Name: culturing in vivo-like murine astrocytes using the fast, simple, and inexpensive awesam protocol
Uploaded: 2018-01-10T13:00:00
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我々 は、欧州研究評議会 (FP7/260916)、アレクサンダー ・ フォン ・ フンボルト ・財団 (Sofja Kovalevskaja) とドイツ研究振興協会 (DE1951 と SFB889) からの資金を認めます。

ここで説明したすべての動物実験は、ドイツの動物福祉に関する指針に従って行われました。
注: タイムラインとプロトコルの主な手順は図 1に示します。
1. 準備
<ol><li>
以下のソリューションを準備します。
	<ol>
<li>培養アストロ サイト MD 多角形の DMEM + 準備: 10 %fcs、100 U ペニシリン 100 μ g/mL ストレプトマイシ?...

<ol>
	<li>Puschmann, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactive+3D+cell+culture+system+minimizes+cellular+stress+and+maintains+the+in+vivo-like+morphological+complexity+of+astroglial+cells.">Bioactive 3D cell culture system minimizes cellular stress and maintains the in vivo-like morphological complexity of astroglial cells.</a> Glia. 61 (3), 432-440 (2013).</li><li>Puschmann, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HB-EGF+affects+astrocyte+morphology,+proliferation,+differentiation,+and+the+expression+of+intermediate+filament+proteins.">HB-EGF affects astrocyte morphology, proliferation, differentiation, and the expression of intermediate filament proteins.</a> J Neurochem. 128 (6), 878-889 (2014).</li><li>Foo, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+method+for+the+purification+and+culture+of+rodent+astrocytes.">Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes.</a> Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).</li><li>Wolfes, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+culturing+stellate+astrocytes+reveals+spatially+distinct+Ca2++signaling+and+vesicle+recycling+in+astrocytic+processes.">A novel method for culturing stellate astrocytes reveals spatially distinct Ca2+ signaling and vesicle recycling in astrocytic processes.</a> J Gen Physiol. 149 (4), (2016).</li><li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue.">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> J Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).</li><li>Krencik, R., Zhang, S. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+functional+astroglial+subtypes+from+human+pluripotent+stem+cells.">Directed differentiation of functional astroglial subtypes from human pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 6 (11), 1710-1717 (2011).</li><li>Morita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+regulation+of+calcium+oscillation+in+astrocytes+by+growth+factors+and+pro-inflammatory+cytokines+via+the+mitogen-activated+protein+kinase+cascade.">Dual regulation of calcium oscillation in astrocytes by growth factors and pro-inflammatory cytokines via the mitogen-activated protein kinase cascade.</a> J Neurosci. 23 (34), 10944-10952 (2003).</li><li>Saura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+cells+in+astroglial+cultures:+a+cautionary+note.">Microglial cells in astroglial cultures: a cautionary note.</a> J Neuroinflammation. 4, 26 (2007).</li><li>Raponi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S100B+expression+defines+a+state+in+which+GFAP-expressing+cells+lose+their+neural+stem+cell+potential+and+acquire+a+more+mature+developmental+stage.">S100B expression defines a state in which GFAP-expressing cells lose their neural stem cell potential and acquire a more mature developmental stage.</a> Glia. 55 (2), 165-177 (2007).</li><li>Royo, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+AAV+serotypes+stably+transduce+primary+hippocampal+and+cortical+cultures+with+high+efficiency+and+low+toxicity.">Specific AAV serotypes stably transduce primary hippocampal and cortical cultures with high efficiency and low toxicity.</a> Brain Res. 1190, 15-22 (2008).</li><li>Malarkey, E. B., Parpura, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+characteristics+of+vesicular+fusion+in+astrocytes:+examination+of+synaptobrevin+2-laden+vesicles+at+single+vesicle+resolution.">Temporal characteristics of vesicular fusion in astrocytes: examination of synaptobrevin 2-laden vesicles at single vesicle resolution.</a> J Physiol. 589, 4271-4300 (2011).</li><li>Zamanian, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+analysis+of+reactive+astrogliosis.">Genomic analysis of reactive astrogliosis.</a> J Neurosci. 2 (18), 6391-6410 (2012).</li><li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca(2+)+signaling+in+astrocytes+from+Ip3r2(-/-)+mice+in+brain+slices+and+during+startle+responses+in+vivo.">Ca(2+) signaling in astrocytes from Ip3r2(-/-) mice in brain slices and during startle responses in vivo.</a> Nat Neurosci. 18 (5), 708-717 (2015).</li><li>Shigetomi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+microdomains+within+entire+astrocyte+territories+and+endfeet+with+GCaMPs+expressed+using+adeno-associated+viruses.">Imaging calcium microdomains within entire astrocyte territories and endfeet with GCaMPs expressed using adeno-associated viruses.</a> J Gen Physiol. 141 (5), 633-647 (2013).</li><li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Transgenic+Mouse+Lines+for+Selectively+Targeting+Astrocytes+and+Studying+Calcium+Signals+in+Astrocyte+Processes+In+Situ+and+In+Vivo.">New Transgenic Mouse Lines for Selectively Targeting Astrocytes and Studying Calcium Signals in Astrocyte Processes In Situ and In Vivo.</a> Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).</li><li>Otsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+dynamics+in+astrocyte+processes+during+neurovascular+coupling.">Calcium dynamics in astrocyte processes during neurovascular coupling.</a> Nat Neurosci. 18 (2), 210-218 (2015).</li><li>Agarwal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+Opening+of+the+Mitochondrial+Permeability+Transition+Pore+Induces+Microdomain+Calcium+Transients+in+Astrocyte+Processes.">Transient Opening of the Mitochondrial Permeability Transition Pore Induces Microdomain Calcium Transients in Astrocyte Processes.</a> Neuron. 93 (3), 587-605 (2017).</li></ol>

プロトコル内で 4 つのステップが重要です: 1) 濃度の小さい増加が未熟な文化、例えばにつながることができますので、正確に 5 ng/ml、HBEGF 濃度を準備、10 ng/mL HBEGF は解除アストロ サイト4に区別組織または pH を変化でき、アストロ サイトの健康を阻害する細胞を含むソリューションで 2) 回避の泡3) 事前それなくメディア健康アストロ サイト; 成長温度と最適 pH を達...

アストロ サイト栄養サポート、血流、シナプス シグナルと可塑性の細胞間コミュニケーション - 薄いアストロ サイト プロセスの中心機構である脳機能に影響を与えます。ここで記述されている AWESAM プロトコルにより、ニューロンと、役に立つなど、異なる脳細胞間の多くの蛋白質とも Ca2 +シグナル伝達式が重なるため他のグリアからの干渉なしにこれらのプロセスに関する研究タイプ。さらに、このメソッドは、以前利用可能な技術の限界を克服します。体内特に私たちのプロトコルを提供します-形態 (薄膜プロセスと星状アストロ サイト) とクイック, 簡単, 遺伝子発現と安価な方法のようです。
細胞の形態、遺伝子発現、および他の多くの規制プロセスは環境によって直接影響します。培養皿の周囲の細胞も細胞が成長して媒体によって解放の要因を指します。アストロ サイト、HBEGF 以前星状の形態1を誘導するために報告されたが、解除アストロ サイト2を区別することが分かった。ただし、低濃度 HBEGF の後より生体内で生成するため使用された-アストロ サイトのように 2 つの異なるプロトコル3,4の RNA シーケンスで識別されます。さらに、アストロ サイトの形態変化4プロトコルに関係なく、ミディアムの組成: HBEGF の低濃度 Neurobasal 媒体 (例えば他の培地の成分中の星状のアストロ サイトを成長に最適です血清を含む DMEM) (さらに新鮮な immunopanning によって分離されたアストロ サイト) 多角形の細胞を作り出します。
AWESAM プロトコルは、アストロ サイト モノカルチャー4成長のための前の技術の欠点を克服します。アストロ モノカルチャーの成長のための前の技術次の欠点があります: は体内(MD 法) 星状アストロ サイト5; の特徴的な多角形の形態長さとプロトコル (3ヶ月誘導多能性幹細胞からアストロ サイトの準備と高価な成長因子を含む多くの試薬が必要です) のコスト6;少量の素材 (immunopanning 法)3アストロ サイトの解消の分化と 3 D マトリックス (Puschmannら) の要件1,2対照的に、AWESAM プロトコルを提供します:生体内で-形態 (薄膜プロセスと星状アストロ サイト); のような。迅速、簡単、および安価な方法;大量の素材。生体内最も-遺伝子発現 immunopanned と MD アストロ サイトと比較してのように。さらに、2 D の文化は、Ca2 +シグナル伝達と薄膜プロセスや膜に近いイベントをリサイクルの研究 (例えば、全反射型顕微鏡では不可能です 3 D 文化)。
MD 法は、1980年5、多角形のアストロ サイト モノカルチャーのシンプルで高速な手法を提供するの出版以来広く使用されています。簡単に言えば、MD 法を伴なう牛胎児血清 (FCS) の成長の混合脳細胞-(型デタッチお皿から他のすべての脳細胞) としてアストロ サイトを豊かにし、さらに同じ培地で培養する手順を揺れが続く、DMEM を含みます。DMEM FCS とは、線維芽細胞と脂肪細胞から異なるがん細胞、すべての共有の文化における MD アストロ サイトが出展した多角形の形態に至るまで他の多くの細胞型に使用されます。初期の 2000 年代の7時まで少し考えていたアストロ サイトに合わせたメディアに与え、彼らの典型的な星状の形態を支持する具体的にはin vivoを発見します。2011 年に公開された 1 つのプロトコルがこのような星状の形態を達成する: immunopanning メソッドが呼び出されると、それは無血清培地培養アストロ サイト3用に最適化を採用しています。このメソッドを使用して、新鮮な分離脳細胞料理アストロ サイトを豊かにするため、セルの型固有のセル表面蛋白質を対象とする抗体でコーティングのシリーズにさらされています。生体内でより多くにもかかわらず-immunopanned アストロ サイトの形態と発現プロファイルのような生体外の研究の大半は、まだ MD アストロ サイト メソッドに依存します。MD 法はシンプルかつ高速で、immunopanning メソッドは、文化の最初の日により複雑な時間のかかる手順を装備されている (長い酵素消化期間など別の密度、自体は、immunopanning の解の慎重なレイヤーといくつか遠心分離の手順 - めっき前にすべて)。しかしより専門的な媒体を使用して、AWESAM メソッド提供速度分子動力学法と生体内で-immunopanning プロトコルの形態のような。
全体的に、AWESAM プロトコルは生体内でより多くを学ぶ-(immunostainings、immunoblots、RNA シーケンス、以前特徴4 ) としてニューロンとグリア他から分離された 2次元模型林分におけるアストロ サイトのように。それシンのアストロ サイト プロセスの研究のためと自発的 Ca2 +シグナル伝達とイベント (例えば、全反射顕微鏡を用いたイメージング) 膜に近い可視化する偉大なアクセシビリティを提供できます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="898">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">0.05% trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:171px;">Gibco</td>
			<td style="width:344px;">25300054</td>
			<td style="width:167px;">warm in 37 &#186;C waterbath before use</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.25% trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>warm in 37 &#186;C waterbath before use</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">B-27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>50X stock</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>100X stock</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicillin / streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td>50 stock; penicillin: 5000 U/ml; streptomycin: 5000 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>without L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HBEGF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>4643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14170112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">FCS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010049</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100 &#956;m nylon cell strainer</td>
			<td>BD</td>
			<td style="width:344px;">352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trypan Blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cell culture incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hera Cell 240i cell culture incubator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Laboratory shaker</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>Rotamax 120&#160;</td>
			<td>use inside cell culture incubator</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing in vivo-like murine astrocytes using the fast, simple, and inexpensive awesam protocol

AWESAM (、 low-コストeasy stellate 、strocyte「ウィズダム) プロトコルは生体内での大量を生成する高速シンプルで、安価な方法を伴います-マウスおよびラットのグリア モノカルチャーのような: 脳細胞は異なる脳の領域から分離することができ、細胞培養の週後非アストロ サイト細胞はインキュベーターで 6 h のシェーカーに培養皿を置くことによって振り落とさ。残りのアストロ サイトが (NB + H と呼ばれる) アストロ サイト固有の培地で継代新しいプレートにし。NB + H には、低濃度培地に血清の代わりに使用されているヘパリン結合 EGF 様増殖因子 (HBEGF) にはが含まれています。NB + H で成長して後、AWESAM アストロ サイトがある星状の形態と機能の細かいプロセス。さらに、これらのアストロ サイトがより多く体内ある-アストロ サイト以前に発行されたメソッドで生成されたよりも遺伝子発現のように。Ca2 +イメージング、小胞ダイナミクスと細胞膜の近くに他のイベントは、罰金のアストロ サイト プロセスの in vitro、例えば、生きているセルの共焦点または全反射型顕微鏡を使用して研究できることは従って。特に、AWESAM アストロ サイトも示す自発的 Ca2 +シグナリング体内のアストロ サイトに似ています。

文化 (図 2) の 2 週間後の星状神経細胞と共培養、NB + 培地で成長しているアストロ サイトが表示されます。NB + 媒体に加えて、共培養アストロ サイトは彼らの生存と形態に貢献する可能性の高い未知のニューロン由来因子にさらされています。対照的に、(通路の前に他のセルタイプをふっ飛ばす) 後、DMEM + でモノカルチャーとして成長した MD ?...

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Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

ここで記述されている AWESAM プロトコルは、高速、簡単、かつ安価な方法で他の脳細胞から分離してマウスアストロを培養に最適です。AWESAM アストロ サイトを示す自発的 Ca2 +シグナリング、形態、遺伝子発現プロファイル体内のアストロ サイトに似ています。

生体内培養-高速、シンプルで、安価な AWESAM プロトコルを使用してマウスのアストロ サイトのように

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

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生体内培養-高速、シンプルで、安価な AWESAM プロトコルを使用してマウスのアストロ サイトのように

生体内培養-高速、シンプルで、安価な AWESAM プロトコルを使用してマウスのアストロサイトのように