Name: in vivo detection and analysis of rb protein sumoylation in human cells
Uploaded: 2017-11-02T13:00:00
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Diese Studie wurde unterstützt durch Zuschüsse aus der Wissenschaft und Technologie Kommission von Shanghai (Grant Nr. 14411961800) und National Natural Science Foundation of China (Grant Nr. 81300805).

1. Erkennung von endogenen Rb Sumoylierung in der Frühphase G1 <ol><li>Zell-Kultur und Zellzyklus Synchronisation.
	<ol><li>Pflegen HEK293 Zellen im Dulbecco-haltigem Wachstumsmedium &#39; s Modified Eagle Medium (DMEM) ergänzt mit 1 % Pen-Strep und 10 % fetalen bovine Serum (FBS) bei 37 ° C und 5 % CO 2 in einem Inkubator.</li>
		<li>Synchronisieren der HEK293 Zellen in der G0-Phase.
		<ol><li>Zählen die HEK293 Zellen mit einem Hemocytometer und Samen ~1.5 X 10 7 Zellen in e...

<ol>
	<li>Bertoli, C., Skotheim, J. M., de Bruin, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell+cycle+transcription+during+G1+and+S+phases.">Control of cell cycle transcription during G1 and S phases.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 518-528 (2013).</li><li>Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G1+cell-cycle+control+and+cancer.">G1 cell-cycle control and cancer.</a> Nature. 432 (7015), 298-306 (2004).</li><li>Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinoblastoma+protein+and+cell+cycle+control.">The retinoblastoma protein and cell cycle control.</a> Cell. 81 (3), 323-330 (1995).</li><li>Giacinti, C., Giordano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RB+and+cell+cycle+progression.">RB and cell cycle progression.</a> Oncogene. 25 (38), 5220-5227 (2006).</li><li>Burkhart, D. L., Sage, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanisms+of+tumour+suppression+by+the+retinoblastoma+gene.">Cellular mechanisms of tumour suppression by the retinoblastoma gene.</a> Nat Rev Cancer. 8 (9), 671-682 (2008).</li><li>Ferreira, R., Naguibneva, I., Pritchard, L. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypo-phosphorylation+of+the+retinoblastoma+protein+(pRb)+by+cyclin+D:Cdk4/6+complexes+results+in+active+pRb.">Hypo-phosphorylation of the retinoblastoma protein (pRb) by cyclin D:Cdk4/6 complexes results in active pRb.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (20), 10699-10704 (1997).</li><li>Ledl, A., Schmidt, D., Muller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+oncoproteins+E1A+and+E7+and+cellular+LxCxE+proteins+repress+SUMO+modification+of+the+retinoblastoma+tumor+suppressor.">Viral oncoproteins E1A and E7 and cellular LxCxE proteins repress SUMO modification of the retinoblastoma tumor suppressor.</a> Oncogene. 24 (23), 3810-3818 (2005).</li><li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+SUMO-2/3+induced+senescence+through+p53-+and+pRB-mediated+pathways.">Expression of SUMO-2/3 induced senescence through p53- and pRB-mediated pathways.</a> J Biol Chem. 281 (47), 36221-36227 (2006).</li><li>Meng, F., Qian, J., Yue, H., Li, X., Xue, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMOylation+of+Rb+enhances+its+binding+with+CDK2+and+phosphorylation+at+early+G1+phase.">SUMOylation of Rb enhances its binding with CDK2 and phosphorylation at early G1 phase.</a> Cell Cycle. 15 (13), 1724-1732 (2016).</li><li>Geiss-Friedlander, R., Melchior, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concepts+in+sumoylation:+a+decade+on.">Concepts in sumoylation: a decade on.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 947-956 (2007).</li><li>Flotho, A., Melchior, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sumoylation:+a+regulatory+protein+modification+in+health+and+disease.">Sumoylation: a regulatory protein modification in health and disease.</a> Annu Rev Biochem. 82, 357-385 (2013).</li><li>Eifler, K., Vertegaal, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMOylation-Mediated+Regulation+of+Cell+Cycle+Progression+and+Cancer.">SUMOylation-Mediated Regulation of Cell Cycle Progression and Cancer.</a> Trends Biochem Sci. 40 (12), 779-793 (2015).</li><li>Wilkinson, K. A., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms,+regulation+and+consequences+of+protein+SUMOylation.">Mechanisms, regulation and consequences of protein SUMOylation.</a> Biochem J. 428 (2), 133-145 (2010).</li><li>Gill, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO+and+ubiquitin+in+the+nucleus:+different+functions,+similar+mechanisms.">SUMO and ubiquitin in the nucleus: different functions, similar mechanisms.</a> Genes Dev. 18 (17), 2046-2059 (2004).</li><li>Sharma, P., Kuehn, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SENP1-modulated+sumoylation+regulates+retinoblastoma+protein+(RB)+and+Lamin+A/C+interaction+and+stabilization.">SENP1-modulated sumoylation regulates retinoblastoma protein (RB) and Lamin A/C interaction and stabilization.</a> Oncogene. 35 (50), 6429-6438 (2016).</li><li>Jakobs, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubc9+fusion-directed+SUMOylation+(UFDS):+a+method+to+analyze+function+of+protein+SUMOylation.">Ubc9 fusion-directed SUMOylation (UFDS): a method to analyze function of protein SUMOylation.</a> Nat Methods. 4 (3), 245-250 (2007).</li><li>Gareau, J. R., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SUMO+pathway:+emerging+mechanisms+that+shape+specificity,+conjugation+and+recognition.">The SUMO pathway: emerging mechanisms that shape specificity, conjugation and recognition.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (12), 861-871 (2010).</li><li>Bernier-Villamor, V., Sampson, D. A., Matunis, M. J., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+E2-mediated+SUMO+conjugation+revealed+by+a+complex+between+ubiquitin-conjugating+enzyme+Ubc9+and+RanGAP1.">Structural basis for E2-mediated SUMO conjugation revealed by a complex between ubiquitin-conjugating enzyme Ubc9 and RanGAP1.</a> Cell. 108 (3), 345-356 (2002).</li><li>Saitoh, H., Hinchey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+heterogeneity+of+small+ubiquitin-related+protein+modifiers+SUMO-1+versus+SUMO-2/3.">Functional heterogeneity of small ubiquitin-related protein modifiers SUMO-1 versus SUMO-2/3.</a> J Biol Chem. 275 (9), 6252-6258 (2000).</li><li>Ayaydin, F., Dasso, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+in+vivo+dynamics+of+vertebrate+SUMO+paralogues.">Distinct in vivo dynamics of vertebrate SUMO paralogues.</a> Mol Biol Cell. 15 (12), 5208-5218 (2004).</li></ol>

Dieses Whitepaper beschreibt ein Protokoll zum erkennen und analysieren der endogenen Sumoylierung Rb in menschlichen Zellen. Da diese Methode speziell auf das endogene Rb-Protein ohne jede Abwechslung der globalen SUMO-bezogenen Signal ausgerichtet ist, ist es ein wichtiges Instrument für die Untersuchung von Rb-SUMO Modifikation unter völlig natürlichen physiologischen Umständen.
Um dieses Ziel zu erreichen, ist es wichtig, im Hinterkopf behalten, dass: 1) Obwohl SUMO vier Isoformen (SUM...

Die genaue Steuerung der Zellzyklus Progression in eukaryontischen Zellen beruht auf einer engen regulatorischen Netzwerk sorgt dafür, dass bestimmte Ereignisse in einer geordneten Art und Weise1,2stattfinden. Einer der wichtigsten Akteure in diesem Netzwerk ist das Retinoblastom (Rb)-Protein, das erste geklonte Tumorsuppressor1,3. Das Rb-Protein wird angenommen, dass ein negativer Regulator der Zellzyklus Progression, vor allem für die G0/G1 S Phasenübergang und Tumor Wachstum4,5. Ausfall der Rb führt entweder direkt auf die am häufigsten verwendeten intraokularen Bösartigkeit bei Kindern, Retinoblastom, oder trägt zur Entwicklung von vielen anderen Arten von Krebs5. Darüber hinaus engagiert sich die Rb in viele zelluläre Signalwege einschließlich der Zelldifferenzierung, Chromatin umgestalten und Mitochondrien-vermittelten Apoptose3,6,7.
Post-translationalen Modifikationen spielen eine Schlüsselrolle bei der Regulation des RB Funktion8,9. Phosphorylierung ist eine solche Änderung, und es führt in der Regel zu Rb Inaktivierung. In ruhenden G0-Zellen ist Rb aktiv mit einem niedrigen Phosphorylierung. Fortschritt durch G0/G1-Phase Zellen, ist Rb sequenziell hyper phosphoryliert durch eine Reihe von cyclin-abhängige Proteinkinasen (CDKs) und Cyclin, z. B. cyclin E/CDK2 und cyclin D/CDK4/6, die Rb zu inaktivieren und seine Fähigkeit, Zellzyklus unterdrücken zu beseitigen im Zusammenhang mit gen-Ausdruck4,10. RB konnte auch durch kleine Ubiquitin-bezogene Modifikator (SUMO)11,12,13geändert werden.
SUMO ist ein Ubiquitin-wie Protein, das eine Vielzahl von Zielproteinen kovalent verbunden ist. Es ist wichtig für verschiedene zelluläre Prozesse, einschließlich der Regulierung des Zellzyklus, Transkription, Protein zellulären Lokalisation und Abbau, Transport und DNA-Reparatur14,15,16, 17 , 18. der SUMO Konjugation Weg besteht aus dimeres SUMO E1 aktivierende Enzym SAE1/UBA2, der einzigen E2 conjugating Enzym Ubc9 und mehrere E3 Ligases SUMO-spezifische Proteasen. Im Allgemeinen müssen im Entstehen begriffenen SUMO Proteine proteolytisch verarbeitet werden, um die ältere Form zu erzeugen. Reife SUMO ist durch E1-Heterodimer aktiviert und dann auf das Enzym E2 Ubc9 übertragen. Schließlich die C-terminale Glycin Sumo ist kovalent an die Ziel-Lysin eines Substrats konjugiert, und dieser Prozess wird in der Regel durch E3 Ligases erleichtert. Das SUMO Protein kann durch spezifische Proteasen aus dem modifizierten Substrat entfernt werden. Eine frühere Studie von den Autoren dieses Papiers ergab, dass Sumoylierung Rb die Bindung an CDK2 erhöht, führt zu hyper-Phosphorylierung bei der frühen G1-Phase, ein Prozess, der für Zellzyklus Fortschreiten13notwendig ist. Wir zeigten auch, dass der Verlust der Rb Sumoylierung eine verminderte Zellvermehrung verursacht. Darüber hinaus wurde kürzlich gezeigt, dass die Sumoylierung Rb proteasomalen Umsatz, das Rb-Protein schützt somit die Erhöhung des Rb-Protein in Zellen19. Daher spielt Sumoylierung eine wichtige Rolle bei Rb-Funktion in verschiedenen zellulären Prozessen. Weiter zu studieren der funktionalen Konsequenz und physiologische Relevanz von Rb Sumoylierung, ist es wichtig, eine wirksame Methode um die SUMO-Status der Rb in menschlichen Zellen oder Geweben Patienten analysieren zu entwickeln.
Sumoylierung ist eine reversible, hoch dynamischen Prozess. So ist es in der Regel schwer zu erkennen, die SUMO-modifizierte Proteine vollständig endogenen Bedingungen. Dieses Papier stellt eine Methode, um endogene Rb Sumoylierung zu erkennen. Außerdem zeigt es, wie exogene Rb Sumoylierung Wildtyp Rb und seine SUMO-defizienten Mutation11erkannt. Jacobs Et Al. beschrieben vor allem eine Methode, um die SUMO-Änderung eines bestimmten Substrats speziell von Ubc9 unter der Regie von Fusion Sumoylierung (UFD)20erhöhen. Basierend auf dieser Methode, beschreibt dieses Protokoll die erzwungene Sumoylierung Rb und seiner funktionellen Konsequenzen zu analysieren. Da die Hunderte von SUMO Substrate bisher beschrieben worden sind und weitere vermeintliche SUMO Substrate aus vielen Proteomic basierende Assays identifiziert wurden, kann dieses Protokoll angewendet werden, um die SUMO-Modifikation dieser Proteine in menschlichen Zellen zu analysieren.

<table style="border-collapse:collapse;width:695pt" width="927">
	<colgroup>
		<col style="width:275pt" width="366" />
		<col style="width:206pt" width="275" />
		<col style="width:89pt" width="119" />
		<col style="width:125pt" width="167" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">11995065</td>
			<td class="xl68" style="width:125pt" width="167"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl68" height="21" style="height:15.75pt">Opti-MEM&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">31985070</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">26140079</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">15140122</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Phosphate-buffered Saline (PBS)</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">10010023</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Trypsin-EDTA</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">25200056</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Thymidine</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Sigma</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">T9250</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Nocodazole</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Sigma</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">M1404</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl68" height="21" style="height:15.75pt">propidium iodide</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">P3566</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Triton X-100&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">AMRESCO</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">694</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">RNase A&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">EN0531</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">N-Ethylmaleimide</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Sigma</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">E3876&#160;</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">AMRESCO</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">M107</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Nonidet P-40 Substitute (NP-40)</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">AMRESCO</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">M158</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">protease inhibitor</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Roche</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">5892970001</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Mouse Immunoglobulin G (IgG)</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">sc-2025</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl68" height="21" style="height:15.75pt">Rb antibody</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Cell Signaling Technology</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">#9309</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl68" height="21" style="height:15.75pt">Protein A/G-Sepharose Beads</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">sc-2003</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl68" height="21" style="height:15.75pt">Lipofectamine-2000&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">11668019</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="23" style="height:17.25pt">
			<td class="xl65" height="23" style="width:275pt;height:17.25pt" width="366">Nickel Nitrilotriacetic Acid (Ni-NTA) Agarose Beads</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Qiagen</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">30230</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Imidazole</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Sigma</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">I0250</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl68" height="21" style="height:15.75pt">4%-20% Gradient SDS-PAGE Gel</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">BIO-RAD</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">4561096</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl68" height="21" style="height:15.75pt">Polyvinylidene Difluoride (PVDF) Membrane</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Millipore</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">IPVH00010</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Tween-20</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">AMRESCO</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">M147</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Tubulin antibody</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Abmart</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">M30109</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">SUMO1 antibody</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">33-2044</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">GFP antibody</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Abmart</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">M20004</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="23" style="height:17.25pt">
			<td class="xl65" height="23" style="width:275pt;height:17.25pt" width="366">Horseradish Peroxidase (HRP) secondary antibody</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">715-035-150</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">enhanced chemiluminescence (ECL) Kit</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">32106</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo detection and analysis of rb protein sumoylation in human cells

Die post-translationalen Modifikationen von Proteinen sind entscheidend für die richtige Regulierung der intrazellulären Signaltransduktion. Unter diesen Änderungen ist kleine Ubiquitin-bezogene Modifikator (SUMO) ein Ubiquitin-wie Protein, das die Lysin-Rückstände verschiedener Zielproteine zu regulieren zelluläre Prozesse wie Gentranskription, DNA-Reparatur, Protein kovalent verbunden ist Interaktion und Abbau, subzelluläre Transport und Signaltransduktion. Die gängigste Methode zur Erkennung von Protein Sumoylierung basiert auf den Ausdruck und die Reinigung von rekombinanten tagged Proteinen in Bakterien, so dass für eine in-vitro- biochemische Reaktion, die ist einfach und eignet sich für den Umgang mit mechanistischen Fragen. Aufgrund der Komplexität des Prozesses der Sumoylierung in Vivoist es jedoch schwieriger zu erkennen und zu analysieren, Protein Sumoylierung in Zellen, vor allem unter endogenen Bedingungen. Eine aktuelle Studie von den Autoren dieses Artikels ergeben, dass endogene Retinoblastom (Rb) Protein, ein Tumorsuppressor, die entscheidend für die negative Regulierung des Zellzyklus Progression, speziell sumoyliert in der frühen G1-Phase. Dieses Whitepaper beschreibt ein Protokoll für die Erkennung und Analyse von Rb Sumoylierung endogene und exogene Bedingungen in menschlichen Zellen. Dieses Protokoll eignet sich für die phänotypische und funktionelle Untersuchung der SUMO-Änderung der Rb, sowie viele andere SUMO-gezielte Proteine in menschlichen Zellen.

Um endogene Rb Sumoylierung während Zellzyklus Progression zu erkennen, synchronisiert diese Studie zunächst HEK293 Zellen in fünf verschiedenen Phasen des Zellzyklus (G0, frühe G1, G1, S und G2/M), wie im Abschnitt "Protokoll" dieses Artikels beschrieben. Die Qualität der Synchronisation wurde bestätigt, indem die Nukleinsäure-Fleck mit Propidium Jodid gefolgt von Flow-Zytometrie-Analyse (Abbildung 1). Als nächstes wurden die Zellen gesammelt und dur...

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In Vivo Detection and Analysis of Rb Protein SUMOylation in Human Cells

Kleine Ubiquitin-bezogene Modifikator (SUMO) Familie Proteine sind an Lysin-Reste von Zielproteine, verschiedene zelluläre Prozesse regulieren konjugiert. Dieses Whitepaper beschreibt ein Protokoll für den Nachweis von Retinoblastom (Rb) Protein Sumoylierung endogene und exogene Bedingungen in menschlichen Zellen.

In Vivo Detektion und Analyse von Rb Protein Sumoylierung in menschlichen Zellen

The post-translational modifications of proteins are critical for the proper regulation of intracellular signal transduction. Among these modifications, ...

Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo Detection and Analysis of Rb Protein SUMOylation in Human Cells

In vitro and in vivo Bioluminescence Reporter Gene Imaging of Human Embryonic Stem Cells

In vitro und in vivo Biolumineszenz Reporter Gene Imaging von humanen embryonalen Stammzellen

The discovery of human embryonic stem cells (hESCs) has dramatically increased the tools available to medical scientists interested in regenerative ...

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Biologie

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Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Imaging Protein-Protein-Wechselwirkungen In vivo</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

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Phänotypische Analyse und Isolierung von murinen hämatopoetischen Stammzellen und Lineage-festgelegte Vorläuferzellen

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Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

Reprogrammierung menschlichen Körperzellen in induzierte pluripotente Stammzellen (IPSCs) mit retroviralen Vektoren mit GFP

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Effiziente Erzeugung Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen Körperzellen mit Sendai-Virus

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Profiling Individuelle humanen embryonalen Stammzellen durch quantitative RT-PCR

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Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Protein Purification Technik, die Erkennung von Sumoylierung und Ubiquitinierung von Bäckerhefe Kinetochor Proteine ​​Ndc10 und Ndc80 Erlaubt

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular ...

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Hochauflösende Zeitraffer-Imaging und automatische Analyse von Dynamik der Mikrotubuli in lebenden menschlichen Endothelzellen aus der Nabelvene

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