Name: culturing in vivo-like murine astrocytes using the fast, simple, and inexpensive awesam protocol
Uploaded: 2018-01-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol at JoVE.com

Reconocemos que la financiación del Consejo Europeo de investigación (FP7/260916), Alexander von Humboldt-Stiftung (Sofja Kovalevskaja) y la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DE1951 y SFB889).

Todos los experimentos con animales descritos aquí fueron realizados siguiendo las directrices para el bienestar animal alemán.
Nota: El cronograma y pasos principales del Protocolo se ilustran en la figura 1.
1. preparaciones
<ol><li>
Preparar las siguientes soluciones.
	<ol>
<li>Preparar DMEM + cultivo poligonales astrocitos MD: DMEM con 10% FCS, 100 de U de penicilina y 100 de μg/mL estreptomicina.</li>
		<li>Pr...

<ol>
	<li>Puschmann, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactive+3D+cell+culture+system+minimizes+cellular+stress+and+maintains+the+in+vivo-like+morphological+complexity+of+astroglial+cells.">Bioactive 3D cell culture system minimizes cellular stress and maintains the in vivo-like morphological complexity of astroglial cells.</a> Glia. 61 (3), 432-440 (2013).</li><li>Puschmann, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HB-EGF+affects+astrocyte+morphology,+proliferation,+differentiation,+and+the+expression+of+intermediate+filament+proteins.">HB-EGF affects astrocyte morphology, proliferation, differentiation, and the expression of intermediate filament proteins.</a> J Neurochem. 128 (6), 878-889 (2014).</li><li>Foo, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+method+for+the+purification+and+culture+of+rodent+astrocytes.">Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes.</a> Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).</li><li>Wolfes, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+culturing+stellate+astrocytes+reveals+spatially+distinct+Ca2++signaling+and+vesicle+recycling+in+astrocytic+processes.">A novel method for culturing stellate astrocytes reveals spatially distinct Ca2+ signaling and vesicle recycling in astrocytic processes.</a> J Gen Physiol. 149 (4), (2016).</li><li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue.">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> J Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).</li><li>Krencik, R., Zhang, S. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+functional+astroglial+subtypes+from+human+pluripotent+stem+cells.">Directed differentiation of functional astroglial subtypes from human pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 6 (11), 1710-1717 (2011).</li><li>Morita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+regulation+of+calcium+oscillation+in+astrocytes+by+growth+factors+and+pro-inflammatory+cytokines+via+the+mitogen-activated+protein+kinase+cascade.">Dual regulation of calcium oscillation in astrocytes by growth factors and pro-inflammatory cytokines via the mitogen-activated protein kinase cascade.</a> J Neurosci. 23 (34), 10944-10952 (2003).</li><li>Saura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+cells+in+astroglial+cultures:+a+cautionary+note.">Microglial cells in astroglial cultures: a cautionary note.</a> J Neuroinflammation. 4, 26 (2007).</li><li>Raponi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S100B+expression+defines+a+state+in+which+GFAP-expressing+cells+lose+their+neural+stem+cell+potential+and+acquire+a+more+mature+developmental+stage.">S100B expression defines a state in which GFAP-expressing cells lose their neural stem cell potential and acquire a more mature developmental stage.</a> Glia. 55 (2), 165-177 (2007).</li><li>Royo, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+AAV+serotypes+stably+transduce+primary+hippocampal+and+cortical+cultures+with+high+efficiency+and+low+toxicity.">Specific AAV serotypes stably transduce primary hippocampal and cortical cultures with high efficiency and low toxicity.</a> Brain Res. 1190, 15-22 (2008).</li><li>Malarkey, E. B., Parpura, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+characteristics+of+vesicular+fusion+in+astrocytes:+examination+of+synaptobrevin+2-laden+vesicles+at+single+vesicle+resolution.">Temporal characteristics of vesicular fusion in astrocytes: examination of synaptobrevin 2-laden vesicles at single vesicle resolution.</a> J Physiol. 589, 4271-4300 (2011).</li><li>Zamanian, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+analysis+of+reactive+astrogliosis.">Genomic analysis of reactive astrogliosis.</a> J Neurosci. 2 (18), 6391-6410 (2012).</li><li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca(2+)+signaling+in+astrocytes+from+Ip3r2(-/-)+mice+in+brain+slices+and+during+startle+responses+in+vivo.">Ca(2+) signaling in astrocytes from Ip3r2(-/-) mice in brain slices and during startle responses in vivo.</a> Nat Neurosci. 18 (5), 708-717 (2015).</li><li>Shigetomi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+microdomains+within+entire+astrocyte+territories+and+endfeet+with+GCaMPs+expressed+using+adeno-associated+viruses.">Imaging calcium microdomains within entire astrocyte territories and endfeet with GCaMPs expressed using adeno-associated viruses.</a> J Gen Physiol. 141 (5), 633-647 (2013).</li><li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Transgenic+Mouse+Lines+for+Selectively+Targeting+Astrocytes+and+Studying+Calcium+Signals+in+Astrocyte+Processes+In+Situ+and+In+Vivo.">New Transgenic Mouse Lines for Selectively Targeting Astrocytes and Studying Calcium Signals in Astrocyte Processes In Situ and In Vivo.</a> Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).</li><li>Otsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+dynamics+in+astrocyte+processes+during+neurovascular+coupling.">Calcium dynamics in astrocyte processes during neurovascular coupling.</a> Nat Neurosci. 18 (2), 210-218 (2015).</li><li>Agarwal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+Opening+of+the+Mitochondrial+Permeability+Transition+Pore+Induces+Microdomain+Calcium+Transients+in+Astrocyte+Processes.">Transient Opening of the Mitochondrial Permeability Transition Pore Induces Microdomain Calcium Transients in Astrocyte Processes.</a> Neuron. 93 (3), 587-605 (2017).</li></ol>

Cuatro pasos en el protocolo son fundamentales: 1) preparar la concentración HBEGF y precisamente 5 ng/mL, ya que pequeños incrementos en la concentración pueden conducir a las culturas inmaduras, por ejemplo, 10 ng/mL HBEGF se diferenciará los astrocitos4; 2) evita burbujas en las soluciones que contienen tejido o células, que pueden cambiar el pH e impiden salud astrositos; 3) equilibrando los medios para alcanzar el pH óptimo y la temperatura para el cultivo de astrocitos sanos; ...

Los astrocitos influyen en función cerebral a través de soporte trófico, flujo sanguíneo, señalización sináptica y plasticidad y comunicación intercelular - todos los cuales son mecanismos que se centran en los procesos astrocytic finos. El protocolo AWESAM se describe aquí permite el estudio de estos procesos sin la interferencia de las neuronas y otros glía, que es útil por ejemplo, porque la expresión de muchas proteínas y Ca2 + señalización incluso se superponen en células cerebrales diferentes tipos. Además, este método supera limitaciones de las técnicas previamente disponibles. En particular, nuestro protocolo proporciona en vivo-como morfología (astrocitos estrellados con procesos finos) y expresión génica en un quick, easy y manera barata.
Morfología celular, expresión génica y muchos otros procesos normativos están directamente influenciadas por el medio ambiente. En una placa de cultivo, esto se refiere a factores liberados por las células circundantes, sino también el medio en que crecen las células. Por astrocitos, HBEGF fue divulgado previamente para inducir una morfología radiada1 pero también fue encontrado para diferenciar de astrocitos2. Sin embargo, concentraciones más bajas de HBEGF fueron utilizadas más adelante para generar más en vivo-como astrocitos identificados a través de la secuencia de RNA en dos protocolos diferentes de3,4. Por otra parte, cambios de morfología de astrositos con la composición del medio, sin importar el protocolo4: Neurobasal medio con una concentración baja de HBEGF es óptimo para el cultivo de astrocitos estrellados, mientras que otras composiciones medianas (p. ej., suero que contienen DMEM) producen las células poligonales (incluso en los astrocitos recién aislados por immunopanning).
El protocolo AWESAM supera los inconvenientes de las técnicas anteriores para el crecimiento de los monocultivos de astrositos4. Las técnicas anteriores para el crecimiento de los monocultivos de astrositos tienen las siguientes desventajas: morfología poligonal, que es poco característica de astrocitos estrellados en vivo (método de MD)5; la longitud y el costo del Protocolo (preparación de astrocitos de células madre pluripotentes inducidas se lleva tres meses y requiere de muchos reactivos, incluyendo costosos factores de crecimiento)6; las bajas cantidades de material (método immunopanning)3; y la la diferenciación de astrocitos y el requisito de una matriz 3D (Puschmann et al.) 1 , 2. en contraste, el protocolo AWESAM proporciona: en vivo-como morfología (astrocitos estrellados con procesos finos); una rápida, fácil y barato método; grandes cantidades de material; y más en vivo-como la expresión del gen en comparación con immunopanned y astrocitos MD. Además, cultura 2D permite el estudio de Ca2 + señalización y reciclaje en los procesos de finos y en eventos cerca de la membrana de la vesícula (por ejemplo, microscopía TIRF no es posible en las culturas 3D).
El método de MD se ha utilizado extensivamente desde su publicación en 19805, ofreciendo una técnica simple y rápida para monocultivos de astrositos poligonal. En Resumen, el método MD exige creciente neuronas mezclado en el suero fetal de ternero (FCS)-que contienen DMEM, siguió agitando pasos que enriquecen de astrocitos (como todas las otras células cerebrales tipos separan del plato) y más de la cultura en el mismo medio. DMEM suplementado con FCS se utiliza para muchos otros tipos de células, que van desde fibroblastos y adipocitos a líneas celulares de cáncer diferentes, todos los cuales comparten la morfología poligonal exhibida por astrocitos MD en la cultura. Hasta el temprano 2000s7, poco pensamiento había sido dado a los medios de comunicación a la medida de los astrocitos, específicamente a favor de su típica morfología radiada encontrado en vivo. Un protocolo publicado en 2011 alcanzar tal morfología radiada: llama al método immunopanning, emplea medio libre de suero optimizado para el cultivo de astrocitos3. Usando este método, las células cerebrales recién aislados están expuestas a una serie de platos recubiertos con anticuerpos que atacan células específicas del tipo celular proteínas de la superficie, para enriquecer por astrocitos. A pesar de más en vivo-como perfil morfología y expresión de immunopanned astrocitos, la mayoría de los estudios en vitro todavía dependen del método de astrositos MD. El método de la MD es sencillo y rápido, mientras que el método immunopanning compone de pasos más complejo y desperdiciador de tiempo en el primer día de la cultura (como períodos de digestión enzimática, y cuidado de soluciones de diferentes densidades, immunopanning, y varios centrifugación pasos - todo antes de placas). Sin embargo, utilizando el medio más especializado, el método AWESAM ofrece tanto la velocidad del método de la MD y la en vivo-como morfología del protocolo immunopanning.
En general, el protocolo AWESAM es útil para estudiar más en vivo-como astrocytes en 2D monocultivos aislados de neuronas y glia de otros (como previamente caracterizados4 immunostainings, immunoblots y secuenciación del RNA). Permite el estudio de los procesos astrocytic finos y proporciona gran accesibilidad para la visualización de eventos cerca de la membrana (e.g., reflejada por microscopía TIRF) y Ca2 + señalización espontánea.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="898">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">0.05% trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:171px;">Gibco</td>
			<td style="width:344px;">25300054</td>
			<td style="width:167px;">warm in 37 &#186;C waterbath before use</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.25% trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>warm in 37 &#186;C waterbath before use</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">B-27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>50X stock</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>100X stock</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicillin / streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td>50 stock; penicillin: 5000 U/ml; streptomycin: 5000 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>without L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HBEGF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>4643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14170112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">FCS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010049</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100 &#956;m nylon cell strainer</td>
			<td>BD</td>
			<td style="width:344px;">352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trypan Blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cell culture incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hera Cell 240i cell culture incubator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Laboratory shaker</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>Rotamax 120&#160;</td>
			<td>use inside cell culture incubator</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing in vivo-like murine astrocytes using the fast, simple, and inexpensive awesam protocol

El AWESAM (una low-costo easy stellate unstrocyte mmétodo) protocolo supone una forma rápida, sencilla y barata para generar grandes cantidades de en vivo-como los monocultivos de astrositos de ratón y rata : Las células cerebrales pueden ser aisladas de regiones diferentes del cerebro, y después de una semana de la cultura de célula, las células no astrocíticos son sacudidas colocando los platos de la cultura en un agitador por 6 horas en la incubadora. Los astrocitos restantes son entonces pasados en nuevas placas con un medio específico de astrositos (llamado NB + H). NB + H contiene bajas concentraciones de heparina EGF-como factor de crecimiento (HBEGF), que se utiliza en lugar de suero en el medio. Después de crecer en NB + H, los astrocitos AWESAM tienen una morfología radiada y procesos fina característica. Por otra parte, los astrocitos tienen más en vivo-como la expresión del gen de astrocitos generados por métodos previamente publicados. CA2 + la proyección de imagen, dinámica de la vesícula y otros eventos cerca de la membrana se pueden estudiar así en los procesos astrocytic bien en vitro, por ejemplo, usando células vivas confocal o microscopía TIRF. En particular, los astrocitos AWESAM también exhiben espontánea Ca2 + señalización similares a los astrocitos en vivo.

Astrocitos que son cultivados junto con las neuronas y crecidos en medio de NB + aparecen estrellados después de 2 semanas de la cultura (figura 2). Además de NB + medio, los astrocitos cultivados conjuntamente también están expuestos a factores desconocidos derivados de neurona que probablemente contribuyen a su supervivencia y su morfología. En contraste, los astrocitos MD cultivados en DMEM + como monocultivos (después de la agitación de otros tipos...

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Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

El protocolo AWESAM descrito aquí es óptimo para el cultivo de astrocitos murinos en aislamiento de otras células del cerebro de una manera rápida, sencilla y de bajo costo. Los astrocitos AWESAM exhibición espontáneo Ca2 + señalización, morfología y gene expresión perfiles similares a los astrocitos en vivo.

Cultivo In Vivo-como astrocitos murinos mediante el protocolo AWESAM rápido, sencillo y barato

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

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