Immunol. 18, 621-663 (2000).</li><li>Ghosh, S., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Missing+pieces+in+the+NF-kappaB+puzzle.">Missing pieces in the NF-kappaB puzzle.</a> Cell. 109, S81-S96 (2002).</li><li>Sun, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+noncanonical+NF-kappaB+pathway.">The noncanonical NF-kappaB pathway.</a> Immunol Rev. 246 (1), 125-140 (2012).</li><li>Bonizzi, G., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+NF-kappaB+activation+pathways+and+their+role+in+innate+and+adaptive+immunity.">The two NF-kappaB activation pathways and their role in innate and adaptive immunity.</a> Trends Immunol. 25 (6), 280-288 (2004).</li><li>DiDonato, J. A., Hayakawa, M., Rothwarf, D. M., Zandi, E., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cytokine-responsive+IkappaB+kinase+that+activates+the+transcription+factor+NF-kappaB.">A cytokine-responsive IkappaB kinase that activates the transcription factor NF-kappaB.</a> Nature. 388 (6642), 548-554 (1997).</li><li>Werner, S. L., Barken, D., Hoffmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulus+specificity+of+gene+expression+programs+determined+by+temporal+control+of+IKK+activity.">Stimulus specificity of gene expression programs determined by temporal control of IKK activity.</a> Science. 309 (5742), 1857-1861 (2005).</li><li>Zandi, E., Rothwarf, D. M., Delhase, M., Hayakawa, M., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IkappaB+kinase+complex+(IKK)+contains+two+kinase+subunits,+IKKalpha+and+IKKbeta,+necessary+for+IkappaB+phosphorylation+and+NF-kappaB+activation.">The IkappaB kinase complex (IKK) contains two kinase subunits, IKKalpha and IKKbeta, necessary for IkappaB phosphorylation and NF-kappaB activation.</a> Cell. 91 (2), 243-252 (1997).</li><li>Rothwarf, D. M., Zandi, E., Natoli, G., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IKK-gamma+is+an+essential+regulatory+subunit+of+the+IkappaB+kinase+complex.">IKK-gamma is an essential regulatory subunit of the IkappaB kinase complex.</a> Nature. 395 (6699), 297-300 (1998).</li><li>Yamaoka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementation+cloning+of+NEMO,+a+component+of+the+IkappaB+kinase+complex+essential+for+NF-kappaB+activation.">Complementation cloning of NEMO, a component of the IkappaB kinase complex essential for NF-kappaB activation.</a> Cell. 93 (7), 1231-1240 (1998).</li><li>Li, Z. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IKKbeta+subunit+of+IkappaB+kinase+(IKK)+is+essential+for+nuclear+factor+kappaB+activation+and+prevention+of+apoptosis.">The IKKbeta subunit of IkappaB kinase (IKK) is essential for nuclear factor kappaB activation and prevention of apoptosis.</a> J Exp Med. 189 (11), 1839-1845 (1999).</li><li>Hayden, M. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shared+principles+in+NF-kappaB+signaling.">Shared principles in NF-kappaB signaling.</a> Cell. 132 (3), 344-362 (2008).</li><li>Sun, S. C., Chang, J. H., Jin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+nuclear+factor-kappaB+in+autoimmunity.">Regulation of nuclear factor-kappaB in autoimmunity.</a> Trends Immunol. 34 (6), 282-289 (2013).</li><li>Claudio, E., Brown, K., Park, S., Wang, H., Siebenlist, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAFF-induced+NEMO-independent+processing+of+NF-kappa+B2+in+maturing+B+cells.">BAFF-induced NEMO-independent processing of NF-kappa B2 in maturing B cells.</a> Nat Immunol. 3 (10), 958-965 (2002).</li><li>Senftleben, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+by+IKKalpha+of+a+second,+evolutionary+conserved,+NF-kappa+B+signaling+pathway.">Activation by IKKalpha of a second, evolutionary conserved, NF-kappa B signaling pathway.</a> Science. 293 (5534), 1495-1499 (2001).</li><li>Coope, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40+regulates+the+processing+of+NF-kappaB2+p100+to+p52.">CD40 regulates the processing of NF-kappaB2 p100 to p52.</a> EMBO J. 21 (20), 5375-5385 (2002).</li><li>Dejardin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lymphotoxin-beta+receptor+induces+different+patterns+of+gene+expression+via+two+NF-kappaB+pathways.">The lymphotoxin-beta receptor induces different patterns of gene expression via two NF-kappaB pathways.</a> Immunity. 17 (4), 525-535 (2002).</li><li>Xiao, G., Fong, A., Sun, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+p100+processing+by+NF-kappaB-inducing+kinase+involves+docking+IkappaB+kinase+alpha+(IKKalpha)+to+p100+and+IKKalpha-mediated+phosphorylation.">Induction of p100 processing by NF-kappaB-inducing kinase involves docking IkappaB kinase alpha (IKKalpha) to p100 and IKKalpha-mediated phosphorylation.</a> The Journal of biological chemistry. 279 (29), 30099-30105 (2004).</li><li>Xiao, G., Harhaj, E. W., Sun, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB-inducing+kinase+regulates+the+processing+of+NF-kappaB2+p100.">NF-kappaB-inducing kinase regulates the processing of NF-kappaB2 p100.</a> Molecular cell. 7 (2), 401-409 (2001).</li><li>Qing, G., Qu, Z., Xiao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+basally+translated+NF-kappaB-inducing+kinase+(NIK)+protein+functions+as+a+molecular+switch+of+processing+of+NF-kappaB2+p100.">Stabilization of basally translated NF-kappaB-inducing kinase (NIK) protein functions as a molecular switch of processing of NF-kappaB2 p100.</a> J Biol Chem. 280 (49), 40578-40582 (2005).</li><li>Zarnegar, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncanonical+NF-kappaB+activation+requires+coordinated+assembly+of+a+regulatory+complex+of+the+adaptors+cIAP1,+cIAP2,+TRAF2+and+TRAF3+and+the+kinase+NIK.">Noncanonical NF-kappaB activation requires coordinated assembly of a regulatory complex of the adaptors cIAP1, cIAP2, TRAF2 and TRAF3 and the kinase NIK.</a> Nat Immunol. 9 (12), 1371-1378 (2008).</li><li>Vallabhapurapu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonredundant+and+complementary+functions+of+TRAF2+and+TRAF3+in+a+ubiquitination+cascade+that+activates+NIK-dependent+alternative+NF-kappaB+signaling.">Nonredundant and complementary functions of TRAF2 and TRAF3 in a ubiquitination cascade that activates NIK-dependent alternative NF-kappaB signaling.</a> Nat Immunol. 9 (12), 1364-1370 (2008).</li><li>Annunziata, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequent+engagement+of+the+classical+and+alternative+NF-kappaB+pathways+by+diverse+genetic+abnormalities+in+multiple+myeloma.">Frequent engagement of the classical and alternative NF-kappaB pathways by diverse genetic abnormalities in multiple myeloma.</a> Cancer cell. 12 (2), 115-130 (2007).</li><li>Keats, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promiscuous+mutations+activate+the+noncanonical+NF-kappaB+pathway+in+multiple+myeloma.">Promiscuous mutations activate the noncanonical NF-kappaB pathway in multiple myeloma.</a> Cancer cell. 12 (2), 131-144 (2007).</li><li>Staudt, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+activation+of+NF-kappaB.">Oncogenic activation of NF-kappaB.</a> Cold Spring Harbor perspectives in biology. 2 (6), a000109 (2010).</li><li>Polley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structural+basis+for+IkappaB+kinase+2+activation+via+oligomerization-dependent+trans+auto-phosphorylation.">A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation.</a> PLoS Biol. 11 (6), e1001581 (2013).</li><li>Hinz, M., Scheidereit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IkappaB+kinase+complex+in+NF-kappaB+regulation+and+beyond.">The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond.</a> EMBO Rep. 15 (1), 46-61 (2014).</li><li>Scheidereit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IkappaB+kinase+complexes:+gateways+to+NF-kappaB+activation+and+transcription.">IkappaB kinase complexes: gateways to NF-kappaB activation and transcription.</a> Oncogene. 25 (51), 6685-6705 (2006).</li><li>Luckow, V. A., Lee, S. C., Barry, G. F., Olins, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+infectious+recombinant+baculoviruses+by+site-specific+transposon-mediated+insertion+of+foreign+genes+into+a+baculovirus+genome+propagated+in+Escherichia+coli.">Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli.</a> J Virol. 67 (8), 4566-4579 (1993).</li><li>Polley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Basis+for+the+Activation+of+IKK1/alpha.">Structural Basis for the Activation of IKK1/alpha.</a> Cell reports. 17 (8), 1907-1914 (2016).</li><li>Otwinowski, Z. a. M., W, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+X-ray+Diffraction+Data+Collected+in+Oscillation+Mode.">Processing of X-ray Diffraction Data Collected in Oscillation Mode.</a> Methods in Enzymology. 276 (Macromolecular Crystallography, part A), 307-326 (1997).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+human+IkappaB+kinase+beta+asymmetric+dimer.">Crystal structure of a human IkappaB kinase beta asymmetric dimer.</a> J Biol Chem. 288 (31), 22758-22767 (2013).</li><li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+development+of+Coot.">Features and development of Coot.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).</li><li>McCoy, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phaser+crystallographic+software.">Phaser crystallographic software.</a> Journal of applied crystallography. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).</li><li>Vagin, A. T., Teplyakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MOLREP:+an+automated+program+for+molecular+replacement.">MOLREP: an automated program for molecular replacement.</a> J. Appl. Cryst. 30, 1022-1025 (1997).</li><li>Brunger, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Version+1.2+of+the+Crystallography+and+NMR+system.">Version 1.2 of the Crystallography and NMR system.</a> Nature protocols. 2 (11), 2728-2733 (2007).</li><li>Brunger, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallography+&amp;+NMR+system:+A+new+software+suite+for+macromolecular+structure+determination.">Crystallography &amp; NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological. 54 (Pt 5), 905-921 (1998).</li><li>McRee, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XtalView:+a+visual+protein+crystallographic+software+system+for+X11/Xview.">XtalView: a visual protein crystallographic software system for X11/Xview.</a> J. Mol Graph. 10, 44-47 (1992).</li><li>Schroder, G. F., Levitt, M., Brunger, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+biomolecular+crystallography+with+low-resolution+data.">Super-resolution biomolecular crystallography with low-resolution data.</a> Nature. 464 (7292), 1218-1222 (2010).</li><li>Polley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structural+basis+for+IkappaB+kinase+2+activation+via+oligomerization-dependent+trans+auto-phosphorylation.">A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation.</a> PLoS biology. 11 (6), e1001581 (2013).</li><li>Christopher, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+discovery+of+2-amino-3,5-diarylbenzamide+inhibitors+of+IKK-alpha+and+IKK-beta+kinases.">The discovery of 2-amino-3,5-diarylbenzamide inhibitors of IKK-alpha and IKK-beta kinases.</a> Bioorganic &amp; medicinal chemistry letters. 17 (14), 3972-3977 (2007).</li><li>Karplus, P. A., Diederichs, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+crystallographic+model+and+data+quality.">Linking crystallographic model and data quality.</a> Science. 336 (6084), 1030-1033 (2012).</li><li>Chen, V. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MolProbity:+all-atom+structure+validation+for+macromolecular+crystallography.">MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 1), 12-21 (2010).</li></ol>

Üretim, kristalizasyon ve yapı çözüm iki ilgili IKK proteinlerin Biz IKK1/α X-ray kristal yapısı deneyimlerimiz IKK2/β protein üretim, kristalizasyon ve yapı belirlenmesi ile verilen nispeten basit bir egzersiz olacaktır kavramı ile belirlemek için yola çıktı. Ancak, biz bu iki ilgili proteinler kristalizasyon kolaylığı ile ilgili çok farklı davrandığını çok şaşırdık. Birkaç yüksek profilli laboratuvarları çabalarına rağmen yaklaşık yirmi IKK1 yapı tayini aldı....

Transkripsiyon dimerik transkripsiyon faktörleri NF-κB ailesinin faaliyetlerinin inflamasyon ve bağışıklık yaşam ve ölüm arasında değişen çeşitli hücresel fonksiyonları için gereklidir. Bu etkinlikler hücrelerinde ve otoimmün hastalıklar ve kanser1,2,3dahil olmak üzere çeşitli patolojik koşullar yönetmelik yol açar bir kayıp sıkı kontrol edilir. Bir uyarıcı yokluğunda, NF-κB faaliyetlerinin IκB (inhibitörü - κB olan) proteinler4tarafından Inhibe tutulur. IκB protein üzerinde belirli Ser kalıntılarının fosforilasyon bunları ubiquitination ve sonraki proteasomal bozulma ya da seçici işleme5için işaretler. İki son derece homolog Ser/Thr kinaz, IKK2/β ve IKK1/α, NF-κB aktiviteleri merkezi düzenleyiciler Bu fosforilasyon olaylar6,7taşıyarak hareket.
Bir ligand ve bir reseptör arasındaki etkileşimler arabulucu NF-κB faktörleri harekete geçirmek için önde gelen bir dizi sinyal transduces. NF-κB sinyal verme işlemi genel olarak iki farklı yolları-kurallı ve kanonik olmayan (alternatif)8sınıflandırılabilir. IKK2/β etkinliği öncelikle iltihaplı ve doğuştan gelen bağışıklık yanıtı9için esastır kurallı yolun NF-κB sinyal düzenlemektedir. IKK2/β10 içinde şimdiye kadar biyokimyasal olarak uncharacterized IKK karmaşık bir hızlı ve kısa ömürlü aktivasyon ayrı özelliğidir bu yolu — IKK1 ve IKK2 yanı sıra düzenleyici bir bileşeni, NEMO (NF-κB temel modülatör oluşan olduğu tahmin )11,12,13. İki katalitik IKK alt birimleri IKK kompleks arasında IKK2 için NF-κB ve aynı zamanda atipik bir IκB protein bağlı öncelikle sorumlu14 için prototip IκBs (α, - β ve - γ) belirli kalıntılarının fosforilasyon olduğunu NF-κB1/olan p105, bir NF-κB p50 alt birim5habercisi. Fosforilasyon ubiquitination indüklenen ve proteasomal bozulma IκB (veya p105 işlenmesi), yayın ve NF-κB dimer15belirli bir kümesi aktivasyonu yol açar. Anormal NF-κB etkinliği IKK2 yanlış düzenlenmiş fonksiyonu nedeniyle birçok kanserleri de olduğu gibi otoimmün hastalıklar2,3,16gözlenmiştir.
IKK2/β aksine, temel geliştirme ve dokunulmazlık için kanonik olmayan yolun NF-κB sinyal IKK1/α etkinlik düzenlemektedir. IKK1 NF-κB2/p100 belirli artıkları, işleme ve p52 nesil yol açar, C-terminal IκBδ kesimindeki phosphorylates. Transcriptionally etkin p52:RelB heterodimerdir oluşumu gelişimsel sinyalleri7,17,18,19,20yavaş ve sürekli yanıt başlatır. İlginçtir, merkezi NF-κB faktör p52 döngüsünün bu nesil eleştirel bir başka faktör, NF-κB Inducing kinaz (NIK)21,22, ama değil IKK2 veya NEMO bağlıdır. Resting hücrelerde, NIK düzeyini nedeniyle onun sürekli proteasome bağlı bozulma23,24,25düşük seviyede kalır. Hücreleri tarafından 'kanonik olmayan' ligandlar ve bazı kötü huylu hücrelerin uyarılması, NIK ve IKK1 etkinleştirmek için stabilize olur / α. kinaz faaliyetleri NIK ve IKK1 verimli p100 p527içine işleme için gereklidir. IKK1 ve NIK işleme ve p52 üretimi için önde gelen onun C-terminal IκBδ kesimi üzerindeki üç serines (Ser866, 870 ve 872) NF-κB2/p100 fazdan. Kanonik olmayan aktivasyonu anormal multipl miyelom26,27,28de dahil olmak üzere birçok maligniteler karıştığı olmuştur.
Hiçbiri bu kadar etkili bir ilaç olduğunu kanıtladı, ancak birkaç son derece verimli ve belirli inhibitörleri IKK2/β için bilinir. Buna ek olarak, IKK1/α-özel inhibitörleri seyrek. Bu kısmen yapısal ve biyokimyasal bilgilerini NF-κB IKK1 hücreleri ve akılcı ilaç tasarım tarafından aktivasyonu mekanik temeli anlayışımız sınırlar IKK1/α üzerinde bizim eksikliği kaynaklanıyor. IKK2/β X-ray yapılarının IKK2/β29etkinleştirme mekanizması anlayışlar sağladı; Ancak, bu yapıların ne kadar farklı ters yönde uyaranlara açığa olabilir değil tetiklemek harekete geçirmek IKK1/α veya IKK2/β NF-κB faaliyetleri 30,31farklı kümeleri düzenleyecek. IKK1/α farklı sinyal verme işlevi temel mekanik olarak anlamak ve akılcı ilaç tasarımı için bir platform oluşturmak için IKK1/α yapısını belirleme üzerinde duruldu.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cellfectin/Cellfectin II</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10362100</td>
			<td>Cellfectin is now discontinued, replaced by Cellfectin II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf900 III Insect cell medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12658-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SF9 cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12659017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-IKK1 antibody</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB100-56704</td>
			<td>Previously sold by Imgenex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PentaHis antibody</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>34460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>Nitrocellulose can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford assay reagent</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>500001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28989335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon concentrator</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC801008, UFC803008, UFC201024, UFC203024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound A</td>
			<td>Bayer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calbiochem IKK-inhibitor XII</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>401491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staurosporine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>S4400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLN120B</td>
			<td>Millenium</td>
			<td>Gift item</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPPNP</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A2647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulfate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>51227, 42867, 31404,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulfate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>93593, 81210, 88276, 95904, 81255, 89510, 92897, 81285, 95172</td>
			<td>Some of them are new Cat # on SIGMA catalogue. What we had was originally from Fluka that had different Cat #.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystallization Screens</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Screen I and II (Crystal Screen HT)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index HT</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG/Ion and PEG/Ion2 (PEG/Ion HT)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEGRX 1 and PEGRx 2 (PEGRx HT)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SaltRx 1 and SaltRx 2 (SaltRx HT)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal mounts</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR8-188, 190, 192, 194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synchrotron</td>
			<td>The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy&#8217;s Argonne National Laboratory</td>
			<td>Beamline 19 ID</td>
			<td>The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy&#8217;s Argonne National Laboratory provides ultra-bright, high-energy storage ring-generated X-ray beams for research in almost all scientific disciplines.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a guide to production, crystallization, and structure determination of human ikk1/&#945;

Bir sınıf hücre dışı uyaranların bir NF-κB alt birimi, p52, onun öncü p100 işlenmesi yoluyla nesil ikna etmek için IKK1/α aktivasyonu gerektirir. bir homodimer veya başka bir NF-κB alt birimi, RelB ile heterodimerdir P52 görür. Bu dimer sırayla genler inflamasyon, hücre hayatta kalma ve hücre döngüsü dahil yüzlerce ifade düzenler. IKK1/α öncelikle üçlü bir kompleks olarak IKK2/β ve NEMO ile ilişkili olarak kalır. Ancak, küçük bir havuz da düşük molekül ağırlıklı complex(es) görülmektedir. Bilinmeyen mi p100 işleme faaliyet IKK1/α aktivasyonu içinde daha büyük veya daha küçük karmaşık havuzu tarafından tetiklenir. IKK1/α bünye faaliyet çeşitli kanserler ve inflamatuar hastalıklarda algılandı. IKK1/α aktivasyonu mekanizmasını anlamak ve bir uyuşturucu hedef olarak kullanılmasını etkinleştirmek için biz rekombinant IKK1/α E. coligibi farklı ana bilgisayar sistemleri ifade böcek ve memeli hücreleri. Biz başarılı çözünür IKK1/α baculovirus içinde ifade son derece saf protein miktarda mg alma, huzurunda inhibitörleri crystallizing ve x-ışını kristal yapısını belirleme böcek hücreleri enfekte. Burada, Rekombinant protein, onun kristalizasyon ve onun x-ışını kristal yapısı belirlenmesi üretmek için ayrıntılı adımlar açıklanmaktadır.

Klonlama ve ifade IKK1/α farklı yapıları İnsan IKK1/α baculovirus ifade vektör pFastBacHTa bir N-terminal hexa-histidin elde etmek için onun EcoRI ve NotI kısıtlama siteleri içinde içine klonlanmış tam uzunlukta IKK1 etiketli. Etiketi TEV proteaz sindirim tarafından kaldırılmış olabilir. Tam uzunlukta IKK1/α her iki ucundaki esnek bölgeleri içeren ve esnek bölgeler genellikle bir protein kristalize zor render beri IKK1/α pFastBacHTa vektör yuka...

Watch this Scientific Journal Video about A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/ÃŽÂ± at JoVE.com

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

IκB kinaz 1/α (IKK1/α CHUK) hücresel etkinliklerle öncelikle NF-κB transkripsiyon faktörleri aktivasyonu sayısız ilgilenmektedir Ser/Thr protein kinaz olduğunu. Burada, üretim ve kristal yapısı bu protein tayini için gerekli ana adımları açıklar.

Üretim, kristalizasyon ve insan IKK1/α yapı belirlenmesi için bir rehber

A class of extracellular stimuli requires activation of IKK1/&#945; to induce generation of an NF-&#954;B subunit, p52, through processing of its ...

Bu prosedürün amacı, sinyalleme işlevinin mekanistik temelini anlamak ve rasyonel ilaç tasarımı için platformlar oluşturmak için insan IKK1-alfaüretiminin, kristalizasyonunun ve yapısal tayinine rehberlik etmektir. Bu yöntem, araştırmacıların bağışıklık sinyali alanındaki anahtar sorgulara yanıt sağlayacak IKK1'in yapısını belirlemelerine yardımcı olmalıdır. Bu teknik, kristalizasyona karşı oldukça refrakter olan IKK proteinlerinin kristallerini elde etmek ve yapıların belirlenmesinde darboğazların üstesinden gelmek için çeşitli kritik bilgiler sağlamak için düzenli bir yolu tanımlar.Genellikle, bu yönteme yeni bireyler mücadele edecek, çözünür miligram miktarlarda üreten, iyi beslenmiş protein, böcek hücrelerinde ifadesini gerektirir, ve kristalizasyon koşulları sadece çok dar bir pencere altında yapılabilir. IKK1'in yapısının belirlenmesinde kullanılan moleküler değiştirme prosedürü, özellikle uygun arama modelleri yokluğunda birçok IKK1 molekülünü içeren asimetrik ünitenin yerinde değil, kristallerin kötü sapma özelliği nedeniyle çok zor olabilir. Prosedürleri gösteren kyle Shumate ve Sonjiala Hotchkiss, benim laboratuvar öğrencileri olacak.İlk gün, plaka Sf9 hücreleri Sf903 böcek hücre orta iki mililitre, altı kuyuplaka her kuyuda ve 27 santigrat derece kuluçka. Hücreleri, mililitre başına altı hücreye 2-3 çarpı 10'luk bir yoğunluğa ulaştıklarında, süspansiyondaki altı hücreye, taze ortama seyrelterek, yaklaşık altı kat 10 ile beş arasında bir yoğunlukta geçirin. İkinci gün, SF-903 veya Grace's Insect Medium'un 100 mikrolitresinde sekiz mikrolitre Sf9 transfeksiyon reaktifini seyreltin.Sonra kısa bir süre karışımı girdap. Ayrı bir tüpte, aynı ortamda 100 mikrolitre kit-saflaştırılmış rekombinant bakteri bir mikrogram seyreltin. Seyreltilmiş DNA ve transfeksiyon reaktifini birleştirin.15-30 dakika oda sıcaklığında kuluçkadan sonra, kuyudan orta çıkarın. Sonra taze orta bir mililitre ekleyin. Daha sonra, seyreltilmiş DNA transfeksiyon reaktif karışımı damla hücreleri üzerine damla, bu yapışık hücreleri yerinden etmez şekilde damla boyutunu ayarlayarak ekleyin.Altı saat sonra, hücrelerin üstüne taze orta 1,5 mililitre ekleyin. Hücreleri 27 derecede kuluçkaya yatırın, kuyuları periyodik olarak her 12 saatte bir viral enfeksiyon belirtileri için kontrol edin. Beşinci gün, 60 ila 72 saat sonrası enfeksiyon içeren hücreleri kaldırın.Tüpler içine orta transfer sonra, 500 kez g ve dört derece santigrat beş dakika santrifüj. Bittiğinde, P1 virüs yığını olan supernatant kaydedin. İlk gün, daha önce hazırlanmış Olan-IKK1 hücre peletini 40 mililitre lysis tamponu içinde yeniden askıya alın.Hücre süspansiyonunu buza yerleştirin ve bir dakikadan daha uzun bir aralıkla %60 ila %70 görev döngüsü ve 5 ila 10 darbe 30 saniyelik bir süre içinde sonication ile hücreleri lyse. 4 santigrat derecede 45 dakika için 28,000 g'dan daha fazla veya eşit santrifüj ile lysate'yi netleştirin. Bir Nikel-NTA Agarose reçin hazırladıktan sonra, metin protokolüne göre, 20 mililitre elüsyon tamponu kullanarak yerçekimi akışı altında His-tagged IKK1 alfa proteinini eleyin.Bir ila 1,5 mililitre kesirler toplayın. Protein içeren kesirleri birleştirdikten sonra, dört santigrat derece bir gecede TEV proteaz ile örnek sindirmek. İkinci günün sabahında, magnezyum klorür, beta-gliserofosfat, sodyum florür ve sodyum orthovanadate varlığında 27 santigrat derece bir saat boyunca, ATP bir milimolar ile protein kuluçka.Kuluçkadan sonra protein çözeltisini 0,45 mikron filtreden filtreleyin. Daha sonra, otomatik sıvı kromatografi sistemine bağlı 120 mililitrelik preparatif boyut dışlama sütununa numunenin yaklaşık altı mililitresini yükleyin. Equilibration sonra, dakikada bir mililitre akış hızında boyut dışlama kromatografi çalıştırın ve iki mililitre kesirler toplamak.Çalışma sırasında, 280 ve 254 nanometre de elütion izleyin. Saf fraksiyonları çektikten sonra, üreticinin talimatlarına uyarak, 30 kiloluk, moleküler ağırlık kesme santrifüj konsantratörüne konsantre olun. Sonra konsantre protein ve sıvı nitrojen flaş-dondurma 25-mikrolitre aliquots dağıtmak.Bir robot kullanarak, pipet 80 ila 100 mikrolitre bir kristalizasyon reaktifi 96-kuyu plaka rezervuar içine. Bir kristalizasyon robotu kullanarak, 0,2 ila 0,25 mikrolitre IKK1 ve inhibitör kompleksini aynı rezervuar çözeltisi hacmine sahip olarak dağıtın ve karıştırın. Damlaları ayarladıktan hemen sonra, buharlaşmayı önlemek için her plakayı optik olarak temiz filmler ile kapatın.Bir tabağı 18 derecede, diğer tabağı da soğuk bir odada 4 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Her damla kristal görünümünü kontrol etmek için bir polarize ile bir stereo mikroskop kullanın, her gün, ilk yedi gün ve daha sonra daha uzun aralıklarla. IKK1 ve inhibitör kompleksini daha önce açıklandığı gibi hazırladıktan sonra kuyu çözümlerini 24 kuyulu bir plakanın her kuyuya aktarın.Temiz bir cam kapak üzerine 1 ila 1,5 mikrolitre kuyu çözeltisi yerleştirin. Cam kapak kaymasına eşit hacimli IKK1 ve inhibitör kompleksini ekleyin ve üç ila dört kez yukarı ve aşağı borular oluşturarak hafifçe karıştırın. Plakanın her kuyunun halkalarına gres uyguladıktan sonra, cam kapağını ters çevirin ve ilgili kuyuya forceplerle yerleştirin.Daha sonra cam kapak üzerine bastırarak kuyuyu kapatın. 24 kuyulu tabaktaki tüm damlaları ayarladıktan sonra, soğuk odada, karanlıkta kuluçkaya yat. Bazen görünüm ve kristallerin büyüme için bir mikroskop altında damla kontrol edin.Kristal büyüme tamamlandıktan sonra, kristali içeren cam kapak kaymasını nazikçe çıkarın ve kristal indikyukarı bakacak şekilde sağlam bir yüzeye yerleştirin. Yavaşça kriyo 10 mikrolitre damla üstüne bir çözüm ekleyin ve yavaşça kristal dokunulmaz borulama tarafından karıştırın. Bir mikroskop kullanarak, yavaş yavaş kristal bazı sıvı çıkarın ve çözeltiyaklaşık beş ila sekiz mikrolitre tutun.Yavaşça damla üzerine cryo B çözeltisi 2,5 ila dört mikrolitre ekleyin ve yavaşça pipetleme ile karıştırın. Kristal üzerinde doğrudan hava akımını önlemek için küçük bir Petrie çanak ile cam coverslip kapağı. Beş dakika bekledikten sonra, uygun bir taban üzerine monte uygun bir kriyoloop damla tek bir kristal seçin.Kristali sıvı nitrojenle dondurun. Daha sonra kriyoloop içeren kristali, senkrotrondaki X-ışını kırınımı için hazır olana kadar de bir Dewar şişesinde sıvı nitrojene batırılmış bir diskte saklayın. Birkaç farklı IKK1 varyantı ile yapılan kapsamlı çalışmalardan sonra kristaller, sadece IKK inhibitörü XII'nin varlığında uygun X-ışını özelliklerini gösteren tek bir kesilmiş yapı ile elde edilmiştir.Düşük çözünürlüklü X-ışını verilerinin zayıf yoğunlukları, asimetrik birimdeki çok sayıda IKK1 molekülü ve IKK1 monomerik-dimerik modelinin konformasyonel varyasyonu, bilinen IKK2 modellerine göre moleküler replasman solüsyonu, IKK1 ve yapısını belirlemeyi zorlaştırdı. Farklı IKK2 yapıları, p578'in alfa karbonları arasındaki mesafenin iki kiazalan etki alanında, dört farklı dimer modelinde 39 ve 61 angstrom arasında değişebilmeleri için, dimer'lerinde farklı monomerler arası oryantasyon göstermiştir. Düşük çözünürlüklü kriyoelektron mikroskopi haritası ve yüksek çözünürlüklü IKK2 yapısına dayalı olarak oluşturulabilen IKK1 etki alanlarının yüksek doğruluklu modeli sayesinde yararlı bir arama modeli elde etmek mümkün oldu.İlk model, kiyaz etki alanının bir IKK2 monomerve 58 angstroms N-terminal açılış göre 24 derece döndürülen bir yönünü gösterdi. 52-angstrom açılımı model olarak dimerlerden birini kullanarak asimetrik ünitede altı dimer saptandı. Bir kez hakim, bu teknik birkaç ay içinde yürütülebilir, düzgün yapılırsa.Bu prosedürü denerken, çözünür, aktif ve iyi beslenmiş bir protein elde ilk kritik adım olduğunu hatırlamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra IKK1 proteininin kristalize edilmesi nde ve yapısını belirlemede başarılı olmak için özenli bir detayla izlenmesi gereken tüm adımları iyi bir genel anlayışa sahip olmalısınız. Bu prosedürü öğrenmek, kiaz-mitojen sinyalizasyonu ile ilgili ek soruları cevaplamak için de belirlenebilen diğer IKK aile proteinlerinin yapıları vardır.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/&#945;

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Termo, İfade, saflaştırılması, ve İnsan serotonin Transporter Kristalizasyon Bound<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Combining Wet and Dry Lab Techniques to Guide the Crystallization of Large Coiled-coil Containing Proteins

Islak ve kuru Lab Teknikleri birleştiren Büyük Spiral-coil İçeren Proteinler kristalleşmesini Kılavuzu

Obtaining crystals for structure determination can be a difficult and time consuming proposition for any protein. Coiled-coil proteins and domains are ...

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Üretim, Kristalleşme ve Yapı Tayini ve<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-1 mikro-tohumlama ve Çinko-SAD aracılığıyla

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

Biyomolekül Yapısının Belirlenmesi İçin Tek Molekül Seviyesinde Yüksek Hassasiyetteki FRET

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO

NEMO'nun IKK bağlayıcı alanının üretimi, kristalizasyonu ve Yapı Tayini

NEMO is a scaffolding protein which plays an essential role in the NF-&#954;B pathway by assembling the IKK-complex with the kinases IKK&#945; and ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

Çok Yönlü Bir Mikroakışkan Çipte Seri Kristalografi ile Bir Enzim:Substrat Kompleksinin Kristalizasyonu ve Yapısal Belirlenmesi

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

The Extraction of Liver Glycogen Molecules for Glycogen Structure Determination

Liver glycogen is a hyperbranched glucose polymer that is involved in the maintenance of blood sugar levels in animals. The properties of glycogen are ...

Efficient and Scalable Production of Full-length Human Huntingtin Variants in Mammalian Cells using a Transient Expression System

Full-length huntingtin (FL HTT) is a large (aa 1-3,144), ubiquitously expressed, polyglutamine (polyQ)-containing protein with a mass of approximately 350 ...

High-Throughput Screening for Protein Crystallization

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography (Video) | JoVE 

Protein kristalografisi için kristal isabetleri elde etmek için yüksek verimli tarama

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into ...

A Fibrinolytic Enzyme-Based Method to Study Cerebral Thrombus Cell Components

A Comprehensive Approach to Analyze the Cell Components of Cerebral Blood Clots

A Novel Method for Comprehensive Cell Component Analysis of Cerebral Blood Clots (Video) | JoVE

Serebral Kan Pıhtılarının Hücre Bileşenlerini Analiz Etmek İçin Kapsamlı Bir Yaklaşım

Cerebral thrombosis, a blood clot in a cerebral artery or vein, is the most common type of cerebral infarction. The study of the cell components of ...