Name: characterizing cell migration within three-dimensional in vitro wound environments
Uploaded: 2017-08-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments at JoVE.com

इस काम के लिए धन अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन (16SDG29870005) और उत्तरी कैरोलिना राज्य विश्वविद्यालय अनुसंधान और नवाचार बीज वित्त पोषण के माध्यम से प्रदान की गई थी ।

1. Day 1: सेल और रिएजेंट की तैयारी नोट: नमूनों के संदूषण को रोकने के लिए सभी सेल और रिएजेंट तैयारी एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में किया जाना चाहिए । 
<ol> <li> उष्ण छान Dulbecco & #39; s संशोधित ईगल & #39; एस मध्यम (D...

<ol>
	<li>Chester, D., Brown, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+biophysical+properties+of+provisional+matrix+proteins+in+wound+repair.">The role of biophysical properties of provisional matrix proteins in wound repair.</a> Matrix Biol. , (2016).</li><li>Martin, P., Leibovich, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+cells+during+wound+repair:+the+good,+the+bad+and+the+ugly.">Inflammatory cells during wound repair: the good, the bad and the ugly.</a> Trends in Cell Biology. 15 (11), 599-607 (2005).</li><li>Lin, B., Yin, T., Wu, Y. 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इस प्रोटोकॉल एक में इन विट्रो 3d मॉडल के माध्यम से घाव हीलिंग जुड़े ECMs में सेल प्रवास की परीक्षा के लिए अनुमति देता है । प्रक्रिया के समुचित निष्पादन में एक महत्वपूर्ण कदम fibroblast spheroids का समुचित विकास है; त?...

घाव भरने एक जटिल प्रक्रिया है जो ऊतक अखंडता की बहाली में चोट के बाद परिणाम है । इस प्रक्रिया में चार अतिव्यापी रक्तस्तम्भन, सूजन, प्रसार और remodeling, जो घुलनशील cues, सेल मैट्रिक्स बातचीत, और सेल-सेल संचार का एक जटिल संयोजन द्वारा विनियमित रहे है द्वारा शामिल चरणों में टूट गया है । 1 , 2 इन cues के आर्केस्ट्रा सहित घाव भरने में सेलुलर प्रतिक्रियाओं के एक भीड़ को नियंत्रित करता है, महत्वपूर्ण बात, सेल माइग्रेशन । 3 , 4 सेल माइग्रेशन सेलुलर phenotypes और extracellular मैट्रिक्स वातावरण के जैव रासायनिक और भौतिक गुणों दोनों पर निर्भर एक अत्यधिक गतिशील प्रक्रिया है । 5 कोशिकाओं को लगातार integrin-मध्यस्थता रास्ते के माध्यम से अपने extracellular मैट्रिक्स वातावरण की जांच; इस प्रक्रिया में कोशिकाओं स्थलाकृति, कठोरता, और प्रसूति सहित मैट्रिक्स संपत्तियों की एक विस्तृत श्रृंखला भावना के लिए अनुमति देता है । कक्ष माइग्रेशन का दो-आयामी (2d) विश्लेषण दर्शाता है कि माइग्रेशन actin रेशा बंडलों की पीढ़ी के माध्यम से अग्रणी बढ़त पर lamellipodia गठन से प्रेरित है । अग्रणी धार में फोकल आसंजन के बाद गठन, actomyosin संचालित संकुचन और पीछे किनारे पर कर्षण के साथ संयोजन में, सेल आगे ड्राइव । 6 तीन आयामी (3 डी) सेलुलर प्रवास वर्तमान में अच्छी तरह से समझ में नहीं है, तथापि, हाल के अध्ययनों से स्पष्ट है कि 3 डी प्रवास अफोर्ड 2d में तंत्र वर्णित से अलग है और संभावना है alterative तंत्र द्वारा संचालित है । उदाहरण के लिए, पेट्री एट अलद्वारा हाल ही में अध्ययन । प्रदर्शन किया है कि, ECM के गुणों पर निर्भर करता है, 3d मैट्रिक्स में कोशिकाओं lamellipodium और lobopodium के बीच स्विच कर सकते है प्रेरित प्रवास के तंत्र । 7 क्योंकि सेल प्रवास घाव भरने की प्रतिक्रिया के एक महत्वपूर्ण घटक है, सेल प्रवास के 3 डी मॉडल घाव भरने के दौरान विभिन्न उत्तेजनाओं के लिए शारीरिक प्रतिक्रियाओं को समझने के लिए महत्वपूर्ण हैं । 2d सतहों पर सेल प्रवासी व्यवहार 3 डी मैट्रिक्स में प्रवास से बहुत भिन्न दिखाया गया है, हालांकि, अच्छी तरह से स्थापित खरोंच परख सहित घाव भरने की प्रक्रिया के दौरान सेल प्रवास के इन विट्रो मॉडल में सबसे वर्तमान, 2d का उपयोग monolayer संस्कृतियों । 5 , ६ , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 और हाल ही में विकसित की है परख एक 3 डी मैट्रिक्स का उपयोग किया है, लेकिन अभी भी मैट्रिक्स के शीर्ष पर एक monolayer में संस्कृति कोशिकाओं, इस प्रकार वास्तव में तीन vivo में सेल पर्यावरण के आयामी दोहराऊंगा की क्षमता सीमित । 15
इस के साथ साथ वर्णित विधि का उद्देश्य एक शारीरिक रूप से प्रासंगिक 3 डी मॉडल में सेल प्रवास का अध्ययन करने के लिए है, बजाय एक 2d सतह पर, आदेश में लागू उत्तेजनाओं के साथ जुड़े प्रवास प्रतिक्रियाओं की एक और अधिक मजबूत समझ हासिल करने के लिए । इस विधि में सेल माइग्रेशन के मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है एक 3d फाइब्रिन थक्का मैट्रिक्स के भीतर कारकों की उपस्थिति में कि सक्रिय या बाधित रास्ते सेल माइग्रेशन के साथ जुड़े. इस विधि के लिए एक फाइब्रिन मैट्रिक्स चुना गया था फाइब्रिन गंभीर भूमिका के कारण घाव भरने की प्रारंभिक अवस्था में खेलता है; चोट के बाद, एक फाइब्रिन थक्का घाव के वातावरण के भीतर गठन के लिए रक्त की कमी स्टेम और ऊतक की मरंमत और remodeling के दौरान प्रारंभिक सेल घुसपैठ के लिए एक पाड़ के रूप में कार्य करता है । 2 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 इसके अतिरिक्त, फाइब्रिन नैदानिक एक शल्य सीलेंट और sealants की संरचना के रूप में प्रयोग किया जाता है सेल प्रवास और अंतिम उपचार परिणामों से बंधा हुआ है । कॉक्स एट अलद्वारा पिछले एक अध्ययन । फाइब्रिन एक फाइब्रिन सीलेंट के अनुकूलन के प्रयोजन के लिए बदलती फाइब्रिन और thrombin सांद्रता के शामिल थक्के के साथ fibroblast प्रवास की जांच की । इन अध्ययनों में, प्लास्टिक के व्यंजन पर फाइब्रिन के थक्के के बाहर कोशिकाओं का माइग्रेशन मात्रा था । 20 यहां हम एक तरीका है कि 3 डी फाइब्रिन वातावरण के भीतर कोशिकाओं के प्रवास के ठहराव के लिए अनुमति देता है वर्तमान । जबकि विधि इस प्रोटोकॉल में वर्णित विशेष रूप से फाइब्रिन का उपयोग करता है, इस मॉडल को आसानी से इस तरह के रूप में वांछित कोलेजन या अंय 3 डी मैट्रिक्स के रूप में वैकल्पिक मैट्रिक्स सामग्री का उपयोग संशोधित किया जा सकता है । इसके अतिरिक्त, हम इस परख में fibroblast spheroids का उपयोग वर्तमान क्योंकि घाव बिस्तर में fibroblast प्रवास extracellular मैट्रिक्स संश्लेषण और ऊतक की मरंमत के लिए सर्वोपरि महत्व का है/ हालांकि, मरम्मत प्रक्रिया के दौरान न्यूट्रोफिल घाव बिस्तर में स्थानांतरित करने के लिए पहला सेल प्रकार हैं, मैक्रोफेज द्वारा पीछा किया । Fibroblasts तो घाव पर्यावरण लगभग ४८ घंटे के प्रारंभिक चोट के बाद घुसपैठ शुरू, घाव भरने की प्रक्रिया के प्रफलन चरण की शुरुआत में । 19 यह परख आसानी से न्यूट्रोफिल, मैक्रोफेज, या अंय प्रकार के सेल को शामिल करने के लिए कैसे फाइब्रिन थक्का संरचना में परिवर्तन का आकलन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है इन सेल प्रकार के प्रवास को प्रभावित । 21
इस परख को लागू करने, पहले, एक fibroblast अंडाकार पहले स्टेम सेल संस्कृति के लिए वर्णित तकनीकों का एक संशोधन का उपयोग कर बनाई है । 22 fibroblast अंडाकार बाद में एक 3 डी फाइब्रिन मैट्रिक्स में स्थानांतरित कर रहा है, और फिर से वृद्धि आसानी से नजर रखी जा सकती है और कई दिनों में मात्रा । इस प्रोटोकॉल खाते में एक फाइब्रिन मैट्रिक्स के भीतर 3 डी सेल spheroids embedding द्वारा शारीरिक प्रणालियों के 3 डी लेता है, इस प्रकार प्रासंगिकता में सीमाओं से बचने के बारे में मॉडल प्रवासी व्यवहार करने के लिए एक सेल monolayer के साथ एक 2d विकास की सतह का उपयोग करके लाया, जबकि अभी भी सेल व्यवहार के मूल्यांकन के लिए एक अत्यधिक नियंत्रित में इन विट्रो वातावरण में अनुमति देता है ।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="692">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Materials</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:267px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium, 4.5 g/L Glucose, w/ Sodium Pyruvate, w/out L-Glutamine</td>
			<td style="width:91px;">VWR</td>
			<td>VWRL0148-0500</td>
			<td style="width:217px;">DMEM already containing L-glutamine can also be used</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">100mm Tissue Culture Dish, Non-Treated, Sterilized, Non-Pyrogenic</td>
			<td style="width:91px;">VWR</td>
			<td>10861-594</td>
			<td style="width:217px;">Dishes of any size can be used for hanging drop culture&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:267px;">Fetal Bovine Serum from USDA approved countries, heat inactivated, sterile-filtered, cell culture tested</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>12306C-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:91px;">Fisher Scientific</td>
			<td>ICN1680149</td>
			<td style="width:217px;">Not needed if using DMEM that already contains L-glutamine&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:267px;">Penicillin-Streptomycin Solution stabilized, sterile-filtered, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">Human Dermal Fibroblasts, neonatal</td>
			<td style="width:91px;">Thermo Fisher</td>
			<td>C0045C</td>
			<td style="width:217px;">Can be replaced with other cell type of interest</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">21 G x 1 1/2&#39; needle</td>
			<td style="width:91px;">BD&#160;</td>
			<td>305167</td>
			<td>22 G x 1 1/2 needles will also work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">1 mL syringe</td>
			<td style="width:91px;">VWR</td>
			<td>89174-491</td>
			<td>Syringes of any volume can be used</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:267px;">Cell Culture Multiwell Plates, Polystyrene, Greiner Bio-One (Individially Wrapped) (48 wells)</td>
			<td style="width:91px;">VWR</td>
			<td>82051-004&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:267px;">Human Fibrinogen - Plasminogen, von Willebrand Factor and Fibronectin Depleted</td>
			<td style="width:91px;">Enzyme Research Laboratories</td>
			<td>FIB 3</td>
			<td style="width:217px;">Can be replaced with matrix protein of interest</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:267px;">Human Alpha Thrombin</td>
			<td style="width:91px;">Enzyme Research Laboratories</td>
			<td>HT 1002a</td>
			<td style="width:217px;">May not be necessary depending on matrix protein of interest</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Equipment</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">BSL2 cell culture hood</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Cell culture incubator</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">Inverted microscope with 10X objective</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">Centrifuge compatibile with 15 mL tubes</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing cell migration within three-dimensional in vitro wound environments

वर्तमान में, सबसे विट्रो में घाव भरने के मॉडल, इस तरह के रूप में अच्छी तरह से स्थापित खरोंच परख, सेल प्रवासन और दो आयामी सतहों पर घाव बंद होने का अध्ययन शामिल है । हालांकि, शारीरिक वातावरण में जो vivo घाव भरने में जगह लेता है तीन आयामी बजाय दो आयामी है । यह तेजी से स्पष्ट होता जा रहा है कि सेल व्यवहार दो आयामी बनाम तीन आयामी वातावरण में बहुत अलग है; इसलिए, वहां अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक के लिए एक की जरूरत है इन विट्रो मॉडल घाव बंद करने में सेल माइग्रेशन व्यवहार का अध्ययन करने के लिए । विधि यहां वर्णित एक तीन आयामी मॉडल में सेल प्रवास के अध्ययन के लिए अनुमति देता है कि बेहतर शारीरिक स्थितियों को दर्शाता है पहले से दो आयामी खरोंच परख की स्थापना की । इस मॉडल का उद्देश्य एक फाइब्रिन मैट्रिक्स के भीतर समर्थक या विरोधी प्रवासी कारकों की उपस्थिति में एंबेडेड एक अंडाकार शरीर से दूर सेल प्रवास की परीक्षा के माध्यम से सेल की वृद्धि का मूल्यांकन करने के लिए है । इस विधि का प्रयोग, एक तीन आयामी मैट्रिक्स में अंडाकार शरीर से कोशिका वृद्धि और देखा जा सकता है आसानी से brightfield माइक्रोस्कोपी और अंडाकार शरीर क्षेत्र के विश्लेषण के माध्यम से समय पर quantifiable है । सेल माइग्रेशन पर प्रो-प्रवासी और/या निरोधात्मक कारकों के प्रभाव का मूल्यांकन इस सिस्टम में भी किया जा सकता है । इस विधि में तीन आयामी घाव संबद्ध मैट्रिक्स में इन विट्रोमें सेल माइग्रेशन का विश्लेषण की एक सरल विधि के साथ शोधकर्ताओं प्रदान करता है, इस प्रकार की प्रासंगिकता में वृद्धि इन विट्रो सेल अध्ययन से पहले vivo में पशु का उपयोग करने के लिए मॉडल.

अंडाकार संस्कृति को सफलतापूर्वक fibroblast प्रवास पर समर्थक और विरोधी प्रवासी एजेंटों के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग किया जा सकता इन विट्रो में 3d fibroblast spheroids ७२ घंटे की अवधि में फां...

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Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य एक तीन आयामी फाइब्रिन मैट्रिक्स के भीतर सेल प्रवास पर समर्थक और विरोधी प्रवासी कारकों के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए है ।

तीन आयामी के भीतर निस्र्पक कक्ष माइग्रेशन इन विट्रो घाव वातावरण

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

तीन आयामी ऑप्टिकल संकल्प Photoacoustic माइक्रोस्कोपी

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Electric Field-controlled Directed Migration of Neural Progenitor Cells in 2D and 3D Environments

इलेक्ट्रिक फील्ड नियंत्रित 2 डी और 3 डी वातावरण में तंत्रिका कोशिकाओं पूर्वज निर्देशित प्रवासन

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the ...

Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

लाइव सेल प्रवास के लिए जाते एक तीन आयामी मैट्रिक्स में प्रोटीन fluorescently टैग व्यक्त कोशिकाओं की इमेजिंग

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

Microinjection घाव परख और<em&gt; में विवो</em&gt; एपिडर्मल का स्थानीयकरण रिस्पांस रिपोर्टर में घाव<em&gt; ड्रोसोफिला</em&gt; भ्रूण.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

एक तीन आयामी मैट्रिक्स कोलेजन के भीतर सेल प्रवास का विश्लेषण

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

एक तीन आयामी पूर्ण मोटाई त्वचा की पीढ़ी के बराबर है और स्वचालित लोग घायल हो गए

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

खंगाला मानव कॉर्निया की तरह उपकला (RHCE) ऊतक मॉडल का उपयोग नेत्र परेशान रसायन का खतरा पहचान के लिए आंखों में जलन टेस्ट (ईआईटी)

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

तैयारी और विश्लेषण<em&gt; इन विट्रो</em&gt; तीन आयामी स्तन कार्सिनोमा Surrogates

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

इंजीनियरिंग तीन आयामी उपकला ऊतकों कोशिकी मैट्रिक्स के भीतर एम्बेडेड

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

संवर्धन स्तनधारी कोशिकाओं में तीन आयामी पेप्टाइड पाड़

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...