Name: culturing in vivo-like murine astrocytes using the fast, simple, and inexpensive awesam protocol
Uploaded: 2018-01-10T13:00:00
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हम यूरोपीय अनुसंधान परिषद (FP7/260916), अलेक्जेंडर वॉन पीरु-Stiftung (Sofja Kovalevskaja), और ड्यूश Forschungsgemeinschaft (1951 और SFB889) से धन स्वीकार करते हैं ।

यहां वर्णित सभी पशु प्रयोगों में जर्मन पशु कल्याण के लिए दिशानिर्देश के अनुसार प्रदर्शन किए गए ।
नोट: समयरेखा और प्रोटोकॉल के मुख्य चरण चित्र 1में सचित्र हैं ।
1. तैयारी
...

<ol>
	<li>Puschmann, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactive+3D+cell+culture+system+minimizes+cellular+stress+and+maintains+the+in+vivo-like+morphological+complexity+of+astroglial+cells.">Bioactive 3D cell culture system minimizes cellular stress and maintains the in vivo-like morphological complexity of astroglial cells.</a> Glia. 61 (3), 432-440 (2013).</li><li>Puschmann, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HB-EGF+affects+astrocyte+morphology,+proliferation,+differentiation,+and+the+expression+of+intermediate+filament+proteins.">HB-EGF affects astrocyte morphology, proliferation, differentiation, and the expression of intermediate filament proteins.</a> J Neurochem. 128 (6), 878-889 (2014).</li><li>Foo, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+method+for+the+purification+and+culture+of+rodent+astrocytes.">Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes.</a> Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).</li><li>Wolfes, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+culturing+stellate+astrocytes+reveals+spatially+distinct+Ca2++signaling+and+vesicle+recycling+in+astrocytic+processes.">A novel method for culturing stellate astrocytes reveals spatially distinct Ca2+ signaling and vesicle recycling in astrocytic processes.</a> J Gen Physiol. 149 (4), (2016).</li><li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue.">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> J Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).</li><li>Krencik, R., Zhang, S. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+functional+astroglial+subtypes+from+human+pluripotent+stem+cells.">Directed differentiation of functional astroglial subtypes from human pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 6 (11), 1710-1717 (2011).</li><li>Morita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+regulation+of+calcium+oscillation+in+astrocytes+by+growth+factors+and+pro-inflammatory+cytokines+via+the+mitogen-activated+protein+kinase+cascade.">Dual regulation of calcium oscillation in astrocytes by growth factors and pro-inflammatory cytokines via the mitogen-activated protein kinase cascade.</a> J Neurosci. 23 (34), 10944-10952 (2003).</li><li>Saura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+cells+in+astroglial+cultures:+a+cautionary+note.">Microglial cells in astroglial cultures: a cautionary note.</a> J Neuroinflammation. 4, 26 (2007).</li><li>Raponi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S100B+expression+defines+a+state+in+which+GFAP-expressing+cells+lose+their+neural+stem+cell+potential+and+acquire+a+more+mature+developmental+stage.">S100B expression defines a state in which GFAP-expressing cells lose their neural stem cell potential and acquire a more mature developmental stage.</a> Glia. 55 (2), 165-177 (2007).</li><li>Royo, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+AAV+serotypes+stably+transduce+primary+hippocampal+and+cortical+cultures+with+high+efficiency+and+low+toxicity.">Specific AAV serotypes stably transduce primary hippocampal and cortical cultures with high efficiency and low toxicity.</a> Brain Res. 1190, 15-22 (2008).</li><li>Malarkey, E. B., Parpura, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+characteristics+of+vesicular+fusion+in+astrocytes:+examination+of+synaptobrevin+2-laden+vesicles+at+single+vesicle+resolution.">Temporal characteristics of vesicular fusion in astrocytes: examination of synaptobrevin 2-laden vesicles at single vesicle resolution.</a> J Physiol. 589, 4271-4300 (2011).</li><li>Zamanian, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+analysis+of+reactive+astrogliosis.">Genomic analysis of reactive astrogliosis.</a> J Neurosci. 2 (18), 6391-6410 (2012).</li><li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca(2+)+signaling+in+astrocytes+from+Ip3r2(-/-)+mice+in+brain+slices+and+during+startle+responses+in+vivo.">Ca(2+) signaling in astrocytes from Ip3r2(-/-) mice in brain slices and during startle responses in vivo.</a> Nat Neurosci. 18 (5), 708-717 (2015).</li><li>Shigetomi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+microdomains+within+entire+astrocyte+territories+and+endfeet+with+GCaMPs+expressed+using+adeno-associated+viruses.">Imaging calcium microdomains within entire astrocyte territories and endfeet with GCaMPs expressed using adeno-associated viruses.</a> J Gen Physiol. 141 (5), 633-647 (2013).</li><li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Transgenic+Mouse+Lines+for+Selectively+Targeting+Astrocytes+and+Studying+Calcium+Signals+in+Astrocyte+Processes+In+Situ+and+In+Vivo.">New Transgenic Mouse Lines for Selectively Targeting Astrocytes and Studying Calcium Signals in Astrocyte Processes In Situ and In Vivo.</a> Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).</li><li>Otsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+dynamics+in+astrocyte+processes+during+neurovascular+coupling.">Calcium dynamics in astrocyte processes during neurovascular coupling.</a> Nat Neurosci. 18 (2), 210-218 (2015).</li><li>Agarwal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+Opening+of+the+Mitochondrial+Permeability+Transition+Pore+Induces+Microdomain+Calcium+Transients+in+Astrocyte+Processes.">Transient Opening of the Mitochondrial Permeability Transition Pore Induces Microdomain Calcium Transients in Astrocyte Processes.</a> Neuron. 93 (3), 587-605 (2017).</li></ol>

प्रोटोकॉल के भीतर चार कदम महत्वपूर्ण हैं: 1) HBEGF एकाग्रता की तैयारी ठीक 5 एनजी करने के लिए/एमएल, एकाग्रता में छोटी वृद्धि के बाद से अपरिपक्व संस्कृतियों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, जैसे, 10 एनजी/एमएल HBEGF de-अं...

Astrocytes प्रभाव पौष्टिकता समर्थन, रक्त प्रवाह, synaptic संकेतन और प्लास्टिक के माध्यम से मस्तिष्क समारोह, और सेलुलर संचार-जो सभी तंत्र पतली astrocytic प्रक्रियाओं के आसपास है कि केंद्र हैं । AWESAM प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित न्यूरॉन्स और अन्य glia, जो उपयोगी है से हस्तक्षेप के बिना इन प्रक्रियाओं के अध्ययन की अनुमति देता है उदा, क्योंकि कई प्रोटीन की अभिव्यक्ति और यहां तक कि सीए2 + संकेत अलग मस्तिष्क कोशिका भर में ओवरलैप प्रकार. इसके अलावा, इस विधि पहले से उपलब्ध तकनीकों की सीमाओं पर काबू । विशेष रूप से, हमारे प्रोटोकॉल एक त्वरित, आसान, और सस्ते तरीके में vivo-like आकृति विज्ञान (पतली प्रक्रियाओं के साथ stellate astrocytes) और जीन अभिव्यक्ति मेंप्रदान करता है ।
कक्ष आकृति विज्ञान, जीन अभिव्यक्ति, और कई अंय नियामक प्रक्रियाओं सीधे पर्यावरण से प्रभावित हैं । एक संस्कृति डिश में, यह आसपास के कोशिकाओं द्वारा जारी कारकों को संदर्भित करता है, लेकिन यह भी माध्यम है जिसमें कोशिकाओं को उगाया जाता है । astrocytes के लिए, HBEGF पहले एक stellate आकृति विज्ञान1 प्रेरित करने के लिए सूचित किया गया था, लेकिन यह भी de-अंतर astrocytes2करने के लिए पाया गया. हालांकि, HBEGF की कम सांद्रता बाद में दो अलग प्रोटोकॉल3,4में आरएनए अनुक्रमण के माध्यम से की पहचान के रूप में vivo-like astrocytes मेंऔर अधिक उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया गया । इसके अलावा, माध्यम रचना के साथ astrocyte आकृति विज्ञान परिवर्तन, प्रोटोकॉल की परवाह किए बिना4: HBEGF की एक कम एकाग्रता के साथ Neurobasal माध्यम stellate astrocytes बढ़ने के लिए इष्टतम है, जबकि अन्य माध्यम रचनाएं (उदा., सीरम युक्त DMEM) बहुभुज कोशिकाओं का उत्पादन (यहां तक कि astrocytes हौसले से immunopanning द्वारा पृथक) ।
AWESAM प्रोटोकॉल पिछले तकनीक के नुकसान पर काबू astrocyte monocultures4बढ़ती के लिए । बढ़ती astrocyte monocultures के लिए पिछले तकनीक निम्नलिखित नुकसान है: बहुभुज आकृति विज्ञान, जो vivo में stellate astrocytes का विलक्षण है (एमडी विधि)5; प्रोटोकॉल की लंबाई और लागत (प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं से astrocytes तैयार करने में तीन महीने लगते हैं और कई रिएजेंटों की आवश्यकता होती है, जिनमें महंगे विकास कारक शामिल हैं)6; सामग्री की कम मात्रा (immunopanning method)3; और astrocytes के de-भिंनता और एक 3 डी मैट्रिक्स की आवश्यकता (Puschmann एट अल.) 1 , 2. इसके विपरीत, AWESAM प्रोटोकॉल प्रदान करता है: vivo मेंकी तरह आकृति विज्ञान (पतली प्रक्रियाओं के साथ stellate astrocytes); एक त्वरित, आसान, और सस्ते विधि; सामग्री की बड़ी मात्रा; और immunopanned और एमडी astrocytes के साथ तुलना में vivoकी तरह जीन अभिव्यक्ति में सबसे । इसके अतिरिक्त, 2d संस्कृति के अध्ययन के लिए अनुमति देता है Ca के2 + संकेत और पतली प्रक्रियाओं में पुटिका रीसाइक्लिंग, और घटनाओं में झिल्ली के करीब (जैसे, TIRF माइक्रोस्कोपी 3 डी संस्कृतियों में संभव नहीं है).
प्रबंध निदेशक विधि बड़े पैमाने पर किया गया है १९८०5में अपने प्रकाशन के बाद से, बहुभुज astrocyte monocultures के लिए एक सरल और तेजी से तकनीक की पेशकश की । संक्षेप में, एमडी विधि भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS) में मिश्रित मस्तिष्क कोशिकाओं बढ़ जरूरत पर जोर देता है-DMEM युक्त, कदम है कि astrocytes के लिए समृद्ध (सभी अंय मस्तिष्क कोशिका प्रकार पकवान से अलग के रूप में) और एक ही माध्यम में आगे संस्कृति मिलाने के बाद । FCS के साथ पूरक DMEM कई अन्य प्रकार के सेल के लिए प्रयोग किया जाता है, fibroblasts और adipocytes से अलग कैंसर सेल लाइनों को लेकर, सभी जिनमें से सभी को संस्कृति में एमडी astrocytes द्वारा प्रदर्शित बहुभुज आकृति विज्ञान का हिस्सा. जल्दी-20007तक, थोड़ा सोचा था कि astrocytes के अनुरूप मीडिया को दिया गया है, विशेष रूप से अपने ठेठ stellate vivo मेंपाया विज्ञान के पक्ष में । एक २०११ में प्रकाशित प्रोटोकॉल ऐसी stellate आकृति विज्ञान प्राप्त करता है: immunopanning विधि कहा जाता है, यह सीरम मुक्त माध्यम संवर्धन astrocytes3के लिए अनुकूलित काम करते हैं । इस विधि का प्रयोग, हौसले से पृथक मस्तिष्क कोशिकाओं को एंटीबॉडी के साथ लेपित व्यंजन की एक श्रृंखला के लिए उजागर कर रहे हैं कि लक्ष्य सेल प्रकार विशिष्ट कोशिका सतह प्रोटीन, astrocytes के लिए समृद्ध करने के लिए. vivo मेंऔर अधिक के बावजूद immunopanned astrocytes की तरह आकृति विज्ञान और अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल, इन विट्रो अध्ययनों में से अधिकांश अभी भी MD astrocyte विधि पर भरोसा करते हैं । एमडी विधि सरल और तेज है, जबकि immunopanning विधि संस्कृति के पहले दिन पर अधिक जटिल और समय लेने वाले कदम शामिल (जैसे अब एंजाइम पाचन समय, अलग घनत्व के समाधान के सावधान layering, immunopanning ही, और कई केंद्रापसारक कदम-सभी चढ़ाना से पहले) । हालांकि, और अधिक विशेष माध्यम का उपयोग करके, AWESAM विधि एमडी विधि की गति और immunopanning प्रोटोकॉल के vivo-like आकृति विज्ञान मेंदोनों प्रदान करता है ।
कुल मिलाकर, AWESAM प्रोटोकॉल vivo मेंअधिक astrocytes की तरह 2d monocultures में अधिक अध्ययन के लिए उपयोगी है ंयूरॉंस और अंय glia से पृथक (के रूप में पहले immunostainings, immunoblots, और आरएनए अनुक्रमण द्वारा4 विशेषता) । यह पतली astrocytic प्रक्रियाओं के अध्ययन के लिए अनुमति देता है, और सहज Ca2 + संकेत और झिल्ली (जैसे, TIRF माइक्रोस्कोपी द्वारा imaged) के करीब घटनाओं visualizing के लिए महान पहुंच प्रदान करता है ।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="898">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">0.05% trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:171px;">Gibco</td>
			<td style="width:344px;">25300054</td>
			<td style="width:167px;">warm in 37 &#186;C waterbath before use</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.25% trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>warm in 37 &#186;C waterbath before use</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">B-27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>50X stock</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>100X stock</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicillin / streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td>50 stock; penicillin: 5000 U/ml; streptomycin: 5000 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>without L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HBEGF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>4643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14170112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">FCS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010049</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100 &#956;m nylon cell strainer</td>
			<td>BD</td>
			<td style="width:344px;">352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trypan Blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cell culture incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hera Cell 240i cell culture incubator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Laboratory shaker</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>Rotamax 120&#160;</td>
			<td>use inside cell culture incubator</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing in vivo-like murine astrocytes using the fast, simple, and inexpensive awesam protocol

AWESAM (a low-लागत easy stellate astrocyte method) प्रोटोकॉल एक तेज, सरल, और सस्ता तरीका vivo-like माउस और चूहे astrocyte में बड़ी मात्रा मेंउत्पन्न करने के लिए जोर देता है monocultures : मस्तिष्क की कोशिकाओं को अलग मस्तिष्क क्षेत्रों से पृथक किया जा सकता है, और सेल संस्कृति के एक सप्ताह के बाद, गैर astrocytic कोशिकाओं को मशीन में 6 एच के लिए एक शेखर पर संस्कृति व्यंजन रखकर बंद हिल रहे हैं । शेष astrocytes तो एक astrocyte-विशिष्ट माध्यम के साथ नई प्लेटों में पारित कर रहे है (एनबी + एच) । एनबी + एच हेपरिन-बाध्यकारी EGF की तरह वृद्धि कारक (HBEGF) है, जो मध्यम में सीरम के स्थान पर प्रयोग किया जाता है की कम सांद्रता शामिल हैं । एनबी + एच में बढ़ के बाद, AWESAM astrocytes एक stellate आकृति विज्ञान और सुविधा ठीक प्रक्रियाओं है । इसके अलावा, इन astrocytes पहले प्रकाशित तरीकों से उत्पंन astrocytes की तुलना में vivoकी तरह जीन अभिव्यक्ति में अधिक है । सीए2 + इमेजिंग, पुटिका गतिशीलता, और झिल्ली के करीब अन्य घटनाओं इस प्रकार इन विट्रो मेंठीक astrocytic प्रक्रियाओं में अध्ययन किया जा सकता है, उदा, लाइव सेल फोकल या TIRF माइक्रोस्कोप का उपयोग. विशेष रूप से, AWESAM astrocytes भी vivo मेंastrocytes करने के लिए इसी तरह सहज सीए2 + संकेतन प्रदर्शन ।

Astrocytes जो न्यूरॉन्स के साथ सह-कल्चरित होते हैं और एनबी + मीडियम में उगाए जाते हैं, संस्कृति के 2 सप्ताह के बाद stellate दिखाई देते हैं (चित्र 2). एनबी + मध्यम के अलावा, सह-कल्चर्ड astrocytes भी अज्ञात ...

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Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

AWESAM प्रोटोकॉल यहां वर्णित एक तेज, सरल, और सस्ती तरीके से अंय मस्तिष्क कोशिकाओं से अलगाव में संवर्धन murine astrocytes के लिए इष्टतम है । AWESAM astrocytes प्रदर्शन सहज सीए2 + सिग्नलिंग, आकृति विज्ञान, और जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल vivo मेंastrocytes के समान ।

तेज, सरल, और सस्ती AWESAM प्रोटोकॉल का उपयोग कर Vivo-like Murine Astrocytes मेंसंवर्धन

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

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