Name: culturing in vivo-like murine astrocytes using the fast, simple, and inexpensive awesam protocol
Uploaded: 2018-01-10T13:00:00
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우리는 유럽 연구 위원회 (FP7/260916), 알렉산더 폰 훔볼트-재단 (Sofja Kovalevskaja), 그리고 도이치 가운데 (DE1951 및 SFB889)에서 자금을 인정 합니다.

여기에 설명 된 모든 동물 실험은 독일 동물 복지에 대 한 지침에 따라 수행 했다.
참고: 타임 라인 및 프로토콜의 주요 단계는 그림 1에서 그림.
1입니다. 준비
<ol><li>
다음과 같은 솔루션을 준비 합니다.
	<ol>
<li>DMEM + 다각형 MD 이다 경작에 대 한 준비: DMEM 10 %FCS 100 U 페니실린, 100 µ g/mL 스.</li>
		<li>NB + H 방사상 이다 경작...

<ol>
	<li>Puschmann, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactive+3D+cell+culture+system+minimizes+cellular+stress+and+maintains+the+in+vivo-like+morphological+complexity+of+astroglial+cells.">Bioactive 3D cell culture system minimizes cellular stress and maintains the in vivo-like morphological complexity of astroglial cells.</a> Glia. 61 (3), 432-440 (2013).</li><li>Puschmann, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HB-EGF+affects+astrocyte+morphology,+proliferation,+differentiation,+and+the+expression+of+intermediate+filament+proteins.">HB-EGF affects astrocyte morphology, proliferation, differentiation, and the expression of intermediate filament proteins.</a> J Neurochem. 128 (6), 878-889 (2014).</li><li>Foo, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+method+for+the+purification+and+culture+of+rodent+astrocytes.">Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes.</a> Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).</li><li>Wolfes, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+culturing+stellate+astrocytes+reveals+spatially+distinct+Ca2++signaling+and+vesicle+recycling+in+astrocytic+processes.">A novel method for culturing stellate astrocytes reveals spatially distinct Ca2+ signaling and vesicle recycling in astrocytic processes.</a> J Gen Physiol. 149 (4), (2016).</li><li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue.">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> J Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).</li><li>Krencik, R., Zhang, S. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+functional+astroglial+subtypes+from+human+pluripotent+stem+cells.">Directed differentiation of functional astroglial subtypes from human pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 6 (11), 1710-1717 (2011).</li><li>Morita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+regulation+of+calcium+oscillation+in+astrocytes+by+growth+factors+and+pro-inflammatory+cytokines+via+the+mitogen-activated+protein+kinase+cascade.">Dual regulation of calcium oscillation in astrocytes by growth factors and pro-inflammatory cytokines via the mitogen-activated protein kinase cascade.</a> J Neurosci. 23 (34), 10944-10952 (2003).</li><li>Saura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+cells+in+astroglial+cultures:+a+cautionary+note.">Microglial cells in astroglial cultures: a cautionary note.</a> J Neuroinflammation. 4, 26 (2007).</li><li>Raponi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S100B+expression+defines+a+state+in+which+GFAP-expressing+cells+lose+their+neural+stem+cell+potential+and+acquire+a+more+mature+developmental+stage.">S100B expression defines a state in which GFAP-expressing cells lose their neural stem cell potential and acquire a more mature developmental stage.</a> Glia. 55 (2), 165-177 (2007).</li><li>Royo, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+AAV+serotypes+stably+transduce+primary+hippocampal+and+cortical+cultures+with+high+efficiency+and+low+toxicity.">Specific AAV serotypes stably transduce primary hippocampal and cortical cultures with high efficiency and low toxicity.</a> Brain Res. 1190, 15-22 (2008).</li><li>Malarkey, E. B., Parpura, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+characteristics+of+vesicular+fusion+in+astrocytes:+examination+of+synaptobrevin+2-laden+vesicles+at+single+vesicle+resolution.">Temporal characteristics of vesicular fusion in astrocytes: examination of synaptobrevin 2-laden vesicles at single vesicle resolution.</a> J Physiol. 589, 4271-4300 (2011).</li><li>Zamanian, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+analysis+of+reactive+astrogliosis.">Genomic analysis of reactive astrogliosis.</a> J Neurosci. 2 (18), 6391-6410 (2012).</li><li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca(2+)+signaling+in+astrocytes+from+Ip3r2(-/-)+mice+in+brain+slices+and+during+startle+responses+in+vivo.">Ca(2+) signaling in astrocytes from Ip3r2(-/-) mice in brain slices and during startle responses in vivo.</a> Nat Neurosci. 18 (5), 708-717 (2015).</li><li>Shigetomi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+microdomains+within+entire+astrocyte+territories+and+endfeet+with+GCaMPs+expressed+using+adeno-associated+viruses.">Imaging calcium microdomains within entire astrocyte territories and endfeet with GCaMPs expressed using adeno-associated viruses.</a> J Gen Physiol. 141 (5), 633-647 (2013).</li><li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Transgenic+Mouse+Lines+for+Selectively+Targeting+Astrocytes+and+Studying+Calcium+Signals+in+Astrocyte+Processes+In+Situ+and+In+Vivo.">New Transgenic Mouse Lines for Selectively Targeting Astrocytes and Studying Calcium Signals in Astrocyte Processes In Situ and In Vivo.</a> Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).</li><li>Otsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+dynamics+in+astrocyte+processes+during+neurovascular+coupling.">Calcium dynamics in astrocyte processes during neurovascular coupling.</a> Nat Neurosci. 18 (2), 210-218 (2015).</li><li>Agarwal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+Opening+of+the+Mitochondrial+Permeability+Transition+Pore+Induces+Microdomain+Calcium+Transients+in+Astrocyte+Processes.">Transient Opening of the Mitochondrial Permeability Transition Pore Induces Microdomain Calcium Transients in Astrocyte Processes.</a> Neuron. 93 (3), 587-605 (2017).</li></ol>

프로토콜 내에서 4 단계는 중요: 1)를 준비 하 고 정확 하 게 5 ng/ml, HBEGF 농도 때문에 농도 있는 작은 증가 미 숙 문화, 예를 들어, 발생할 수 있습니다 10 ng/mL HBEGF 드 차별화 이다4; 조직 또는 pH를 변경 하 고 사이토 건강;을 방해 수 있는 셀을 포함 하는 솔루션 2) 피 거품 3) 전 평형 미디어 최적 pH 및 온도 성장 하는 건강 한 이다; (비록 아무 microglia AWESAM 문화에서 지금까지 발...

영양 지원, 혈액 흐름, 시 냅 스 신호 및 소성, 및 세포 통신-는 모두 얇은 astrocytic 프로세스 중심 메커니즘을 통해 뇌 기능에 영향을 이다. 여기에 설명 된 AWESAM 프로토콜을 사용 하는 유용한 예를 들어, 많은 단백질 및 심지어 캘리포니아2 + 신호 표현의 다른 뇌 세포에 걸쳐 다른 명과 뉴런에서 간섭 없이 이러한 프로세스의 연구 유형입니다. 또한,이 방법은 이전에 사용할 수 있는 기술의 한계 극복. 특히, 우리의 프로토콜 vivo에서제공-형태학 (방사상 이다 얇은 프로세스) 및 유전자 발현에 빨리, 쉽게, 그리고 저렴 한 방식으로 같은.
셀 형태, 유전자 발현, 그리고 다른 많은 규제 프로세스는 직접 환경에 의해 영향을 받습니다. 문화 접시에이 주변의 세포 뿐만 아니라 세포 재배 되 고 있는 매체에 의해 발표 하는 요소를 말합니다. 이다, HBEGF 방사상 형태로1 을 유도 하기 위해 이전에 보고 하지만 드 이다2를 차별화 하는 또한 발견 했다. 그러나, HBEGF의 낮은 농도 나중 더 vivo에서생성 하는 데 사용 했다-두 개의 서로 다른 프로토콜3,4RNA 시퀀싱을 통해 발견 이다 처럼. 또한, 사이토 형태학 프로토콜4에 중간 구성 변경: HBEGF의 낮은 농도와 Neurobasal 매체는 방사상 이다 (예를 들어, 다른 중간 작곡 하면서 성장을 위한 최적의 혈 청-포함 된 DMEM) (immunopanning에 의해 고립 된 갓 이다)에 다각형 세포를 생산.
AWESAM 프로토콜 사이토 monocultures4성장에 대 한 이전 방법의 단점을 극복 했다. 성장 하는 사이토 monocultures 이전 기술은 다음과 같은 단점이 있습니다: 방사상 이다에 vivo에서 (MD 방법)5;의 특성은 다각형 형태 길이 비용 (유도 만능 줄기 세포는 이다 3 개월을 준비 하며 고가의 성장 인자를 포함 하 여 많은 시 약) 프로토콜의6; 낮은 양의 재료 (immunopanning 방법)3; 이다의 탈 분화와 3D 매트릭스 (Puschmann 외.)의 요구 사항 1 , 2. AWESAM 프로토콜을 제공 하는 반면,: vivo에서-같은 형태 (얇은 프로세스와 방사상 이다); 빠른, 쉽게, 그리고 저렴 한 방법; 대량의 물자; 그리고 vivo에서가장-같은 비해 immunopanned 및 MD 이다 유전자 발현. 또한, 2D 문화 캘리포니아2 + 신호 및 얇은 프로세스, 고 막 가까이 이벤트 재활용 기의 연구에 대 한 수 있습니다 (예를 들어, TIRF 현미경 불가능 3D 문화에서).
MD 메서드는 19805, 다각형 사이토 monocultures는 간단 하 고 빠른 기술 제공에 그것의 간행물부터 광대 하 게 사용 되었습니다. 간단히, MD 메서드 수반 송아지 태아 혈 청 (FCS)에서 성장 혼합된 뇌 세포-(다른 모든 뇌 세포 유형을 분리 접시에서)로 이다에 대 한 풍부 하 고 더 동일한 매체에 문화 단계를 흔들어 뒤 DMEM, 포함 된. DMEM fcs 보충 fibroblasts 및 adipocytes에서 다른 암 세포 선, 모두의 공유 문화에서 MD 이다에 의해 전시 다각형 형태에 이르기까지 많은 다른 세포 유형, 사용 됩니다. 초기 2000 년대7까지 작은 생각 했던 특히 그들의 전형적인 방사상 형태를 선호 하 미디어 이다에 맞게 주어진 에 비보를 발견. 2011 년에 출판 한 프로토콜 같은 방사상 형태를 달성지 않습니다: 혈 청 자유로운 매체 이다3경작을 위해 최적화 된 사용 immunopanning 메서드를 호출. 이 메서드를 사용 하 여 갓 고립 된 뇌 세포는 대상 셀 형식 관련 세포 표면 단백질, 이다에 대 한 풍부 하 게 하는 항 체로 입힌 요리 시리즈에 노출 됩니다. 더는 비보에도 불구 하 고-immunopanned 이다의 형태와 식 프로필, 같은 생체 외에서 연구의 대다수는 여전히 MD 사이토 방법에 의존. MD 메서드는 간단 하 고 빠른, 문화의 첫 번째 날에 더 복잡 하 고 시간이 많이 걸리는 단계를 구성 하는 immunopanning 메서드 (더 이상 효소 소화 기간 등 다른 밀도, 자체, immunopanning 솔루션의 주의 레이어 링 및 여러 원심 분리 단계-모든 도금 하기 전에). 그러나, 보다 전문적인된 매체를 사용 하 여 AWESAM 메서드를 사용 하면 두 속도의 MD 메서드는 vivo에서제공-immunopanning 프로토콜의 형태 처럼.
전반적으로, AWESAM 프로토콜은 더 vivo에서공부 하는 데 유용-2D monocultures (immunostainings, immunoblots, 및 RNA 시퀀싱에 의해 이전 특징된4 )로 신경 및 다른 명과 격리에서 이다 처럼. 그것은 얇은 astrocytic 프로세스의 연구에 대 한 허용 하 고 자연 스러운 캘리포니아2 + 신호 (예를 들어, TIRF 현미경 검사 법에 의해 몇 군데) 막 가까이 이벤트 시각화를 위한 훌륭한 접근을 제공 합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="898">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">0.05% trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:171px;">Gibco</td>
			<td style="width:344px;">25300054</td>
			<td style="width:167px;">warm in 37 &#186;C waterbath before use</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.25% trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>warm in 37 &#186;C waterbath before use</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">B-27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>50X stock</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>100X stock</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicillin / streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td>50 stock; penicillin: 5000 U/ml; streptomycin: 5000 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>without L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HBEGF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>4643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14170112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">FCS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010049</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100 &#956;m nylon cell strainer</td>
			<td>BD</td>
			<td style="width:344px;">352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trypan Blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cell culture incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hera Cell 240i cell culture incubator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Laboratory shaker</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>Rotamax 120&#160;</td>
			<td>use inside cell culture incubator</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing in vivo-like murine astrocytes using the fast, simple, and inexpensive awesam protocol

AWESAM (는 low- e유도 stellate는 strocyte method 비용) 프로토콜 수반 vivo에서의 대량을 생성 하는 빠르고, 간단 하 고 저렴 한 방법-마우스와 쥐 사이토 monocultures 같은 : 뇌 세포는 서로 다른 뇌 영역에서 고립 될 수 있다 고 주 후에 세포 배양의, 비 astrocytic 셀 인큐베이터에 6 h에 대 한 통에 문화 요리를 배치 하 여 떨어져 동요는. 나머지 이다 (불리 NB + H) 사이토 관련 매체와 새로운 접시에 다음 passaged 있습니다. NB + H 혈 청 매체에 대신 사용 되는 헤 파 린 바인딩 EGF 같은 성장 인자 (HBEGF)의 낮은 농도 포함 합니다. NB + H, 성장 후 AWESAM 이다 방사상 형태와 기능은 괜 찮 프로세스 있다. 또한,이 이다 더 많은 비보에있다-같은 보다 이전에 게시 방법으로 생성 하는 이다 유전자 발현. 캘리포니아2 + 영상, 기 역학, 고 막 가까이 다른 이벤트 따라서 벌금 astrocytic 프로세스에서 생체 외에서 예를 들어, 라이브 셀 confocal 또는 TIRF 현미경을 사용 하 여 공부 될 수 있다. 특히, AWESAM 이다 또한 전시 자발적인 캘리포니아2 + 신호 이다에서 vivo에서유사한.

신경을 가진 공동 경작 하 고 NB + 매체에 성장 이다 문화 (그림 2)의 2 주 후 방사상 나타납니다. NB + 매체, 이외에 공동 경작된 이다 또한 아마 그들의 생존 및 형태학에 기여 하는 알 수 없는 신경 파생 된 요소에 노출 됩니다. 반면, 메릴랜드 이다 (후에 통과 하기 전에 다른 세포 유형 푸는) monocultures로 DMEM + 성장 다각형 2 주 후에 나타납니다. NB + H에?...

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Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

여기에 설명 된 AWESAM 프로토콜은 빠르고, 단순 하 고 저렴 한 방식으로 다른 뇌 세포 분리에서 murine 이다 경작에 최적입니다. AWESAM 이다 자발적인 캘리포니아2 + 신호, 형태학, 및 유전자 식 프로필 이다에서 vivo에서유사한 전시.

Vivo에서경작-Murine 이다 빠르고, 간단 하 고 저렴 한 AWESAM 프로토콜을 사용 하 여 같은

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

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연구

신경과학

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