Name: culturing in vivo-like murine astrocytes using the fast, simple, and inexpensive awesam protocol
Uploaded: 2018-01-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol at JoVE.com

Riconosciamo che finanziamenti dal Consiglio europeo della ricerca (7 ° PQ/260916), Alexander von Humboldt-Stiftung (Sofja Kovalevskaja) e il Deutsche Forschungsgemeinschaft (DE1951 e SFB889).

Tutti gli esperimenti sugli animali descritti qui sono stati eseguiti in conformità con le linee guida per il benessere animale tedesco.
Nota: La linea temporale e i passaggi principali del protocollo sono illustrati nella Figura 1.
1. preparati
<ol><li>
Preparare le seguenti soluzioni.
	<ol>
<li>Preparare DMEM + per la coltura di astrociti MD poligonali: DMEM con 10% FCS, 100 U penicillina e 100 µ g/mL di streptomi...

<ol>
	<li>Puschmann, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactive+3D+cell+culture+system+minimizes+cellular+stress+and+maintains+the+in+vivo-like+morphological+complexity+of+astroglial+cells.">Bioactive 3D cell culture system minimizes cellular stress and maintains the in vivo-like morphological complexity of astroglial cells.</a> Glia. 61 (3), 432-440 (2013).</li><li>Puschmann, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HB-EGF+affects+astrocyte+morphology,+proliferation,+differentiation,+and+the+expression+of+intermediate+filament+proteins.">HB-EGF affects astrocyte morphology, proliferation, differentiation, and the expression of intermediate filament proteins.</a> J Neurochem. 128 (6), 878-889 (2014).</li><li>Foo, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+method+for+the+purification+and+culture+of+rodent+astrocytes.">Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes.</a> Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).</li><li>Wolfes, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+culturing+stellate+astrocytes+reveals+spatially+distinct+Ca2++signaling+and+vesicle+recycling+in+astrocytic+processes.">A novel method for culturing stellate astrocytes reveals spatially distinct Ca2+ signaling and vesicle recycling in astrocytic processes.</a> J Gen Physiol. 149 (4), (2016).</li><li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue.">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> J Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).</li><li>Krencik, R., Zhang, S. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+functional+astroglial+subtypes+from+human+pluripotent+stem+cells.">Directed differentiation of functional astroglial subtypes from human pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 6 (11), 1710-1717 (2011).</li><li>Morita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+regulation+of+calcium+oscillation+in+astrocytes+by+growth+factors+and+pro-inflammatory+cytokines+via+the+mitogen-activated+protein+kinase+cascade.">Dual regulation of calcium oscillation in astrocytes by growth factors and pro-inflammatory cytokines via the mitogen-activated protein kinase cascade.</a> J Neurosci. 23 (34), 10944-10952 (2003).</li><li>Saura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+cells+in+astroglial+cultures:+a+cautionary+note.">Microglial cells in astroglial cultures: a cautionary note.</a> J Neuroinflammation. 4, 26 (2007).</li><li>Raponi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S100B+expression+defines+a+state+in+which+GFAP-expressing+cells+lose+their+neural+stem+cell+potential+and+acquire+a+more+mature+developmental+stage.">S100B expression defines a state in which GFAP-expressing cells lose their neural stem cell potential and acquire a more mature developmental stage.</a> Glia. 55 (2), 165-177 (2007).</li><li>Royo, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+AAV+serotypes+stably+transduce+primary+hippocampal+and+cortical+cultures+with+high+efficiency+and+low+toxicity.">Specific AAV serotypes stably transduce primary hippocampal and cortical cultures with high efficiency and low toxicity.</a> Brain Res. 1190, 15-22 (2008).</li><li>Malarkey, E. B., Parpura, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+characteristics+of+vesicular+fusion+in+astrocytes:+examination+of+synaptobrevin+2-laden+vesicles+at+single+vesicle+resolution.">Temporal characteristics of vesicular fusion in astrocytes: examination of synaptobrevin 2-laden vesicles at single vesicle resolution.</a> J Physiol. 589, 4271-4300 (2011).</li><li>Zamanian, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+analysis+of+reactive+astrogliosis.">Genomic analysis of reactive astrogliosis.</a> J Neurosci. 2 (18), 6391-6410 (2012).</li><li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca(2+)+signaling+in+astrocytes+from+Ip3r2(-/-)+mice+in+brain+slices+and+during+startle+responses+in+vivo.">Ca(2+) signaling in astrocytes from Ip3r2(-/-) mice in brain slices and during startle responses in vivo.</a> Nat Neurosci. 18 (5), 708-717 (2015).</li><li>Shigetomi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+microdomains+within+entire+astrocyte+territories+and+endfeet+with+GCaMPs+expressed+using+adeno-associated+viruses.">Imaging calcium microdomains within entire astrocyte territories and endfeet with GCaMPs expressed using adeno-associated viruses.</a> J Gen Physiol. 141 (5), 633-647 (2013).</li><li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Transgenic+Mouse+Lines+for+Selectively+Targeting+Astrocytes+and+Studying+Calcium+Signals+in+Astrocyte+Processes+In+Situ+and+In+Vivo.">New Transgenic Mouse Lines for Selectively Targeting Astrocytes and Studying Calcium Signals in Astrocyte Processes In Situ and In Vivo.</a> Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).</li><li>Otsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+dynamics+in+astrocyte+processes+during+neurovascular+coupling.">Calcium dynamics in astrocyte processes during neurovascular coupling.</a> Nat Neurosci. 18 (2), 210-218 (2015).</li><li>Agarwal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+Opening+of+the+Mitochondrial+Permeability+Transition+Pore+Induces+Microdomain+Calcium+Transients+in+Astrocyte+Processes.">Transient Opening of the Mitochondrial Permeability Transition Pore Induces Microdomain Calcium Transients in Astrocyte Processes.</a> Neuron. 93 (3), 587-605 (2017).</li></ol>

Quattro passi all'interno del protocollo sono fondamentali: 1) preparare la concentrazione di HBEGF e precisamente 5 ng/mL, poiché piccoli aumenti nella concentrazione possono condurre a culture immature, ad esempio, 10 ng/mL HBEGF de-differenziare astrociti4; 2) evita bolle nelle soluzioni che contengono il tessuto o le cellule, che possono cambiare il pH e ostacolare la salute di astrociti; 3) pre-riequilibranti media per raggiungere il pH ottimale e la temperatura per la crescita sani...

Astrociti influenzano la funzione del cervello attraverso supporto trofico, flusso sanguigno, segnalazione sinaptica e plasticità e comunicazione intercellulare - che sono tutti meccanismi che centro attorno i processi astrocitari sottili. Il protocollo AWESAM descritto qui permette lo studio di questi processi senza interferenze da parte di neuroni e glia altri, che è utile per esempio, perché l'espressione di molte proteine e anche di Ca2 + segnalazione si sovrappongono in tutto cellula cerebrale diversa tipi. Inoltre, questo metodo supera i limiti delle tecniche precedentemente disponibili. In particolare, il nostro protocollo prevede in vivo-come morfologia (astrociti stellari con sottili processi) e l'espressione genica in un veloce, facile e modo a buon mercato.
Morfologia delle cellule, espressione genica e molti altri processi normativi sono direttamente influenzati dall'ambiente. In una piastra di coltura, si riferisce a fattori rilasciati dalle cellule circostanti, ma anche il mezzo in cui le cellule sono cresciute. Per gli astrociti, HBEGF precedentemente è stata segnalata per indurre una morfologia stellari1 ma è stato anche trovato per-differenziare gli astrociti2. Tuttavia, concentrazioni più basse di HBEGF più successivamente sono state utilizzate per la generazione di più nel vivo-come astrociti come identificato tramite sequenziamento di RNA in due differenti protocolli3,4. Inoltre, la morfologia del astrocyte cambia con la composizione media, indipendentemente dal protocollo4: Neurobasal medio con una bassa concentrazione di HBEGF è ottima per la coltivazione di astrociti stellari, mentre altre composizioni medie (ad es., contenenti siero DMEM) produrre cellule poligonali (anche negli astrociti appena isolati di immunopanning).
Il protocollo AWESAM sormonta gli svantaggi delle precedenti tecniche per la coltivazione del astrocyte monocolture4. Tecniche precedenti per la coltivazione di monocolture Astrocita presentano i seguenti svantaggi: morfologia poligonale, che è inconsueta che gli astrociti stellari in vivo (MD metodo)5; la lunghezza e il costo del protocollo (preparazione astrociti da prende le cellule staminali pluripotenti indotte tre mesi e richiede molti reagenti, compresi costosi fattori di crescita)6; la bassa quantità di materiale (metodo immunopanning)3; e la de-differenziazione degli astrociti e requisito di una matrice 3D (Puschmann et al.) 1 , 2. al contrario, fornisce il protocollo AWESAM: in vivo-come la morfologia (astrociti stellari con sottili processi); un veloce, facile e a buon mercato metodo; grandi quantità di materiale; e di più nel vivo-come espressione genica rispetto a immunopanned e astrociti di MD. Inoltre, cultura 2D consente lo studio di segnalazione di Ca2 + e riciclaggio in sottili processi e in eventi vicino la membrana della vescicola (ad es., microscopia TIRF non è possibile in 3D culture).
Il metodo di MD è stato ampiamente utilizzato dalla sua pubblicazione nel 19805, che offre una tecnica semplice e veloce per monocolture Astrocita poligonale. In breve, il metodo di MD comporta crescita cellule cerebrali misto nel siero fetale di vitello (FCS)-contenente DMEM, seguita da agitazione passaggi che arricchiscono per gli astrociti (come tutte le altre cellule di cervello tipi staccano dal piatto) e ulteriormente cultura sullo stesso supporto. DMEM completate con FCS è utilizzato per molti altri tipi di cellule, che vanno dai fibroblasti e adipociti a linee cellulari tumorali differenti, tutti condividono la morfologia poligonale esibita da astrociti MD nella cultura. Fino al primi anni 20007, piccolo pensiero era stato rilasciato ai media su misura per gli astrociti, in particolare per favorire la loro tipica morfologia stellare trovato in vivo. Un protocollo pubblicato nel 2011 raggiungere tale morfologia stellare: chiamato il metodo immunopanning, impiega medium senza siero, ottimizzato per la coltura di astrociti3. Utilizzando questo metodo, le cellule cerebrali di recente isolate sono esposti a una serie di piatti rivestiti con anticorpi destinati a proteine di superficie delle cellule di tipo-specific cella, per arricchire per gli astrociti. Nonostante il più in vivo-come profilo di morfologia ed espressione dei astrocytes immunopanned, la maggior parte degli studi in vitro si basa ancora sul metodo Astrocita MD. Il metodo di MD è semplice e veloce, mentre il metodo di immunopanning comprende più lunghe e complesse fasi il primo giorno della cultura (ad esempio lunghi periodi di digestione degli enzimi, attenta stratificazione delle soluzioni di diversa densità, immunopanning stesso, e diversi centrifugazione passi - tutto prima di placcatura). Tuttavia, utilizzando il mezzo più specializzato, il metodo AWESAM offre sia la velocità del metodo MD e lo in vivo-come la morfologia del protocollo immunopanning.
Nel complesso, il protocollo AWESAM è utile per studiare più in vivo-come astrociti in 2D monocolture isolate da neuroni e glia altri (come precedentemente caratterizzati4 immunostainings, immunoblots e sequenziamento di RNA). Esso consente lo studio dei processi astrocitari sottili e fornisce grande accessibilità per la visualizzazione di Ca2 + segnalazione spontanea ed eventi vicino la membrana (ad es., ripreso da microscopia TIRF).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="898">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">0.05% trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:171px;">Gibco</td>
			<td style="width:344px;">25300054</td>
			<td style="width:167px;">warm in 37 &#186;C waterbath before use</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.25% trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>warm in 37 &#186;C waterbath before use</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">B-27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>50X stock</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>100X stock</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicillin / streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td>50 stock; penicillin: 5000 U/ml; streptomycin: 5000 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>without L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HBEGF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>4643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14170112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">FCS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010049</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100 &#956;m nylon cell strainer</td>
			<td>BD</td>
			<td style="width:344px;">352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trypan Blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cell culture incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hera Cell 240i cell culture incubator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Laboratory shaker</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>Rotamax 120&#160;</td>
			<td>use inside cell culture incubator</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing in vivo-like murine astrocytes using the fast, simple, and inexpensive awesam protocol

Il AWESAM (un low-costo easy stellate unstrocyte metodo) protocollo comporta un modo veloce, semplice e poco costoso per generare grandi quantità di in vivo-piace monocolture di astrociti di topo e di ratto : Le cellule cerebrali possono essere isolate da diverse regioni del cervello, e dopo una settimana di coltura delle cellule, cellule non-astrocytic sono scrollate di dosso inserendo i piatti di cultura su un agitatore per 6 h nell'incubatrice. Gli astrociti rimanenti sono quindi attraversati in nuove piastre con un mezzo di Astrocita-specifici (chiamato NB + H). NB + H contiene basse concentrazioni di eparina-legante EGF-like growth factor (HBEGF), che viene utilizzato al posto del siero in mezzo. Dopo essere cresciuto in NB + H, gli astrociti AWESAM hanno una morfologia stellare e processi impercettibili e funzionalità. Inoltre, questi astrociti hanno più in vivo-come l'espressione genica di astrociti generati dai metodi precedentemente pubblicati. CA2 + imaging, dinamiche della vescicola e altri eventi vicino la membrana possono essere studiati così nello bene processi astrocytic in vitro, ad esempio, utilizzando cellule vive confocale o microscopia TIRF. In particolare, gli astrociti AWESAM inoltre esibiscono spontanea Ca2 + segnalazione simile a astrociti in vivo.

Gli astrociti che sono co-coltivati con i neuroni e sviluppati in NB + medium appaiono stellari dopo 2 settimane di cultura (Figura 2). Oltre a NB + medio, gli astrociti co-coltivati sono anche esposti a fattori sconosciuti del neurone-derivato che probabilmente contribuiscono alla loro sopravvivenza e la morfologia. Al contrario, gli astrociti MD coltivati in DMEM + come monocolture (dopo aver agitato fuori altri tipi di cella prima del passaggio) appaiono p...

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Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

Il protocollo AWESAM descritto qui è ottimo per la coltura di astrociti murini in isolamento da altre cellule del cervello in modo veloce, semplice ed economica. Gli astrociti AWESAM esibiscono spontanea Ca2 + segnalazione, morfologia e gene expression profili simili a astrociti in vivo.

Coltura In Vivo-piace murini astrociti utilizzando il protocollo AWESAM veloce, semplice e poco costoso

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

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