Name: profiling anti-neu5gc igg in human sera with a sialoglycan microarray assay
Uploaded: 2017-07-13T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Profiling Anti-Neu5Gc IgG in Human Sera with a Sialoglycan Microarray Assay at JoVE.com

이 연구는 부분적으로 Israel Cancer Research Fund의 Research Career Development Award, Israeli National Nanotechnology Initiative의 보조금 및 Personalized Theranostics (VP-K)의 Nanomedicines에 대한 Focal Technology Area의 Helmsley 자선 신탁 및 National 보건 당국 R01GM076360 (XC에).

인체 혈청 샘플은 이스라엘 혈액 은행 (Israeli Blood Bank)에서 얻은 것이며 헬싱키 선언 및 Tel Aviv University Institutional Review Board에 따라 사용되었습니다. 1. 어레이 제조 계획 및 레이아웃 <ol><li> 슬라이드 레이아웃을 결정하십시오. 참고 : 각 슬라이드에는 B1 ~ B16으로 번호가 매겨진 16 개의 동일한 블록으로 분할 된 16 개의 하위 어레이가 포함됩니다 ( 그림 1B...

<ol>
	<li>Padler-Karavani, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aiming+at+the+sweet+side+of+cancer:+Aberrant+glycosylation+as+possible+target+for+personalized-medicine.">Aiming at the sweet side of cancer: Aberrant glycosylation as possible target for personalized-medicine.</a> Cancer Lett. 352 (1), 102-112 (2014).</li><li>Amon, R., Reuven, E. M., Leviatan Ben-Arye, ., Padler-Karavani, S., V, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycans+in+immune+recognition+and+response.">Glycans in immune recognition and response.</a> Carbohydr Res. 389, 115-122 (2014).</li><li>H&#228;uselmann, I., Borsig, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+tumor-cell+glycosylation+promotes+metastasis.">Altered tumor-cell glycosylation promotes metastasis.</a> Front Oncol. 4, (2014).</li><li>Tangvoranuntakul, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+uptake+and+incorporation+of+an+immunogenic+nonhuman+dietary+sialic+acid.">Human uptake and incorporation of an immunogenic nonhuman dietary sialic acid.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100 (21), 12045-12050 (2003).</li><li>Bardor, M., Nguyen, D. H., Diaz, S., Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+uptake+and+incorporation+of+the+non-human+sialic+acid+N-glycolylneuraminic+acid+into+human+cells.">Mechanism of uptake and incorporation of the non-human sialic acid N-glycolylneuraminic acid into human cells.</a> J Biol Chem. 280 (6), 4228-4237 (2005).</li><li>Padler-Karavani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+in+specificity,+abundance,+and+composition+of+anti-Neu5Gc+antibodies+in+normal+humans:+potential+implications+for+disease.">Diversity in specificity, abundance, and composition of anti-Neu5Gc antibodies in normal humans: potential implications for disease.</a> Glycobiology. 18 (10), 818-830 (2008).</li><li>Padler-Karavani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+xeno-autoantibodies+against+a+non-human+sialic+acid+serve+as+novel+serum+biomarkers+and+immunotherapeutics+in+cancer.">Human xeno-autoantibodies against a non-human sialic acid serve as novel serum biomarkers and immunotherapeutics in cancer.</a> Cancer Res. 71 (9), 3352-3363 (2011).</li><li>Cao, H., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+consideration+on+sialic+acid+chemistry.">General consideration on sialic acid chemistry.</a> Methods Mol Biol. 808, 31-56 (2012).</li><li>Deng, L., Chen, X., Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploration+of+sialic+Acid+diversity+and+biology+using+sialoglycan+microarrays.">Exploration of sialic Acid diversity and biology using sialoglycan microarrays.</a> Biopolymers. 99 (10), 650-665 (2013).</li><li>Liang, C. 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N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+red+meat-derived+glycan+promotes+inflammation+and+cancer+progression.">A red meat-derived glycan promotes inflammation and cancer progression.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 112 (2), 542-547 (2015).</li><li>Pearce, O. M., L&#228;ubli, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sialic+acids+in+cancer+biology+and+immunity.">Sialic acids in cancer biology and immunity.</a> Glycobiology. 26 (2), 111-128 (2016).</li><li>Alisson-Silva, F., Kawanishi, K., Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+risk+of+diseases+associated+with+red+meat+intake:+Analysis+of+current+theories+and+proposed+role+for+metabolic+incorporation+of+a+non-human+sialic+acid.">Human risk of diseases associated with red meat intake: Analysis of current theories and proposed role for metabolic incorporation of a non-human sialic acid.</a> Mol Aspects Med. 51, 16-30 (2016).</li><li>Pearce, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inverse+hormesis+of+cancer+growth+mediated+by+narrow+ranges+of+tumor-directed+antibodies.">Inverse hormesis of cancer growth mediated by narrow ranges of tumor-directed antibodies.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 111 (16), 5998-6003 (2014).</li><li>Pham, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+novel+human-specific+xeno-auto-antibody+response+against+vascular+endothelium.">Evidence for a novel human-specific xeno-auto-antibody response against vascular endothelium.</a> Blood. 114 (25), 5225-5235 (2009).</li><li>Reuven, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+immunogenic+Neu5Gc+in+bioprosthetic+heart+valves.">Characterization of immunogenic Neu5Gc in bioprosthetic heart valves.</a> Xenotransplantation. 23 (5), 381-392 (2016).</li><li>Ghaderi, D., Taylor, R. E., Padler-Karavani, V., Diaz, S., Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+of+the+presence+of+N-glycolylneuraminic+acid+in+recombinant+therapeutic+glycoproteins.">Implications of the presence of N-glycolylneuraminic acid in recombinant therapeutic glycoproteins.</a> Nat Biotechnol. 28 (8), 863-867 (2010).</li></ol>

성공적인 glycan microarray 제작에는 신중한 계획이 필요하며 프로토콜에 몇 가지 중요한 단계가 포함됩니다. 여기에는 (1) 모든 후속 매개 변수 ( 예 : 거리, 간격, 샘플 양 및 인쇄)를 정의하는 블록 및 플레이트 레이아웃 계획. (2) 핀을 클리닝하고 핀의 완전성을 보장하는 것, 이는 스팟 동질성을 제어하는 ​​데 중요합니다. (3) 인쇄 중 습도를 높게 유지하며, 장시간 인쇄시 샘플 증발을 피하?...

Sias는 척추 동물의 세포 표면 당 단백질과 당지질의 글리 칸 쇄를 덮는 산성 당입니다. Sia 발현은 암세포 1 에서 변형되고 진행 및 / 또는 전이와 관련이있다 2 , 3 . 포유 동물의 주요 시아 형태의 두 Neu5Ac 및 수산화 형태, Neu5Gc 2이다. 인간은 CMAH 효소를 암호화하는 유전자의 특정 불활 화 때문에 Neu5Gc를 합성 할 수 없다. 이 비인간적 인 Sia는 Neu5Gc가 풍부한식이 요법 ( 예 : 붉은 고기)에서 유래하여 &quot;자기&quot;로 인간 세포에 대사 적으로 결합합니다 4 , 5 . Neu5Gc는 인간 상피와 내피의 세포 표면에 낮은 수준으로 존재하지만 특히 암종에 축적됩니다. Neu5Gc는 인체 체액 성 면역계에 의해 외국으로 인정됩니다 2 , 6 .Neu5Gc 글리 칸의 항원 복잡성은 모든 인간 6 항 Neu5Gc 항체 반응의 복잡성에 의해 반사, Neu5Gc 수정, 연결, 기본 글리 칸과 비계, 그 밀도 등의 여러 수준에서 발생할 수 있습니다. 이러한 항체의 일부는 암 바이오 마커 및 잠재적 immunotherapeutics (7)의 역할을한다. 다른 sialoglycans (8)의 화학 효소 적 합성의 출현 당쇄 마이크로 어레이 기술 (9) (10)의 사용에 의해 용이 항체의 더 심도 깊은 분석을위한 방법을 닦았다. 따라서, 천연 및 합성 탄수화물의 큰 도서관의 촉진 준비와 조작으로, 글리 칸 마이크로 어레이는 생체 분자 (10), (11)의 무수히 많은 탄수화물의 상호 작용을 조사하기위한 강력한 높은 처리량 기술이있다, </sup&gt; 12 , 13 . 배열 형태로, 최소량의 물질이 사용되며, 생물학적으로 관련이있는 글리 칸의 다가의 디스플레이는 단일 실험에서 수천 개의 결합 상호 작용을 조사 할 수 있습니다. 중요한 것은,이 기술은 바이오 마커 발견 및 12, 다양한 시료 7에 대한 면역 반응을 모니터링에 적용될 수있다. 성공적인 glycan microarray 제작에는 3 가지 중요한 측면, 즉 프린터 로봇 유형, glycan 접합 화학 및 검출 광학을 고려해야합니다. 인쇄 기기 고려 사항에 관해서는 접촉 및 비접촉식 프린터의 두 가지 기술을 사용할 수 있습니다. 접촉 프린팅에서 1-48 강철 핀을 글리 칸 용액이 들어있는 멀티 웰 원판에 담궈 유리 슬라이드 표면에 직접 접촉시켜 관능 화 된 유리 슬라이드에 얼룩을지게합니다. 솔루션 금액 de슬라이드에 생존하는 것은 슬라이드 표면의 느린 지속 시간의 함수입니다. 일반적으로 샘플은 슬라이드 표면에 인쇄되기 전에 먼저 유리 블록 (균질 한 지점에 도달하기 위해)에서 미리 얼룩을지게됩니다. 비접촉식 프린터 ( 예 : 압전기 프린터)에서 글리 칸은 제어 된 전기 신호를 사용하여 유리 모세관에서 인쇄됩니다. 접촉 식 인쇄에 비해 더 정밀한 인쇄를 달성하기 위해 전기 신호를 미세하게 조정할 수 있습니다. 스폿의 크기와 형태 또한 비교적 균질합니다. 추가적인 이점은 인쇄 후 시료를 원판에 재활용하는 것입니다. 그럼에도 불구하고 피에조 전자 프린터의 가장 큰 단점은 인쇄 팁 제한 (4 또는 8)으로 매우 긴 인쇄 시간을 초래하며 슬라이드 안정성, 온도, 습도 및 샘플 증발에 특별한주의가 요구됩니다. 비접촉식 잉크젯 프린터에는 더 큰 샘플 용적이 필요합니다 14 . <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; 인쇄 방법에 대한 제한된 사용 가능한 옵션과는 대조적으로, 글리 칸 접합 화학은 선택할 수있는 많은 옵션이있는보다 복잡한 고려 사항입니다. 선택된 고정화 화학은 글리 칸의 활성 그룹 및 슬라이드 표면 반응성 모두를 고려해야한다. 합성 적으로 합성되거나 자연적으로 분리 된 특정 마이크로 어레이 표면 상에 고정화 될 글리 칸은 모두 동일한 반응기를 필요로한다. 또한, glycans은 순수하고 균질해야합니다. 한편, 고정화 표면 및 화학은 재현성 및 신뢰성있는 부착 밀도를 제공해야한다. 공유 결합 또는 비공유 (물리적 흡수) 부착 10 , 11 , 12 , 13 으로 다중 고정화 방법이 개발되었다. Uninitiate를위한 인쇄 된 glycan microarray 기술에 관한 매우 자세한 정보는연구원은 훌륭한 리뷰 13 , 15를 참조하십시오. 중요한 것은 글리코 믹스 실험 (MIRAGE) 이니셔티브에 대한 최근의 최소 필요한 정보는 샘플 준비 (16)과이 성장하는 분야의 표준을 개선하기 위해 (17)을 분석 글리 칸 마이크로 어레이 데이터를보고하기위한 지침을 설명합니다. 여기, 우리는 16 웰 형식의 특정 연락처 나노 프린터를 사용하여 sialoglycan microarrays의 제조에 대한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 각 글리 칸은 에폭시 활성화 유리 슬라이드에 대한 공유 결합을 매개하는 1 차 아민을 가지고 있습니다. 우리는 또한 다양한 인간 혈청 시료, 항체 및 Sia 결합 식물 렉틴을 사용하여 한 슬라이드의 개발과 분석을 설명합니다. Sialoglycan 마이크로 어레이 분석은 어레이 제조, 프로세싱, 개발 및 분석을 포함한 몇 가지 주요 단계를 포함합니다. 어레이 제작에는 ar 계획이 필요합니다.나노 그리드 및 소스 플레이트 준비, 나노 프린터 프로그래밍, 슬라이드 인쇄 등의 작업을 수행 할 수 있습니다. 이어서 슬라이드를 처리, 개발 및 분석합니다 ( 그림 1 ).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1205">
	<tbody>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:269px;">Primary-amine containing sialoglycans</td>
			<td style="width:235px;">Glycohub, Inc., Davis, CA, USA (http://www.glycohub.com/services)</td>
			<td style="width:227px;">Contact info@glycohubusa.com for compound requests</td>
			<td style="width:476px;">Printed glycans</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Monosodium phosphate monohydrate</td>
			<td style="width:235px;">Sigma</td>
			<td style="width:227px;">S9638</td>
			<td style="width:476px;">Printing buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Disodium phosphate heptahydrate</td>
			<td style="width:235px;">Sigma</td>
			<td style="width:227px;">S9390</td>
			<td style="width:476px;">Printing buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:235px;">Hy-Labs</td>
			<td style="width:227px;">BP-507/500D</td>
			<td style="width:476px;">Printing buffer/ incubation/washing buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Tris-base</td>
			<td style="width:235px;">Sigma</td>
			<td style="width:227px;">T1503</td>
			<td style="width:476px;">Slide blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Glycerol</td>
			<td style="width:235px;">Sigma</td>
			<td style="width:227px;">G-7893</td>
			<td style="width:476px;">Printing buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Ethanolamine</td>
			<td style="width:235px;">Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td style="width:227px;">0700/08</td>
			<td style="width:476px;">Slide blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Ovalbumin (Grade V)</td>
			<td style="width:235px;">Sigma</td>
			<td style="width:227px;">A5503</td>
			<td style="width:476px;">Slide Blocking protein</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Tween-20</td>
			<td style="width:235px;">Sigma</td>
			<td style="width:227px;">P7949</td>
			<td style="width:476px;">Slide washing detergent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Alexa 555-Hydrazide</td>
			<td style="width:235px;">Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td style="width:227px;">A20501MP</td>
			<td style="width:476px;">Marker on array</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">ChromPure Human IgG, whole molecule</td>
			<td style="width:235px;">Jackson Immunoresearch</td>
			<td style="width:227px;">009-000-003</td>
			<td style="width:476px;">Printing component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Biotinylated- SNA</td>
			<td style="width:235px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:227px;">B-1305</td>
			<td style="width:476px;">Plant Lectin &#8211; binding Sia-alpha2&#8211;6-linked</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Biotinylated-MALII</td>
			<td style="width:235px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:227px;">B-1265</td>
			<td style="width:476px;">Plant Lectin &#8211; binding Sia-alpha2&#8211;3-linked</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Chicken-anti Neu5Gc IgY</td>
			<td style="width:235px;">BioLegend</td>
			<td style="width:227px;">146903</td>
			<td style="width:476px;">Primary detection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Cy3-Streptavidin</td>
			<td style="width:235px;">Jackson Immunoresearch</td>
			<td style="width:227px;">016-160-0848</td>
			<td style="width:476px;">Biotin binding</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Cy3-anti Human IgG</td>
			<td style="width:235px;">Jackson Immunoresearch</td>
			<td style="width:227px;">109-165-088</td>
			<td style="width:476px;">Secondary detection against human IgG</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Cy3-anti Chicken IgY</td>
			<td style="width:235px;">Jackson Immunoresearch</td>
			<td style="width:227px;">703-165-155</td>
			<td style="width:476px;">Secondary detection against chicken IgY</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Human sera samples</td>
			<td style="width:235px;">Israeli Blood Bank</td>
			<td style="width:227px;"></td>
			<td style="width:476px;">Primary detection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Compressed Nitrogen (Grade 5)</td>
			<td style="width:235px;"></td>
			<td style="width:227px;"></td>
			<td style="width:476px;">General dusting/drying tool</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Epoxy-coated slides</td>
			<td style="width:235px;">Corning</td>
			<td style="width:227px;">40044</td>
			<td style="width:476px;">Slides</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:269px;">Epoxy-coated slides</td>
			<td style="width:235px;">PolyAn</td>
			<td style="width:227px;">2D 104-00-221</td>
			<td style="width:476px;">Slides. In this type of slides the surface is more hydrophobic (compared to Coring slides) therefore the glycans Print Buffer would need to be supplemented with 0.005% Tween-20 to obtain 100 &#181;m size spots.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">384-well microtiter plate</td>
			<td style="width:235px;">Genetix</td>
			<td style="width:227px;">2070</td>
			<td style="width:476px;">Printing plate</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">VWR lab marker</td>
			<td style="width:235px;">VWR</td>
			<td style="width:227px;">52877-310</td>
			<td style="width:476px;">Slide labeling</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Staining Tube</td>
			<td style="width:235px;">ArrayIt</td>
			<td style="width:227px;">MST</td>
			<td style="width:476px;">Slide developing tool</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Staining bath</td>
			<td style="width:235px;">VWR</td>
			<td style="width:227px;">25608-904</td>
			<td style="width:476px;">Slide developing tool</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Slides glass holders</td>
			<td style="width:235px;">VWR</td>
			<td style="width:227px;">631-9321</td>
			<td style="width:476px;">Slide developing tool</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">GenePix Scanner</td>
			<td style="width:235px;">Molecular devices</td>
			<td style="width:227px;">4000B</td>
			<td style="width:476px;">Slide scanner</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">LM-60 NanoPrinter</td>
			<td style="width:235px;">ArrayIt</td>
			<td style="width:227px;">LM-60</td>
			<td style="width:476px;">Array printer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Pins</td>
			<td style="width:235px;">ArrayIt</td>
			<td style="width:227px;">946MP3</td>
			<td style="width:476px;">Printing pins</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">ProPlate Module</td>
			<td style="width:235px;">Grace Bio-Labs</td>
			<td style="width:227px;">P37004</td>
			<td style="width:476px;">Slide developing module</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Distilled water</td>
			<td style="width:235px;">Bio-Lab</td>
			<td style="width:227px;">2321020500</td>
			<td style="width:476px;">Required for arrayer and humidifier</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:269px;">Electronic Multi Pippete, 8 Channel , volume range 2-125 &#956;L</td>
			<td style="width:235px;">Thermo-Fisher Scientific (Matrix)</td>
			<td style="width:227px;">MA-2131 Impact2 Equalizer 384</td>
			<td style="width:476px;">Multi pippete for sample dispansing into 384-well plate</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

profiling anti-neu5gc igg in human sera with a sialoglycan microarray assay

세포는 일반적으로 암에서 변형되고 시알 산 (Sia) 발현의 변화를 포함하는 탄수화물 사슬 (glycans)의 외투로 덮여 있습니다. 이들은 9 탄소 백본을 가지고 있으며 세포 표면에 척추 동물의 glycan을 캡핑하는 산성 당입니다. 포유 동물의 주요 Sia 형태 중 두 가지는 N- 아세틸 뉴 라민 산 (Neu5Ac)과 N- 히드 록 실화 형태 인 N- 글리콜 노 뉴라민 산 (Neu5Gc)입니다. 인간은 cytidine 5&#39;monophosphate-Neu5Ac (CMP-Neu5Ac) hydroxylase (CMAH)를 암호화하는 유전자의 불 활성화 때문에 내인성 Neu5Gc를 생성 할 수 없다. 외래 Neu5Gc는 붉은 육류 및 유제품의식이 섭취를 통해 인간 세포에 의해 획득되고 이후 세포 표면의 다양한 글리 칸에 주로 나타나 암종에 축적됩니다. 결과적으로 인간은 암 및 기타 만성 염증 매개 질환에서 다양한 역할을하는 순환 Neu5Gc 항체를 가지고 있으며 잠재적 인 진단 및 치료제가되고있다rgets. 여기, 우리는 인간 항체에서 이러한 안티 Neu5Gc 항체를 평가하는 높은 처리량 sialoglycan microarray 분석을 설명합니다. Neu5Gc 함유 글리 칸과 각각 일치하는 대조군 쌍 (Neu5Ac 함유 글리 칸)은 각각 핵심 1 차 아민과 함께 에폭시 코팅 유리 슬라이드에 공유 결합되어 있습니다. 우리는 인쇄 당 최대 896 개의 어레이를 생성 할 수있는 특정 나노 프린터를 사용하여 16- 웰 포맷으로 56 개의 슬라이드를 인쇄하는 것을 예시합니다. 각 슬라이드는 안티 Neu5Gc 항체 특이성, 강도 및 다양성의 평가를 위해 16 개의 다른 인간 혈청 샘플을 스크리닝하는 데 사용할 수 있습니다. 프로토콜은이 견고한 도구의 복잡성을 설명하고 배열 형식으로 다양한 임상 샘플에서 Neu5Gc식이 탄수화물 항원에 대한 반응을 조사하고자하는 사람들을위한 기본 지침을 제공합니다.

배열 인쇄, 개발 및 분석 : 여러 개의 glycan 시료와 human IgG STD 곡선을 가진 sialoglycan microarray를 16 개 블록으로 인쇄하려면 모든 시료가 슬라이드 당 16 개의 블록과 동일한 인쇄 작업에서 모든 슬라이드에 가능한 한 균일하게 인쇄되도록 철저한 보정이 필요합니다. 따라서 각 시료 유형, 슬라이드 유형 및 제조, 384-well plate type, 습?...

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Profiling Anti-Neu5Gc IgG in Human Sera with a Sialoglycan Microarray Assay

Sialoglycan Microarray Assay를 사용하여 Human Sera에서 Anti-Neu5Gc IgG 프로파일 링

시알로 글리 칸 마이크로 어레이 분석은 인체 혈청에서 항 -Neu5Gc 항체를 평가하는 데 사용될 수있어 암 및 기타 만성 염증 매개 질환에 대한 잠재적 인 고효율 진단 분석법이됩니다.

Cells are covered with a cloak of carbohydrate chains (glycans) that is commonly altered in cancer and that includes variations in sialic acid (Sia) ...

The overall goal of the sialoglycan microarray assay is to evaluate Anti-Neu5Gc IgG in human sera in a high-throughput manner against a diverse collection of sialoglycans. This method can help answer key questions in the glycoimmunology field, such as how Anti-Neu5Gc antibodies are involved with various human diseases including cancer, heart diseases, and xenotransplantation. The main advantage of this technique is that it allows high-throughput profiling of Anti-Neu5Gc antibodies against a myriad of sialoglycan antigens.Demonstrating the procedure will be Sharon Yehuda, a master student from my laboratory. Careful and detailed planning of array fabrication and layout is important to ensure success. This process is detailed in the text protocol and the supplementary information.Dilute each glycan to 100 micromolar in a total volume of 100 microliters of glycan printing buffer in microcentrifuge tubes. Next, prepare primary amine containing fluorescent dye to one milligram per millimeter with marker buffer. Then, dilute to one microgram per milliliter in a one milliliter total volume.Prepare human IgG standard curve dilutions as described in the text protocol. Place the 384 well plate on ice. Using an electronic multi-pipette, aliquot seven microliters of each glycan, marker, and stardard curve IgG according to the plate layout found in the text protocol.Cover the plate with parafilm and spin down for two minutes at 250 times g and 12 degrees Celsius. Printing must be carried out in dust-free area with a humidity of 60 to 70%Here, all steps are carried out in a clean room with appropriate gloves and clothing for protection. Turn on the nano printer machine and humidifier.After programming the printing machine as described in the text protocol, position the 384 well plate with aliquoted samples into its location on the arrayer deck and remove the parafilm cover. At this point, start printing. Number the slides with an alcohol solvent-resistant marking pen, and store them in a vacuum-sealed box in the dark.To process the arrays, first remove a slide from the vacuum-sealed box and place it in a chemical hood for five minutes, array facing up, to evaporate the excess liquid. Next, hydrate the slide by placing it it in a staining tube filled with deionized water. Cover the tube with foil and incubate for five minutes with slow and gentle shaking at room temperature.To block the reactive epoxy groups on the slide, dip the slide into the 50 milliliter staining tube filled with pre-warmed ethanolamine blocking solution. Cover the tube with foil and incubate for 30 minutes with slow and gentle shaking at room temperature. Discard the ethanolamine blocking solution into the appropriate biohazard trash receptacle.Then, place the slide in a new, clean staining tube filled with 50 degree celsius deionized water. Cover the tube with foil and incubate for 10 minutes with slow and gentle shaking at room temperature. Discard the water and transfer the slides to a glass staining holder.Place the apparatus into a swinging plate holder and centrifuge the slide dry. Next, place the slide onto a 16-well divider. After pre-wetting the wells, use a multi-pipette to aliquot 200 microliters of PBST into the slide wells.Then, place them in a covered, humid chamber and shake for five minutes. Remove the PBST by flicking and tapping gently on a clean paper towel. Then, aliquot 200 microliters of PBS-Ovalbumine blocking buffer into each well.Place the slides in a humid chamber and incubate for one hour at room temperature with gentle shaking. Next, prepare the primary detection, diluted in PBS-OVA blocking buffer as described in the text protocol. Flick PBS-OVA blocking buffer off the slide and add 200 microliters of primary antibody per well.Incubate the slides in a humid chamber for two hours. Then, flick the primary detection off the slide and wash three times with PBST. Incubate the slide in PBST for five minutes in a humid chamber before washing a final time with PBST.Then, wash once with PBS. Next, prepare the secondary antibody in PBS as described in the text protocol. Flick the PBS off the slide and add 200 microliters of secondary antibody.Flick the secondary antibody off the slide and wash four times with PBST as before. Carefully remove the frame, then place the slides into a 50 milliliter slide staining tube filled with PBS and shake for five minutes. Next, fill two slide staining baths with deionized water.Place the slide into the slide holder and dip the slide into the first bath. Quickly dip the slide ten times. Then, transfer the slide to the second bath and dip ten more times.After dipping, incubate the slide for ten minutes at room temperature with shaking. Following incubation, discard the water and transfer the slide to a glass staining holder. Place the glass staining holder in a swinging plate holder and centrifuge the slide dry.Open the scanner door and place the slide inside, array facing down. At this point, start the scanning. Save the scanned slides as a TIFF file.To prepare a slide for analysis, select Load Array List"and upload the appropriate GAL file that maps the arrays in each block on the slide. Slides were developed with 16 different primary detection moieties, one in each block. The plant Lectin SNA binds a2-6 linked sialic acid.Whereas the plant Lectin MALII binds a2-3 linked sialic acid. Polyclonal Anti-Neu5Gc IgY binds Neu5Gc-containing sialoglycans but does not bind Neu5Ac-containing sialoglycans. To profile Anti-Neu5Gc IgG, 12 sera from healthy human donors were analyzed on the printed sialoglycan microarray and developed using fluorescently labeled anti-human IgG in normalized to nanograms per microliter.All tested human sera contained various levels of Anti-Neu5Gc IgG with almost no recognition of the matched pairs of Neu5Ac-containing sialoglycans. Furthermore, Anti-Neu5Gc IgG recognition patterns are highly diverse between these 12 different sera, both in the level of intensity and diversity. After watching this video, you should have a good understanding of how to profile Anti-Neu5Gc antibodies in various human samples in a high-throughput manner, using a glycan microarray system.

Research

JoVE Journal

Behavior

Assessing Functional Performance in the Mdx Mouse Model

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의 기능적 성능을 평가<em&gt; MDX</em&gt; 마우스 모델

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a severe and progressive muscle wasting disorder for which no cure is available. Nevertheless, several potential ...

연구

행동분석학

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정신 분열증에 대한 가족 성 위험이 높은 아동의 정서적 괴짜 작업을 사용하여 이마 관자 - 변연계의 활동의 측정

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