Name: profiling anti-neu5gc igg in human sera with a sialoglycan microarray assay
Uploaded: 2017-07-13T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Profiling Anti-Neu5Gc IgG in Human Sera with a Sialoglycan Microarray Assay at JoVE.com

この研究は、イスラエル癌研究基金のResearch Career Development Award、Israeli National Nanotechnology Initiativeの助成金、Personalized Theranostics（VP-K）のNanomedicinesに関するFocal Technology AreaのHelmsley Charitable Trust、およびNational健康教育機関R01GM076360（XCへ）。

ヒト血清サンプルはイスラエル血液銀行から入手し、ヘルシンキ宣言およびTel Aviv University Institutional Review Boardに従って使用した。 アレイ製造計画とレイアウト<ol><li>スライドのレイアウトを決定します。 注：各スライドには、16個の同一のブロックB1〜B16（ 図1B 、 補足図1A ）に分割された16個のサブアレイが含まれています。 </l...

<ol>
	<li>Padler-Karavani, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aiming+at+the+sweet+side+of+cancer:+Aberrant+glycosylation+as+possible+target+for+personalized-medicine.">Aiming at the sweet side of cancer: Aberrant glycosylation as possible target for personalized-medicine.</a> Cancer Lett. 352 (1), 102-112 (2014).</li><li>Amon, R., Reuven, E. M., Leviatan Ben-Arye, ., Padler-Karavani, S., V, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycans+in+immune+recognition+and+response.">Glycans in immune recognition and response.</a> Carbohydr Res. 389, 115-122 (2014).</li><li>H&#228;uselmann, I., Borsig, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+tumor-cell+glycosylation+promotes+metastasis.">Altered tumor-cell glycosylation promotes metastasis.</a> Front Oncol. 4, (2014).</li><li>Tangvoranuntakul, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+uptake+and+incorporation+of+an+immunogenic+nonhuman+dietary+sialic+acid.">Human uptake and incorporation of an immunogenic nonhuman dietary sialic acid.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100 (21), 12045-12050 (2003).</li><li>Bardor, M., Nguyen, D. H., Diaz, S., Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+uptake+and+incorporation+of+the+non-human+sialic+acid+N-glycolylneuraminic+acid+into+human+cells.">Mechanism of uptake and incorporation of the non-human sialic acid N-glycolylneuraminic acid into human cells.</a> J Biol Chem. 280 (6), 4228-4237 (2005).</li><li>Padler-Karavani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+in+specificity,+abundance,+and+composition+of+anti-Neu5Gc+antibodies+in+normal+humans:+potential+implications+for+disease.">Diversity in specificity, abundance, and composition of anti-Neu5Gc antibodies in normal humans: potential implications for disease.</a> Glycobiology. 18 (10), 818-830 (2008).</li><li>Padler-Karavani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+xeno-autoantibodies+against+a+non-human+sialic+acid+serve+as+novel+serum+biomarkers+and+immunotherapeutics+in+cancer.">Human xeno-autoantibodies against a non-human sialic acid serve as novel serum biomarkers and immunotherapeutics in cancer.</a> Cancer Res. 71 (9), 3352-3363 (2011).</li><li>Cao, H., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+consideration+on+sialic+acid+chemistry.">General consideration on sialic acid chemistry.</a> Methods Mol Biol. 808, 31-56 (2012).</li><li>Deng, L., Chen, X., Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploration+of+sialic+Acid+diversity+and+biology+using+sialoglycan+microarrays.">Exploration of sialic Acid diversity and biology using sialoglycan microarrays.</a> Biopolymers. 99 (10), 650-665 (2013).</li><li>Liang, C. H., Hsu, C. H., Wu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sialoside+Arrays:+New+Synthetic+Strategies+and+Applications.">Sialoside Arrays: New Synthetic Strategies and Applications.</a> Top Curr Chem. 367, 125-149 (2015).</li><li>Song, X., Heimburg-Molinaro, J., Smith, D. F., Cummings, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycan+microarrays+of+fluorescently-tagged+natural+glycans.">Glycan microarrays of fluorescently-tagged natural glycans.</a> Glycoconj J. 32 (7), 465-473 (2015).</li><li>Muthana, S. M., Gildersleeve, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycan+microarrays:+powerful+tools+for+biomarker+discovery.">Glycan microarrays: powerful tools for biomarker discovery.</a> Cancer Biomark. 14 (1), 29-41 (2014).</li><li>Rillahan, C. D., Paulson, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycan+microarrays+for+decoding+the+glycome.">Glycan microarrays for decoding the glycome.</a> Annu Rev Biochem. 80, 797-823 (2011).</li><li>Heimburg-Molinaro, J., Song, X., Smith, D. F., Cummings, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+analysis+of+glycan+microarrays.">Preparation and analysis of glycan microarrays.</a> Curr Protoc Protein Sci. 12 (10), (2011).</li><li>Park, S., Gildersleeve, J. C., Blixt, O., Shin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbohydrate+microarrays.">Carbohydrate microarrays.</a> Chem Soc Rev. 42 (10), 4310-4326 (2013).</li><li>Struwe, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+minimum+information+required+for+a+glycomics+experiment+(MIRAGE)+project:+sample+preparation+guidelines+for+reliable+reporting+of+glycomics+datasets.">The minimum information required for a glycomics experiment (MIRAGE) project: sample preparation guidelines for reliable reporting of glycomics datasets.</a> Glycobiology. 26 (9), 907-910 (2016).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+minimum+information+required+for+a+glycomics+experiment+(MIRAGE)+project:+improving+the+standards+for+reporting+glycan+microarray-based+data.">The minimum information required for a glycomics experiment (MIRAGE) project: improving the standards for reporting glycan microarray-based data.</a> Glycobiology. , (2016).</li><li>Hara, S., Yamaguchi, M., Takemori, Y., Furuhata, K., Ogura, H., Nakamura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+mono-O-acetylated+N-acetylneuraminic+acids+in+human+and+rat+sera+by+fluorometric+high-performance+liquid+chromatography.">Determination of mono-O-acetylated N-acetylneuraminic acids in human and rat sera by fluorometric high-performance liquid chromatography.</a> Anal Biochem. 179 (1), 162-166 (1989).</li><li>Padler-Karavani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-comparison+of+protein+recognition+of+sialic+acid+diversity+on+two+novel+sialoglycan+microarrays.">Cross-comparison of protein recognition of sialic acid diversity on two novel sialoglycan microarrays.</a> J Biol Chem. 287 (27), 22593-22608 (2012).</li><li>Padler-Karavani, V., Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+impact+of+the+non-human+sialic+acid+N-glycolylneuraminic+acid+on+transplant+rejection+risk.">Potential impact of the non-human sialic acid N-glycolylneuraminic acid on transplant rejection risk.</a> Xenotransplantation. 18 (1), 1-5 (2011).</li><li>Samraj, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+red+meat-derived+glycan+promotes+inflammation+and+cancer+progression.">A red meat-derived glycan promotes inflammation and cancer progression.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 112 (2), 542-547 (2015).</li><li>Pearce, O. M., L&#228;ubli, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sialic+acids+in+cancer+biology+and+immunity.">Sialic acids in cancer biology and immunity.</a> Glycobiology. 26 (2), 111-128 (2016).</li><li>Alisson-Silva, F., Kawanishi, K., Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+risk+of+diseases+associated+with+red+meat+intake:+Analysis+of+current+theories+and+proposed+role+for+metabolic+incorporation+of+a+non-human+sialic+acid.">Human risk of diseases associated with red meat intake: Analysis of current theories and proposed role for metabolic incorporation of a non-human sialic acid.</a> Mol Aspects Med. 51, 16-30 (2016).</li><li>Pearce, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inverse+hormesis+of+cancer+growth+mediated+by+narrow+ranges+of+tumor-directed+antibodies.">Inverse hormesis of cancer growth mediated by narrow ranges of tumor-directed antibodies.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 111 (16), 5998-6003 (2014).</li><li>Pham, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+novel+human-specific+xeno-auto-antibody+response+against+vascular+endothelium.">Evidence for a novel human-specific xeno-auto-antibody response against vascular endothelium.</a> Blood. 114 (25), 5225-5235 (2009).</li><li>Reuven, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+immunogenic+Neu5Gc+in+bioprosthetic+heart+valves.">Characterization of immunogenic Neu5Gc in bioprosthetic heart valves.</a> Xenotransplantation. 23 (5), 381-392 (2016).</li><li>Ghaderi, D., Taylor, R. E., Padler-Karavani, V., Diaz, S., Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+of+the+presence+of+N-glycolylneuraminic+acid+in+recombinant+therapeutic+glycoproteins.">Implications of the presence of N-glycolylneuraminic acid in recombinant therapeutic glycoproteins.</a> Nat Biotechnol. 28 (8), 863-867 (2010).</li></ol>

成功したグリカンマイクロアレイ作製には注意深い計画が必要であり、プロトコルにいくつかの重要なステップが含まれています。これらは、（1）すべての後続のパラメータ（ 例えば、距離、間隔、サンプルの量、および印刷）を定義ブロックおよびプレートのレイアウトを計画します。 （2）ピンの清掃およびピンの完全性の確保。これはスポットの均質性を制御するために重要で...

Siasは、脊椎動物の細胞表面糖タンパク質および糖脂質上のグリカン鎖を覆う酸性糖である。 SIA発現は、癌細胞1に変更し、進行および/または転移2,3と相関されます。哺乳類における主要なシアル酸の形の二つはNeu5Acで、そのヒドロキシル形、Neu5Gcを2です。ヒトは、CMAH酵素をコードする遺伝子の特異的不活性化のためにNeu5Gcを合成することができない。この非人間シアル酸は、代謝、食事のNeu5Gcが豊富な食品（ 例えば、赤肉）4、5から「自己」発信されたものとして、人間の細胞に組み込まれています。 Neu5Gcは、ヒト上皮および内皮の細胞表面上に低レベルで存在するが、特に癌腫に蓄積する。 Neu5Gcは、ヒト体液性免疫系2,6によって異物として認識されます。Neu5Gcグリカンの抗原複雑さは、すべての人間6における抗のNeu5Gc抗体応答の複雑さによって反射された、のNeu5Gc修正、結合、基礎となるグリカン及び足場、およびそれらの濃度を含む複数のレベルで生じ得ます。これらの抗体の一部は、癌腫バイオマーカーおよび潜在的な免疫療法剤として役立つ7 。異なるsialoglycans 8の化学酵素合成の出現は、グリカンマイクロアレイ技術9、10の使用によって容易にそのような抗体のより詳細な分析のために道を開きました。このように、天然および合成炭水化物の大きなライブラリーの促進準備と操作で、グリカンマイクロアレイは、生体分子10、11の無数と炭水化物の相互作用を調査するための強力なハイスループット技術となっています</sup&gt; 12、13。アレイ形式では、最小限の量の材料が使用され、生物学的に関連するグリカンのこの多価ディスプレイは、単一の実験において数千の結合相互作用の調査を可能にする。重要なことは、この技術はまた、バイオマーカー探索へと様々なサンプル7、12で免疫応答をモニタリングに適用することができます。 成功したグリカンマイクロアレイ作製には、プリンターロボットタイプ、グリカンコンジュゲーション化学、および検出光学系という3つの重要な側面を考慮する必要があります。印刷装置の考察に関しては、接触型および非接触型の2つの技術が利用可能である。接触印刷では、1〜48個のスチールピンを、グリカン溶液を含むマルチウエル源プレートに浸漬し、ガラススライド表面に直接接触させることにより官能化ガラススライド上にスポットする。解の量deスライドに生きているのは、スライド表面上の持続時間の関数である。通常、試料はスライド表面に印刷される前にガラスブロック上に先ず予めスポットされ（均質なスポットに到達する）。非接触プリンタ（ 例えば、圧電式プリンタ）では、制御された電気信号を用いてグリカンをガラスキャピラリから印刷する。電気信号は、接触印刷に比べてより正確な印刷を達成するために細かく較正することができる。スポットのサイズおよび形態も比較的均一である。さらなる利点は、印刷後にサンプルをソースプレートに再循環させることである。それにもかかわらず、ピエゾ電子式プリンタの主な欠点は、印刷チップの制限（4または8）であり、スライドの安定性、温度、湿度およびサンプルの蒸発に特に注意する必要がある非常に長い印刷時間をもたらす。非接触型インクジェットプリンタは、より大きなサンプル体積14を必要とする。 <p class = &quot;jove_content&quot;&gt;印刷法の利用可能なオプションが限られているのに対して、グリカン結合化学はより複雑な選択肢であり、選択肢は数多くあります。選択された固定化化学は、グリカン上の活性基および摺動表面反応性の両方を考慮しなければならない。特定のマイクロアレイ表面上に固定化されるグリカンは、合成的に合成されるかまたは天然に単離されるかのいずれも、同一の反応基を必要とする。さらに、グリカンは純粋で均質である必要があります。一方、固定化表面および化学物質は、再現性および信頼性のある付着密度を提供すべきである。複数の固定化方法は、共有結合または非共有結合（物理吸着）アタッチメント10、11、12、13のいずれかを用いて開発されてきました。 Uninitiateのための印刷されたグリカンマイクロアレイ技術に関する詳細な情報についてはDの研究者は、これらの優れたレビューは13、15を参照してください。重要なのは、グライコミクス実験（MIRAGE）イニシアチブのための最近の最低限必要な情報は、サンプル調製16のためにと、この成長分野で基準を改善するために17を解析し、糖鎖マイクロアレイからのデータを報告するためのガイドラインを説明します。 ここでは、特定の接触ナノプリンターを用いて16ウェルフォーマットでシアログリカンマイクロアレイを作製するための詳細なプロトコールについて説明する。各グリカンは、エポキシ活性化ガラススライドへのそれらの共有結合を媒介する第一級アミンを有する。我々はまた、様々なヒト血清サンプル、抗体、およびSia結合性植物レクチンを用いた1つのスライドの開発および分析について記載する。 Sialoglycanマイクロアレイアッセイは、アレイ作製、プロセシング、展開、および分析を含むいくつかの主要なステップを含む。アレイの製造には、arグリカンおよびソースプレートの準備、ナノプリンターのプログラミング、およびスライドの印刷を行うことができます。続いて、スライドを処理し、開発し、分析する（ 図1 ）。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1205">
	<tbody>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:269px;">Primary-amine containing sialoglycans</td>
			<td style="width:235px;">Glycohub, Inc., Davis, CA, USA (http://www.glycohub.com/services)</td>
			<td style="width:227px;">Contact info@glycohubusa.com for compound requests</td>
			<td style="width:476px;">Printed glycans</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Monosodium phosphate monohydrate</td>
			<td style="width:235px;">Sigma</td>
			<td style="width:227px;">S9638</td>
			<td style="width:476px;">Printing buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Disodium phosphate heptahydrate</td>
			<td style="width:235px;">Sigma</td>
			<td style="width:227px;">S9390</td>
			<td style="width:476px;">Printing buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:235px;">Hy-Labs</td>
			<td style="width:227px;">BP-507/500D</td>
			<td style="width:476px;">Printing buffer/ incubation/washing buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Tris-base</td>
			<td style="width:235px;">Sigma</td>
			<td style="width:227px;">T1503</td>
			<td style="width:476px;">Slide blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Glycerol</td>
			<td style="width:235px;">Sigma</td>
			<td style="width:227px;">G-7893</td>
			<td style="width:476px;">Printing buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Ethanolamine</td>
			<td style="width:235px;">Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td style="width:227px;">0700/08</td>
			<td style="width:476px;">Slide blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Ovalbumin (Grade V)</td>
			<td style="width:235px;">Sigma</td>
			<td style="width:227px;">A5503</td>
			<td style="width:476px;">Slide Blocking protein</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Tween-20</td>
			<td style="width:235px;">Sigma</td>
			<td style="width:227px;">P7949</td>
			<td style="width:476px;">Slide washing detergent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Alexa 555-Hydrazide</td>
			<td style="width:235px;">Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td style="width:227px;">A20501MP</td>
			<td style="width:476px;">Marker on array</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">ChromPure Human IgG, whole molecule</td>
			<td style="width:235px;">Jackson Immunoresearch</td>
			<td style="width:227px;">009-000-003</td>
			<td style="width:476px;">Printing component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Biotinylated- SNA</td>
			<td style="width:235px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:227px;">B-1305</td>
			<td style="width:476px;">Plant Lectin &#8211; binding Sia-alpha2&#8211;6-linked</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Biotinylated-MALII</td>
			<td style="width:235px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:227px;">B-1265</td>
			<td style="width:476px;">Plant Lectin &#8211; binding Sia-alpha2&#8211;3-linked</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Chicken-anti Neu5Gc IgY</td>
			<td style="width:235px;">BioLegend</td>
			<td style="width:227px;">146903</td>
			<td style="width:476px;">Primary detection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Cy3-Streptavidin</td>
			<td style="width:235px;">Jackson Immunoresearch</td>
			<td style="width:227px;">016-160-0848</td>
			<td style="width:476px;">Biotin binding</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Cy3-anti Human IgG</td>
			<td style="width:235px;">Jackson Immunoresearch</td>
			<td style="width:227px;">109-165-088</td>
			<td style="width:476px;">Secondary detection against human IgG</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Cy3-anti Chicken IgY</td>
			<td style="width:235px;">Jackson Immunoresearch</td>
			<td style="width:227px;">703-165-155</td>
			<td style="width:476px;">Secondary detection against chicken IgY</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Human sera samples</td>
			<td style="width:235px;">Israeli Blood Bank</td>
			<td style="width:227px;"></td>
			<td style="width:476px;">Primary detection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Compressed Nitrogen (Grade 5)</td>
			<td style="width:235px;"></td>
			<td style="width:227px;"></td>
			<td style="width:476px;">General dusting/drying tool</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Epoxy-coated slides</td>
			<td style="width:235px;">Corning</td>
			<td style="width:227px;">40044</td>
			<td style="width:476px;">Slides</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:269px;">Epoxy-coated slides</td>
			<td style="width:235px;">PolyAn</td>
			<td style="width:227px;">2D 104-00-221</td>
			<td style="width:476px;">Slides. In this type of slides the surface is more hydrophobic (compared to Coring slides) therefore the glycans Print Buffer would need to be supplemented with 0.005% Tween-20 to obtain 100 &#181;m size spots.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">384-well microtiter plate</td>
			<td style="width:235px;">Genetix</td>
			<td style="width:227px;">2070</td>
			<td style="width:476px;">Printing plate</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">VWR lab marker</td>
			<td style="width:235px;">VWR</td>
			<td style="width:227px;">52877-310</td>
			<td style="width:476px;">Slide labeling</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Staining Tube</td>
			<td style="width:235px;">ArrayIt</td>
			<td style="width:227px;">MST</td>
			<td style="width:476px;">Slide developing tool</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Staining bath</td>
			<td style="width:235px;">VWR</td>
			<td style="width:227px;">25608-904</td>
			<td style="width:476px;">Slide developing tool</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Slides glass holders</td>
			<td style="width:235px;">VWR</td>
			<td style="width:227px;">631-9321</td>
			<td style="width:476px;">Slide developing tool</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">GenePix Scanner</td>
			<td style="width:235px;">Molecular devices</td>
			<td style="width:227px;">4000B</td>
			<td style="width:476px;">Slide scanner</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">LM-60 NanoPrinter</td>
			<td style="width:235px;">ArrayIt</td>
			<td style="width:227px;">LM-60</td>
			<td style="width:476px;">Array printer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Pins</td>
			<td style="width:235px;">ArrayIt</td>
			<td style="width:227px;">946MP3</td>
			<td style="width:476px;">Printing pins</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">ProPlate Module</td>
			<td style="width:235px;">Grace Bio-Labs</td>
			<td style="width:227px;">P37004</td>
			<td style="width:476px;">Slide developing module</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Distilled water</td>
			<td style="width:235px;">Bio-Lab</td>
			<td style="width:227px;">2321020500</td>
			<td style="width:476px;">Required for arrayer and humidifier</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:269px;">Electronic Multi Pippete, 8 Channel , volume range 2-125 &#956;L</td>
			<td style="width:235px;">Thermo-Fisher Scientific (Matrix)</td>
			<td style="width:227px;">MA-2131 Impact2 Equalizer 384</td>
			<td style="width:476px;">Multi pippete for sample dispansing into 384-well plate</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

profiling anti-neu5gc igg in human sera with a sialoglycan microarray assay

細胞は、癌で一般的に変化し、シアル酸（Sia）発現の変化を含む炭水化物鎖（グリカン）の外皮で覆われている。これらは、9炭素骨格を有し、細胞表面上の脊椎動物グリカンをキャップする酸性糖である。哺乳動物の主要な2つのSia型は、 N-アセチルノイラミン酸（Neu5Ac）およびそのヒドロキシル化形態であるN-グリコリルノイラミン酸（Neu5Gc）である。ヒトは、シチジン5 &#39;モノホスフェート-Neu5Ac（CMP-Neu5Ac）ヒドロキシラーゼ（CMAH）をコードする遺伝子の不活性化のために、内因性Neu5Gcを産生することができない。外部Neu5Gcは、赤肉および乳製品の食物摂取を通じてヒト細胞によって獲得され、その後、細胞表面上の多様なグリカンに現れ、主に癌腫に蓄積する。結果として、ヒトは、癌および他の慢性炎症媒介性疾患において多様な役割を果たす循環型抗Neu5Gc抗体を有し、潜在的な診断および治療の可能性になっているラッツ。ここでは、ヒト血清中のそのような抗Neu5Gc抗体を評価するためのハイスループットのシアログリカンマイクロアレイアッセイを記載する。 Neu5Gc含有グリカンおよびそれらの対応する対の対照（Neu5Ac含有グリカン）は、それぞれコア第一アミンを有し、エポキシ被覆ガラススライドに共有結合される。我々は、1プリントあたり最大896個のアレイを生成することができる特定のナノプリンタを用いて、16ウェルフォーマットで56枚のスライドを印刷することを例示する。各スライドを使用して、抗Neu5Gc抗体特異性、強度および多様性の評価のための16の異なるヒト血清サンプルをスクリーニングすることができる。プロトコルは、この堅牢なツールの複雑さを記述し、配列形式で多様な臨床サンプルでNeu5Gc食物炭水化物抗原への応答を調査することを目指しているもののための基本的なガイドラインを提供します。

アレイ印刷、開発、分析： 複数のグリカンサンプルおよびヒトIgG STD曲線を含む16個の異なるブロックにシアログリカンマイクロアレイを印刷するには、スライドごとに16個のブロックすべてと同じ印刷操作ですべてのスライドにできるだけ均一にすべてのサンプルを印刷するための徹底的な較正が必要です。したがって、特...

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Profiling Anti-Neu5Gc IgG in Human Sera with a Sialoglycan Microarray Assay

Sialoglycanマイクロアレイアッセイによるヒト血清中の抗Neu5Gc IgGのプロファイリング

シアログリカンマイクロアレイアッセイを用いてヒト血清中の抗Neu5Gc抗体を評価し、癌および他の慢性炎症媒介ヒト疾患のハイスループット診断アッセイを可能にする。

Cells are covered with a cloak of carbohydrate chains (glycans) that is commonly altered in cancer and that includes variations in sialic acid (Sia) ...

The overall goal of the sialoglycan microarray assay is to evaluate Anti-Neu5Gc IgG in human sera in a high-throughput manner against a diverse collection of sialoglycans. This method can help answer key questions in the glycoimmunology field, such as how Anti-Neu5Gc antibodies are involved with various human diseases including cancer, heart diseases, and xenotransplantation. The main advantage of this technique is that it allows high-throughput profiling of Anti-Neu5Gc antibodies against a myriad of sialoglycan antigens.Demonstrating the procedure will be Sharon Yehuda, a master student from my laboratory. Careful and detailed planning of array fabrication and layout is important to ensure success. This process is detailed in the text protocol and the supplementary information.Dilute each glycan to 100 micromolar in a total volume of 100 microliters of glycan printing buffer in microcentrifuge tubes. Next, prepare primary amine containing fluorescent dye to one milligram per millimeter with marker buffer. Then, dilute to one microgram per milliliter in a one milliliter total volume.Prepare human IgG standard curve dilutions as described in the text protocol. Place the 384 well plate on ice. Using an electronic multi-pipette, aliquot seven microliters of each glycan, marker, and stardard curve IgG according to the plate layout found in the text protocol.Cover the plate with parafilm and spin down for two minutes at 250 times g and 12 degrees Celsius. Printing must be carried out in dust-free area with a humidity of 60 to 70%Here, all steps are carried out in a clean room with appropriate gloves and clothing for protection. Turn on the nano printer machine and humidifier.After programming the printing machine as described in the text protocol, position the 384 well plate with aliquoted samples into its location on the arrayer deck and remove the parafilm cover. At this point, start printing. Number the slides with an alcohol solvent-resistant marking pen, and store them in a vacuum-sealed box in the dark.To process the arrays, first remove a slide from the vacuum-sealed box and place it in a chemical hood for five minutes, array facing up, to evaporate the excess liquid. Next, hydrate the slide by placing it it in a staining tube filled with deionized water. Cover the tube with foil and incubate for five minutes with slow and gentle shaking at room temperature.To block the reactive epoxy groups on the slide, dip the slide into the 50 milliliter staining tube filled with pre-warmed ethanolamine blocking solution. Cover the tube with foil and incubate for 30 minutes with slow and gentle shaking at room temperature. Discard the ethanolamine blocking solution into the appropriate biohazard trash receptacle.Then, place the slide in a new, clean staining tube filled with 50 degree celsius deionized water. Cover the tube with foil and incubate for 10 minutes with slow and gentle shaking at room temperature. Discard the water and transfer the slides to a glass staining holder.Place the apparatus into a swinging plate holder and centrifuge the slide dry. Next, place the slide onto a 16-well divider. After pre-wetting the wells, use a multi-pipette to aliquot 200 microliters of PBST into the slide wells.Then, place them in a covered, humid chamber and shake for five minutes. Remove the PBST by flicking and tapping gently on a clean paper towel. Then, aliquot 200 microliters of PBS-Ovalbumine blocking buffer into each well.Place the slides in a humid chamber and incubate for one hour at room temperature with gentle shaking. Next, prepare the primary detection, diluted in PBS-OVA blocking buffer as described in the text protocol. Flick PBS-OVA blocking buffer off the slide and add 200 microliters of primary antibody per well.Incubate the slides in a humid chamber for two hours. Then, flick the primary detection off the slide and wash three times with PBST. Incubate the slide in PBST for five minutes in a humid chamber before washing a final time with PBST.Then, wash once with PBS. Next, prepare the secondary antibody in PBS as described in the text protocol. Flick the PBS off the slide and add 200 microliters of secondary antibody.Flick the secondary antibody off the slide and wash four times with PBST as before. Carefully remove the frame, then place the slides into a 50 milliliter slide staining tube filled with PBS and shake for five minutes. Next, fill two slide staining baths with deionized water.Place the slide into the slide holder and dip the slide into the first bath. Quickly dip the slide ten times. Then, transfer the slide to the second bath and dip ten more times.After dipping, incubate the slide for ten minutes at room temperature with shaking. Following incubation, discard the water and transfer the slide to a glass staining holder. Place the glass staining holder in a swinging plate holder and centrifuge the slide dry.Open the scanner door and place the slide inside, array facing down. At this point, start the scanning. Save the scanned slides as a TIFF file.To prepare a slide for analysis, select Load Array List"and upload the appropriate GAL file that maps the arrays in each block on the slide. Slides were developed with 16 different primary detection moieties, one in each block. The plant Lectin SNA binds a2-6 linked sialic acid.Whereas the plant Lectin MALII binds a2-3 linked sialic acid. Polyclonal Anti-Neu5Gc IgY binds Neu5Gc-containing sialoglycans but does not bind Neu5Ac-containing sialoglycans. To profile Anti-Neu5Gc IgG, 12 sera from healthy human donors were analyzed on the printed sialoglycan microarray and developed using fluorescently labeled anti-human IgG in normalized to nanograms per microliter.All tested human sera contained various levels of Anti-Neu5Gc IgG with almost no recognition of the matched pairs of Neu5Ac-containing sialoglycans. Furthermore, Anti-Neu5Gc IgG recognition patterns are highly diverse between these 12 different sera, both in the level of intensity and diversity. After watching this video, you should have a good understanding of how to profile Anti-Neu5Gc antibodies in various human samples in a high-throughput manner, using a glycan microarray system.

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