Name: in vivo detection and analysis of rb protein sumoylation in human cells
Uploaded: 2017-11-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Detection and Analysis of Rb Protein SUMOylation in Human Cells at JoVE.com

Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni dalla scienza e la tecnologia Commissione di Shanghai (Grant No. 14411961800) e la Fondazione nazionale di scienze naturali della Cina (Grant No. 81300805).

1. rilevamento di SUMOilazione Rb endogeno alla fase G1 precoce <ol><li>Cell sincronizzazione del ciclo cellulare e di cultura.
	<ol><li>Cellule HEK293 mantenere nel terreno di coltura contenente Dulbecco &#39; s Modified Eagle Medium (DMEM) completate con 1% penna-Strep e 10% siero bovino fetale (FBS) a 37 ° C e 5% di CO 2 in un incubatore.</li>
		<li>Sincronizzare le cellule HEK293 nella fase G0.
		<ol><li>Conteggio le cellule HEK293 utilizzando un emocitometro e seme ~1.5 x 10 7</s...

<ol>
	<li>Bertoli, C., Skotheim, J. M., de Bruin, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell+cycle+transcription+during+G1+and+S+phases.">Control of cell cycle transcription during G1 and S phases.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 518-528 (2013).</li><li>Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G1+cell-cycle+control+and+cancer.">G1 cell-cycle control and cancer.</a> Nature. 432 (7015), 298-306 (2004).</li><li>Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinoblastoma+protein+and+cell+cycle+control.">The retinoblastoma protein and cell cycle control.</a> Cell. 81 (3), 323-330 (1995).</li><li>Giacinti, C., Giordano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RB+and+cell+cycle+progression.">RB and cell cycle progression.</a> Oncogene. 25 (38), 5220-5227 (2006).</li><li>Burkhart, D. L., Sage, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanisms+of+tumour+suppression+by+the+retinoblastoma+gene.">Cellular mechanisms of tumour suppression by the retinoblastoma gene.</a> Nat Rev Cancer. 8 (9), 671-682 (2008).</li><li>Ferreira, R., Naguibneva, I., Pritchard, L. L., Ait-Si-Ali, S., Harel-Bellan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rb/chromatin+connection+and+epigenetic+control:+opinion.">The Rb/chromatin connection and epigenetic control: opinion.</a> Oncogene. 20 (24), 3128-3133 (2001).</li><li>Hilgendorf, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinoblastoma+protein+induces+apoptosis+directly+at+the+mitochondria.">The retinoblastoma protein induces apoptosis directly at the mitochondria.</a> Genes Dev. 27 (9), 1003-1015 (2013).</li><li>Munro, S., Carr, S. M., La Thangue, N. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypo-phosphorylation+of+the+retinoblastoma+protein+(pRb)+by+cyclin+D:Cdk4/6+complexes+results+in+active+pRb.">Hypo-phosphorylation of the retinoblastoma protein (pRb) by cyclin D:Cdk4/6 complexes results in active pRb.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (20), 10699-10704 (1997).</li><li>Ledl, A., Schmidt, D., Muller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+oncoproteins+E1A+and+E7+and+cellular+LxCxE+proteins+repress+SUMO+modification+of+the+retinoblastoma+tumor+suppressor.">Viral oncoproteins E1A and E7 and cellular LxCxE proteins repress SUMO modification of the retinoblastoma tumor suppressor.</a> Oncogene. 24 (23), 3810-3818 (2005).</li><li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+SUMO-2/3+induced+senescence+through+p53-+and+pRB-mediated+pathways.">Expression of SUMO-2/3 induced senescence through p53- and pRB-mediated pathways.</a> J Biol Chem. 281 (47), 36221-36227 (2006).</li><li>Meng, F., Qian, J., Yue, H., Li, X., Xue, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMOylation+of+Rb+enhances+its+binding+with+CDK2+and+phosphorylation+at+early+G1+phase.">SUMOylation of Rb enhances its binding with CDK2 and phosphorylation at early G1 phase.</a> Cell Cycle. 15 (13), 1724-1732 (2016).</li><li>Geiss-Friedlander, R., Melchior, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concepts+in+sumoylation:+a+decade+on.">Concepts in sumoylation: a decade on.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 947-956 (2007).</li><li>Flotho, A., Melchior, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sumoylation:+a+regulatory+protein+modification+in+health+and+disease.">Sumoylation: a regulatory protein modification in health and disease.</a> Annu Rev Biochem. 82, 357-385 (2013).</li><li>Eifler, K., Vertegaal, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMOylation-Mediated+Regulation+of+Cell+Cycle+Progression+and+Cancer.">SUMOylation-Mediated Regulation of Cell Cycle Progression and Cancer.</a> Trends Biochem Sci. 40 (12), 779-793 (2015).</li><li>Wilkinson, K. A., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms,+regulation+and+consequences+of+protein+SUMOylation.">Mechanisms, regulation and consequences of protein SUMOylation.</a> Biochem J. 428 (2), 133-145 (2010).</li><li>Gill, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO+and+ubiquitin+in+the+nucleus:+different+functions,+similar+mechanisms.">SUMO and ubiquitin in the nucleus: different functions, similar mechanisms.</a> Genes Dev. 18 (17), 2046-2059 (2004).</li><li>Sharma, P., Kuehn, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SENP1-modulated+sumoylation+regulates+retinoblastoma+protein+(RB)+and+Lamin+A/C+interaction+and+stabilization.">SENP1-modulated sumoylation regulates retinoblastoma protein (RB) and Lamin A/C interaction and stabilization.</a> Oncogene. 35 (50), 6429-6438 (2016).</li><li>Jakobs, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubc9+fusion-directed+SUMOylation+(UFDS):+a+method+to+analyze+function+of+protein+SUMOylation.">Ubc9 fusion-directed SUMOylation (UFDS): a method to analyze function of protein SUMOylation.</a> Nat Methods. 4 (3), 245-250 (2007).</li><li>Gareau, J. R., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SUMO+pathway:+emerging+mechanisms+that+shape+specificity,+conjugation+and+recognition.">The SUMO pathway: emerging mechanisms that shape specificity, conjugation and recognition.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (12), 861-871 (2010).</li><li>Bernier-Villamor, V., Sampson, D. A., Matunis, M. J., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+E2-mediated+SUMO+conjugation+revealed+by+a+complex+between+ubiquitin-conjugating+enzyme+Ubc9+and+RanGAP1.">Structural basis for E2-mediated SUMO conjugation revealed by a complex between ubiquitin-conjugating enzyme Ubc9 and RanGAP1.</a> Cell. 108 (3), 345-356 (2002).</li><li>Saitoh, H., Hinchey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+heterogeneity+of+small+ubiquitin-related+protein+modifiers+SUMO-1+versus+SUMO-2/3.">Functional heterogeneity of small ubiquitin-related protein modifiers SUMO-1 versus SUMO-2/3.</a> J Biol Chem. 275 (9), 6252-6258 (2000).</li><li>Ayaydin, F., Dasso, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+in+vivo+dynamics+of+vertebrate+SUMO+paralogues.">Distinct in vivo dynamics of vertebrate SUMO paralogues.</a> Mol Biol Cell. 15 (12), 5208-5218 (2004).</li></ol>

Questo articolo descrive un protocollo per rilevare e analizzare la sumolazione endogeno di Rb in cellule umane. Mentre questo metodo è specificamente incentrato sulla proteina Rb endogena senza qualsiasi alternanza di segnale correlate a SUMO globale, è un importante strumento per lo studio di modificazione di Rb-SUMO in circostanze fisiologiche completamente naturali.
Per raggiungere questo obiettivo, è importante tenere a mente che: 1) anche se SUMO comprende quattro isoforme (SUMO1-4, c...

L'accurato controllo della progressione del ciclo cellulare nelle cellule eucariotiche si basa su una fitta rete di regolamentazione, che garantisce che determinati eventi si svolgono in un determinato ordine1,2. Uno dei giocatori chiave in questa rete è la proteina del retinoblastoma (Rb), il primo clonato tumore soppressore1,3. La proteina Rb è pensata per essere un regolatore negativo della progressione del ciclo cellulare, soprattutto per il G0/G1 a transizione di fase S e tumore crescita4,5. Fallimento di funzione di Rb sia direttamente comporta la malignità intraoculare più comune nei bambini, retinoblastoma, o contribuisce allo sviluppo di molti altri tipi di cancro5. Rb è inoltre impegnato in molte vie cellulari tra cui la differenziazione delle cellule, di rimodellamento della cromatina e apoptosi mitocondrio-mediata3,6,7.
Modificazioni post-traduzionali giocano un ruolo fondamentale nella regolazione della funzione RB8,9. La fosforilazione è una tale modifica, e solitamente conduce all'inattivazione di Rb. In cellule quiescenti G0, Rb è attiva con un livello basso di fosforilazione. Come cellule progressi attraverso fase G0/G1, Rb è in sequenza iper-fosforilato da una serie di chinasi ciclina-dipendenti (CDKs) e cicline, ad esempio ciclina E/CDK2 e ciclina D/CDK4/6, che inattivano Rb ed eliminare la sua capacità di reprimere il ciclo cellulare correlate a gene espressione4,10. RB potrebbe essere modificata anche da piccole modificatore ubiquitina-correlate (SUMO)11,12,13.
SUMO è una proteina di ubiquitin-like che è legame covalente a una varietà di proteine bersaglio. È fondamentale per diversi processi cellulari, tra cui la regolazione del ciclo cellulare, trascrizione, localizzazione cellulare della proteina e degrado, trasporto ed il DNA riparazione14,15,16, 17 , 18. via di Coniugazione il SUMO è costituito dall'enzima d'attivazione di SUMO E1 dimerica SAE1/UBA2, l'unico enzima di coniugazione E2 Ubc9, multiple E3 ligasi e proteasi specifiche SUMO. Generalmente, il nascente proteine SUMO devono essere elaborati proteoliticamente per generare la forma matura. Il SUMO maturo è attivato dall'eterodimero E1 e quindi trasferita all'enzima E2 Ubc9. Infine, la glicina del C-terminale di SUMO covalenza è coniugata con la lisina di destinazione di un substrato, e questo processo è solitamente nei paraggi E3 ligasi. La proteina SUMO può essere rimosso dal substrato modificato da proteasi specifiche. Uno studio precedente dagli autori di questa carta ha rivelato che la sumoilazione di Rb aumenta suo legame con CDK2, che conduce alla fosforilazione di iper alla fase G1 precoce, un processo che è necessario per il ciclo cellulare progressione13. Inoltre abbiamo dimostrato che la perdita di Rb SUMOylation provoca una proliferazione delle cellule in diminuzione. Inoltre, è stato recentemente dimostrato che la sumoilazione di Rb protegge la proteina Rb da proteasomal fatturato, aumentando così il livello di proteina Rb in cellule19. Di conseguenza, sumolazione svolge un ruolo importante nella funzione di Rb in vari processi cellulari. Per studiare ulteriormente la conseguenza funzionale e rilevanza fisiologica di SUMOilazione Rb, è importante sviluppare un metodo efficace per analizzare lo stato SUMO di Rb in cellule o tessuti di pazienti umani.
Sumoilazione è un processo reversibile, altamente dinamico. Così, è solitamente difficile da rilevare le proteine SUMO-modificate in condizioni completamente endogene. Questo articolo presenta un metodo per rilevare endogeno Rb sumoilazione. Inoltre, viene illustrato come rilevare esogeno Rb sumoilazione di selvaggio-tipo Rb e sua mutazione di SUMO-carenti11. In particolare, Jacobs et al ha descritto un metodo per aumentare la modifica di SUMO di un substrato dato specificamente di Ubc9 fusion-regia SUMOylation (UFDS)20. Basato su questo metodo, questo protocollo viene descritto come analizzare la sumoilazione forzata di Rb e le sue conseguenze funzionali. Dato che centinaia di substrati SUMO è stati descritti precedentemente e più substrati putativi di SUMO sono stati identificati da molte analisi proteomica-based, questo protocollo può essere applicato per analizzare la SUMO-modifica di queste proteine in cellule umane.

<table style="border-collapse:collapse;width:695pt" width="927">
	<colgroup>
		<col style="width:275pt" width="366" />
		<col style="width:206pt" width="275" />
		<col style="width:89pt" width="119" />
		<col style="width:125pt" width="167" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">11995065</td>
			<td class="xl68" style="width:125pt" width="167"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl68" height="21" style="height:15.75pt">Opti-MEM&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">31985070</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">26140079</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">15140122</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Phosphate-buffered Saline (PBS)</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">10010023</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Trypsin-EDTA</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">25200056</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Thymidine</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Sigma</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">T9250</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Nocodazole</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Sigma</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">M1404</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl68" height="21" style="height:15.75pt">propidium iodide</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">P3566</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Triton X-100&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">AMRESCO</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">694</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">RNase A&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">EN0531</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">N-Ethylmaleimide</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Sigma</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">E3876&#160;</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">AMRESCO</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">M107</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Nonidet P-40 Substitute (NP-40)</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">AMRESCO</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">M158</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">protease inhibitor</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Roche</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">5892970001</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Mouse Immunoglobulin G (IgG)</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">sc-2025</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl68" height="21" style="height:15.75pt">Rb antibody</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Cell Signaling Technology</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">#9309</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl68" height="21" style="height:15.75pt">Protein A/G-Sepharose Beads</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">sc-2003</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl68" height="21" style="height:15.75pt">Lipofectamine-2000&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">11668019</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="23" style="height:17.25pt">
			<td class="xl65" height="23" style="width:275pt;height:17.25pt" width="366">Nickel Nitrilotriacetic Acid (Ni-NTA) Agarose Beads</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Qiagen</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">30230</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Imidazole</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Sigma</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">I0250</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl68" height="21" style="height:15.75pt">4%-20% Gradient SDS-PAGE Gel</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">BIO-RAD</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">4561096</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl68" height="21" style="height:15.75pt">Polyvinylidene Difluoride (PVDF) Membrane</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Millipore</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">IPVH00010</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Tween-20</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">AMRESCO</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">M147</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Tubulin antibody</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Abmart</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">M30109</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">SUMO1 antibody</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">33-2044</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">GFP antibody</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Abmart</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">M20004</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="23" style="height:17.25pt">
			<td class="xl65" height="23" style="width:275pt;height:17.25pt" width="366">Horseradish Peroxidase (HRP) secondary antibody</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">715-035-150</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">enhanced chemiluminescence (ECL) Kit</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">32106</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo detection and analysis of rb protein sumoylation in human cells

Le modificazioni post-traduzionali delle proteine sono fondamentali per la corretta regolazione della trasduzione del segnale intracellulare. Tra queste modifiche, piccolo ubiquitina-relativo modificatore (SUMO) è una proteina di ubiquitin-like che è legame covalente ai residui di lisina di una varietà di proteine bersaglio per regolare i processi cellulari, come la trascrizione del gene, riparazione del DNA, proteine interazione e degrado, trasporto subcellulare e trasduzione del segnale. L'approccio più comune al rilevamento della proteina sumoilazione si basa sull'espressione e purificazione delle proteine ricombinanti con tag nei batteri, consentendo un in vitro reazione biochimica che è semplice e adatto per l'indirizzamento meccanicistico domande. Tuttavia, a causa della complessità del processo di SUMOilazione in vivo, è più difficile rilevare e analizzare la proteina SUMOilazione nelle cellule, soprattutto quando si è in condizioni endogena. Uno studio recente dagli autori di questa carta ha rivelato che la proteina endogena retinoblastoma (Rb), un oncosoppressore che è essenziale per la regolazione negativa della progressione del ciclo cellulare, è specificamente SUMOilate alla fase G1 precoce. Questo articolo descrive un protocollo per la rilevazione e l'analisi di SUMOilazione Rb in condizioni sia endogene che esogene in cellule umane. Questo protocollo è appropriato per l'indagine fenotipica e funzionale di SUMO-modificazione del Rb, come pure molte altre proteine SUMO-mirati, in cellule umane.

Per rilevare endogeno Rb sumoilazione durante la progressione del ciclo cellulare, questo studio sincronizzato prima cellule HEK293 in cinque diverse fasi del ciclo cellulare (G0, primi G1, G1, S e G2/M), come descritto nella sezione protocollo di questa carta. La qualità di sincronizzazione è stata confermata usando la macchia di acido nucleico con ioduro di propidio seguito dall'analisi di citometria a flusso (Figura 1). Successivamente, le cellule sono s...

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In Vivo Detection and Analysis of Rb Protein SUMOylation in Human Cells

Proteine della famiglia piccolo ubiquitina-relativo modificatore (SUMO) sono coniugati ai residui di lisina delle proteine bersaglio per regolare i vari processi cellulari. Questo articolo descrive un protocollo per la rilevazione della proteina del retinoblastoma (Rb) sumoilazione in condizioni endogene ed esogene in cellule umane.

In Vivo Rilevamento e analisi di Rb sumoilazione di proteine in cellule umane

The post-translational modifications of proteins are critical for the proper regulation of intracellular signal transduction. Among these modifications, ...

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JoVE Journal

Biology

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