Name: culturing in vivo-like murine astrocytes using the fast, simple, and inexpensive awesam protocol
Uploaded: 2018-01-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol at JoVE.com

Wir anerkennen die Finanzierung durch den Europäischen Forschungsrat (RP7/260916), die Alexander von Humboldt-Stiftung (Sofja Kovalevskaja) und der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DE1951 und SFB889).

Alle hier beschriebenen Tierversuche wurden gemäß den Richtlinien für den deutschen Tierschutz durchgeführt.
Hinweis: Die Timeline und die Hauptschritte des Protokolls sind in Abbildung 1dargestellt.
1. Vorbereitungen
<ol><li>
Bereiten Sie die folgenden Lösungen.
	<ol>
<li>Vorbereiten der DMEM + Kultivierung polygonale MD Astrozyten: DMEM mit 10 % FCS, 100 U Penicillin und 100 µg/mL Streptomycin.</li>
		<li>Vorb...

<ol>
	<li>Puschmann, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactive+3D+cell+culture+system+minimizes+cellular+stress+and+maintains+the+in+vivo-like+morphological+complexity+of+astroglial+cells.">Bioactive 3D cell culture system minimizes cellular stress and maintains the in vivo-like morphological complexity of astroglial cells.</a> Glia. 61 (3), 432-440 (2013).</li><li>Puschmann, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HB-EGF+affects+astrocyte+morphology,+proliferation,+differentiation,+and+the+expression+of+intermediate+filament+proteins.">HB-EGF affects astrocyte morphology, proliferation, differentiation, and the expression of intermediate filament proteins.</a> J Neurochem. 128 (6), 878-889 (2014).</li><li>Foo, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+method+for+the+purification+and+culture+of+rodent+astrocytes.">Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes.</a> Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).</li><li>Wolfes, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+culturing+stellate+astrocytes+reveals+spatially+distinct+Ca2++signaling+and+vesicle+recycling+in+astrocytic+processes.">A novel method for culturing stellate astrocytes reveals spatially distinct Ca2+ signaling and vesicle recycling in astrocytic processes.</a> J Gen Physiol. 149 (4), (2016).</li><li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue.">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> J Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).</li><li>Krencik, R., Zhang, S. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+functional+astroglial+subtypes+from+human+pluripotent+stem+cells.">Directed differentiation of functional astroglial subtypes from human pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 6 (11), 1710-1717 (2011).</li><li>Morita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+regulation+of+calcium+oscillation+in+astrocytes+by+growth+factors+and+pro-inflammatory+cytokines+via+the+mitogen-activated+protein+kinase+cascade.">Dual regulation of calcium oscillation in astrocytes by growth factors and pro-inflammatory cytokines via the mitogen-activated protein kinase cascade.</a> J Neurosci. 23 (34), 10944-10952 (2003).</li><li>Saura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+cells+in+astroglial+cultures:+a+cautionary+note.">Microglial cells in astroglial cultures: a cautionary note.</a> J Neuroinflammation. 4, 26 (2007).</li><li>Raponi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S100B+expression+defines+a+state+in+which+GFAP-expressing+cells+lose+their+neural+stem+cell+potential+and+acquire+a+more+mature+developmental+stage.">S100B expression defines a state in which GFAP-expressing cells lose their neural stem cell potential and acquire a more mature developmental stage.</a> Glia. 55 (2), 165-177 (2007).</li><li>Royo, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+AAV+serotypes+stably+transduce+primary+hippocampal+and+cortical+cultures+with+high+efficiency+and+low+toxicity.">Specific AAV serotypes stably transduce primary hippocampal and cortical cultures with high efficiency and low toxicity.</a> Brain Res. 1190, 15-22 (2008).</li><li>Malarkey, E. B., Parpura, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+characteristics+of+vesicular+fusion+in+astrocytes:+examination+of+synaptobrevin+2-laden+vesicles+at+single+vesicle+resolution.">Temporal characteristics of vesicular fusion in astrocytes: examination of synaptobrevin 2-laden vesicles at single vesicle resolution.</a> J Physiol. 589, 4271-4300 (2011).</li><li>Zamanian, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+analysis+of+reactive+astrogliosis.">Genomic analysis of reactive astrogliosis.</a> J Neurosci. 2 (18), 6391-6410 (2012).</li><li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca(2+)+signaling+in+astrocytes+from+Ip3r2(-/-)+mice+in+brain+slices+and+during+startle+responses+in+vivo.">Ca(2+) signaling in astrocytes from Ip3r2(-/-) mice in brain slices and during startle responses in vivo.</a> Nat Neurosci. 18 (5), 708-717 (2015).</li><li>Shigetomi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+microdomains+within+entire+astrocyte+territories+and+endfeet+with+GCaMPs+expressed+using+adeno-associated+viruses.">Imaging calcium microdomains within entire astrocyte territories and endfeet with GCaMPs expressed using adeno-associated viruses.</a> J Gen Physiol. 141 (5), 633-647 (2013).</li><li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Transgenic+Mouse+Lines+for+Selectively+Targeting+Astrocytes+and+Studying+Calcium+Signals+in+Astrocyte+Processes+In+Situ+and+In+Vivo.">New Transgenic Mouse Lines for Selectively Targeting Astrocytes and Studying Calcium Signals in Astrocyte Processes In Situ and In Vivo.</a> Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).</li><li>Otsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+dynamics+in+astrocyte+processes+during+neurovascular+coupling.">Calcium dynamics in astrocyte processes during neurovascular coupling.</a> Nat Neurosci. 18 (2), 210-218 (2015).</li><li>Agarwal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+Opening+of+the+Mitochondrial+Permeability+Transition+Pore+Induces+Microdomain+Calcium+Transients+in+Astrocyte+Processes.">Transient Opening of the Mitochondrial Permeability Transition Pore Induces Microdomain Calcium Transients in Astrocyte Processes.</a> Neuron. 93 (3), 587-605 (2017).</li></ol>

Vier Schritte innerhalb des Protokolls sind von entscheidender Bedeutung: 1) Vorbereitung der HBEGF-Konzentration auf genau 5 ng/mL, da kleine Erhöhungen der Konzentration zu unreif Kulturen, z. B.führen können 10 ng/mL HBEGF de differenzieren Astrozyten4; (2) Vermeidung von Luftblasen in den Lösungen, die Gewebe oder Zellen, die den pH-Wert verändern und behindern Astrozyten Gesundheit enthalten; (3) Pre-ausgleichende Medien, der optimale pH-Wert und Temperatur für den Anbau von ge...

Astrozyten beeinflussen die Funktion des Gehirns durch trophischen Unterstützung, Durchblutung, synaptische Signalisierung und Plastizität und interzelluläre Kommunikation - sind die Mechanismen, die drehen sich um die dünnen astrocytic Prozesse. Die hier beschriebene AWESAM-Protokoll ermöglicht das Studium dieser Prozesse ohne Einmischung von Neuronen und anderen Gliazellen, die nützlich z.B.ist, weil der Ausdruck vieler Proteine und sogar Ca2 + Signalisierung über verschiedene Gehirnzelle überlappen Typen. Weiter, diese Methode überwindet Grenzen der bisher verfügbaren Techniken. Unser Protokoll sieht insbesondere in Vivo-wie Morphologie (stellate Astrozyten mit dünnen Prozesse) und Genexpression in eine schnelle, einfache und billige Weise.
Zellmorphologie, Genexpression und viele andere regulatorische Prozesse sind direkt durch die Umgebung beeinflusst. In der Kulturschale bezieht sich auf Faktoren von umgebenden Zellen, sondern auch das Medium, in dem die Zellen gezüchtet werden, veröffentlicht. Astrozyten HBEGF wurde zuvor berichtet, dass ein Ganglion Morphologie1 induzieren sondern wurde auch festgestellt, dass um Astrozyten2de-zu unterscheiden. Niedrigere Konzentrationen von HBEGF dienten jedoch später zur Erzeugung von mehr in-Vivo-wie Astrozyten über RNA Sequenzierung in zwei verschiedene Protokolle3,4identifiziert. Darüber hinaus ändert sich Astrozyten Morphologie mit mittlerer Zusammensetzung, unabhängig von dem Protokoll Nr.4: Neurobasal Medium mit einer niedrigen Konzentration von HBEGF ist optimal für den Anbau von Ganglion Astrozyten, während andere mittlere Kompositionen (z.B. Serum-haltigen DMEM) produzieren polygonale Zellen (auch in Astrozyten frisch durch Immunopanning isoliert).
Das AWESAM-Protokoll überwindet Nachteile der bisherigen Techniken für den Anbau von Astrozyten Monokulturen4. Bisherige Techniken für den Anbau von Monokulturen Astrozyten haben folgende Nachteile: polygonale Morphologie, die untypisch für Ganglion Astrozyten in Vivo (MD-Methode)5; die Länge und die Kosten des Protokolls (Vorbereitung Astrozyten von induzierten pluripotenten Stammzellen dauert drei Monate und erfordert viele Reagenzien, einschließlich teuer Wachstumsfaktoren)6; die geringen Mengen an Material (Immunopanning Methode)3; und die de-Differenzierung der Astrozyten und Anforderung einer 3D Matrix (Puschmann Et Al) 1 , 2. im Gegensatz dazu bietet das AWESAM-Protokoll: in Vivo-wie Morphologie (stellate Astrozyten mit dünnen Prozesse); eine schnelle, einfache und billige Methode; große Mengen an Material; und die in-Vivo-wie Genexpression im Vergleich mit Immunopanned und MD Astrozyten. Darüber hinaus kann 2D Kultur für die Untersuchung von Ca2 + Signal- und recycling in dünnen Prozesse und Ereignisse in der Nähe der Membran Vesikel (z.B.TIRF-Mikroskopie ist nicht möglich in 3D Kulturen).
Die MD-Methode wurde seit seiner Veröffentlichung im Jahr 19805, bietet eine einfache und schnelle Technik für polygonale Astrozyten Monokulturen ausgiebig verwendet. Kurz gesagt, die MD-Methode bringt wachsenden gemischten Gehirnzellen in fetalen Kälberserum (FCS)-mit DMEM, gefolgt von schütteln Schritte, die für Astrozyten (wie alle anderen Arten von der Schale lösen Gehirnzelle) bereichern und weiter im gleichen Medium Kultur. DMEM ergänzt mit FCS dient vielen anderen Zelltypen, Fibroblasten und Adipozyten bis hin zu verschiedenen Krebszelllinien, die teilen die polygonale Morphologie von MD Astrozyten in Kultur ausgestellt. Bis zu den frühen 2000er Jahren7, war wenig Gedanken gewesen Medien zugeschnitten auf Astrozyten gegeben, insbesondere zugunsten ihrer typischen stellate Morphologie in Vivogefunden. Ein Protokoll veröffentlicht im Jahr 2011 wird solche stellate Morphologie erreicht: die Immunopanning-Methode aufgerufen, es beschäftigt serumfreien Medium für die Kultivierung von Astrozyten3optimiert. Mit dieser Methode sind frisch isolierte Gehirnzellen ausgesetzt eine Reihe von Gerichten beschichtet mit Antikörpern, die auf Zelle typspezifische Zelle Oberflächenproteine für Astrozyten zu bereichern. Trotz mehr in-Vivo-wie Morphologie und Ausdruck Profil Immunopanned Astrozyten, die Mehrheit der in-vitro- Studien noch auf die MD Astrozyten Methode verlassen. Die MD-Methode ist einfach und schnell, während die Immunopanning-Methode komplexe und zeitaufwendige Schritte am ersten Tag der Kultur umfasst (z. B. Enzym Verdauung längere, sorgfältige Schichtung der Lösungen von unterschiedlicher Dichte, Immunopanning, und Zentrifugation Schritten - alles vor der Beschichtung). Die AWESAM-Methode bietet jedoch mithilfe von spezielleren Medium sowohl die Geschwindigkeit der MD-Methode und die in-Vivo-wie Morphologie des Immunopanning-Protokolls.
Insgesamt das AWESAM-Protokoll eignet sich für ein Studium mehr in Vivo-wie Astrozyten in 2D Monokulturen von Neuronen und anderen Glia (wie bisher charakterisierten4 von Immunostainings, Immunoblots und RNA Sequenzierung) isoliert. Es ermöglicht die Untersuchung von dünnen astrocytic Prozessen und bietet guten Zugang zur Visualisierung von spontanen Ca2 + Signalisierung und Veranstaltungen in der Nähe der Membran (z.B.durch TIRF-Mikroskopie abgebildet).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="898">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">0.05% trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:171px;">Gibco</td>
			<td style="width:344px;">25300054</td>
			<td style="width:167px;">warm in 37 &#186;C waterbath before use</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.25% trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>warm in 37 &#186;C waterbath before use</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">B-27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>50X stock</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>100X stock</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicillin / streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td>50 stock; penicillin: 5000 U/ml; streptomycin: 5000 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>without L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HBEGF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>4643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14170112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">FCS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010049</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100 &#956;m nylon cell strainer</td>
			<td>BD</td>
			<td style="width:344px;">352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trypan Blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cell culture incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hera Cell 240i cell culture incubator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Laboratory shaker</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>Rotamax 120&#160;</td>
			<td>use inside cell culture incubator</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing in vivo-like murine astrocytes using the fast, simple, and inexpensive awesam protocol

Die AWESAM (ein low- eAsy sTellate einStrocyte methode Kosten) Protokoll beinhaltet einen schnelle, einfachen und kostengünstigen Weg, um große Mengen von in-Vivo-wie Maus und Ratte Astrozyten Monokulturen : Die Gehirnzellen können aus verschiedenen Gehirnregionen isoliert werden, und nach einer Woche der Zellkultur sind nicht astrocytic Zellen indem die Kultur Gerichte auf einem Boston-Shaker für 6 h im Inkubator abgeschüttelt. Die restlichen Astrozyten sind dann in neue Platten mit einem Astrozyten-spezifischen Medium (NB + H bezeichnet) passagiert. NB + H enthält geringe Konzentrationen des Heparin-Binding EGF-Like Growth Factor (HBEGF), die anstelle von Serum in Medium verwendet wird. Nach einem Wachstum in NB + H, haben AWESAM Astrozyten ein Ganglion Morphologie und Funktion feinen Prozesse. Darüber hinaus haben diese Astrozyten mehr in-Vivo-wie gen-Expression als Astrozyten von zuvor veröffentlichten Methoden generiert. Ca2 + Bildgebung, Vesikel Dynamik und andere Veranstaltungen in der Nähe der Membran können somit in der feinen astrocytic Prozesse in Vitro, z. B.mit live Zelle konfokale oder TIRF-Mikroskopie untersucht werden. AWESAM Astrozyten zeigen vor allem auch spontan Ca2 + Signalisierung Astrozyten in Vivoähnlich.

Astrozyten, die gemeinsam mit Neuronen kultiviert und angebaut in NB + Medium erscheinen Ganglion nach 2 Wochen der Kultur (Abbildung 2). Neben NB + Medium sind Co kultivierten Astrozyten auch unbekannte Neuron-abgeleitete Faktoren ausgesetzt, die wahrscheinlich um ihr Überleben und Ihre Morphologie beitragen. Im Gegensatz dazu erscheinen MD Astrozyten in DMEM + als Monokulturen angebaut (nach anderen Zelltypen vor Passage abschütteln) polygonalen nach 2 Wo...

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Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

Die hier beschriebene AWESAM-Protokoll ist optimal für die Kultivierung von murinen Astrozyten isoliert von anderen Gehirnzellen in eine schnelle, einfache und kostengünstige Weise. AWESAM Astrozyten weisen spontane Ca2 + -Signalisierung, Morphologie und gen Expressionsprofile Astrozyten in Vivoähnlich.

In VivoKultivierung-wie Murine Astrozyten über das schnelle, einfache und kostengünstige AWESAM-Protokoll

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

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