Name: characterizing cell migration within three-dimensional in vitro wound environments
Uploaded: 2017-08-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments at JoVE.com

Finanziamento per questo lavoro è stato fornito attraverso l'American Heart Association (16SDG29870005) e la North Carolina State University Research e innovazione finanziamenti di avviamento.

1. giorno 1: cella e preparazione dei reagenti Nota: tutti i cellulari e reagente preparazione deve essere eseguita in un armadietto per prevenire la contaminazione dei campioni di sicurezza biologica.
<ol><li>Calda filtrata Dulbecco &#39; s Modified Eagle &#39; s Medium (DMEM), siero bovino fetale (FBS), L-glutamina e penicillina/streptomicina in bagnomaria a 37 ° C.</li>
	<li>Media di fibroblasti cutanei umani neonatale (HDFn) di preparare completando riscaldato DMEM con 10% FBS, 1% di ...

<ol>
	<li>Chester, D., Brown, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+biophysical+properties+of+provisional+matrix+proteins+in+wound+repair.">The role of biophysical properties of provisional matrix proteins in wound repair.</a> Matrix Biol. , (2016).</li><li>Martin, P., Leibovich, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+cells+during+wound+repair:+the+good,+the+bad+and+the+ugly.">Inflammatory cells during wound repair: the good, the bad and the ugly.</a> Trends in Cell Biology. 15 (11), 599-607 (2005).</li><li>Lin, B., Yin, T., Wu, Y. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonpolarized+signaling+reveals+two+distinct+modes+of+3D+cell+migration.">Nonpolarized signaling reveals two distinct modes of 3D cell migration.</a> J Cell Biol. 197 (3), 439-455 (2012).</li><li>Carlson, M. W., Dong, S., Garlick, J. A., Egles, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-Engineered+Models+for+the+Study+of+Cutaneous+Wound-Healing.">Tissue-Engineered Models for the Study of Cutaneous Wound-Healing.</a> Bioengineering Research of Chronic Wounds. , 263-280 (2009).</li><li>Doyle, A. D., Wang, F. W., Matsumoto, K., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-dimensional+topography+underlies+three-dimensional+fibrillar+cell+migration.">One-dimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration.</a> J Cell Bio. 184 (4), 481-490 (2009).</li><li>Fraley, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinctive+role+for+focal+adhesion+proteins+in+three-dimensional+cell+motility.">A distinctive role for focal adhesion proteins in three-dimensional cell motility.</a> Nat Cell Biol. 12 (6), 598-604 (2010).</li><li>Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+versus+directionally+persistent+cell+migration.">Random versus directionally persistent cell migration.</a> Nat Rev. Mol Cell Biol. 10 (8), 538-549 (2009).</li><li>Rommerswinkel, N., Niggemann, B., Keil, S., Z&#228;nker, K. S., Dittmar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Cell+Migration+within+a+Three-dimensional+Collagen+Matrix.">Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix.</a> J Vis Exp. (92), (2014).</li><li>Jonkman, J. E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+the+wound+healing+assay+using+live-cell+microscopy.">An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy.</a> Cell Adh Migr. 8 (5), 440-451 (2014).</li><li>L&#228;mmermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+leukocyte+migration+by+integrin-independent+flowing+and+squeezing.">Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing.</a> Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).</li><li>Chen, Z., Yang, J., Wu, B., Tawil, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Three-Dimensional+Wound+Healing+Model.">A Novel Three-Dimensional Wound Healing Model.</a> J Dev Biol. 2 (4), 198-209 (2014).</li><li>Ross, R., Benditt, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing+and+collagen+formation.">Wound healing and collagen formation.</a> The J Cell Biol. 12 (3), 533-551 (1962).</li><li>Sproul, E. P., Argraves, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cytokine+axis+regulates+elastin+formation+and+degradation.">A cytokine axis regulates elastin formation and degradation.</a> Matrix Biol. 32 (2), 86-94 (2013).</li><li>Almine, J. F., Wise, S. G., Weiss, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastin+signaling+in+wound+repair.">Elastin signaling in wound repair.</a> Birth Defects REs C Embryo Today. 96 (3), 248-257 (2012).</li><li>Tracy, L. E., Minasian, R. A., Caterson, E. 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Questo protocollo permette per l'esame della migrazione cellulare nella guarigione delle ferite associato ECMs attraverso un modello 3D in vitro . Un passo fondamentale nella corretta esecuzione della procedura è il corretto sviluppo di sferoidi del fibroblasto; concentrazione di cellule durante la preparazione è stata ottimizzata per dare una concentrazione iniziale di 2.500 cellule/goccia, permettendo sferoidi per formare in modo affidabile su un periodo di incubazione di 72 h. Se vengono utilizzato un numer...

Guarigione delle ferite è un processo complesso che comporta il ripristino dell'integrità del tessuto dopo la lesione. Questo processo è suddiviso in quattro fasi sovrapposte di emostasi, infiammazione, proliferazione e rimodellamento, che ciascuno sono regolati da una complessa combinazione di stecche solubile, interazioni cellula-matrice e comunicazioni cellula-cellula. 1 , 2 l'orchestrazione di questi spunti controlla una moltitudine di risposte cellulari nella guarigione delle ferite, tra cui, importante, migrazione delle cellule. 3 , 4 migrazione cellulare è un processo altamente dinamico dipendono sia fenotipi cellulari e le proprietà biochimiche e biofisiche del milieu di matrice extracellulare. 5 cellule continuamente sonda loro ambiente extracellulare attraverso vie di integrina-mediata; Questo processo permette che le cellule di percepire una vasta gamma di proprietà di matrice tra cui topografia, rigidità e confinamento. Bidimensionale (2D) analisi della migrazione cellulare dimostra che la migrazione è guidato da formazione di lamellipodi all'avanguardia attraverso la generazione di fasci di filamenti di actina. Conseguente formazione di adesioni focali all'avanguardia, in combinazione con actomiosina guidato contrazione e retrazione del bordo posteriore, guida la cellula in avanti. 6 migrazione cellulare tridimensionale (3D) attualmente non è ben compreso, tuttavia, studi recenti dimostrano che la migrazione 3D è nettamente diverso da quello il afore descritto meccanismo in 2D e probabilmente è guidato dai meccanismi alterative. Ad esempio, gli studi recenti da Petrie et al. ha dimostrato che, a seconda delle proprietà del ECM, celle in matrici 3D possono passare tra lamellipodio e lobopodium guidato meccanismi di migrazione. 7 perché la migrazione cellulare è una componente critica della ferita risposta curativa, modelli 3D di migrazione delle cellule sono critici per capire le risposte fisiologiche a vari stimoli durante la guarigione della ferita. Anche se il comportamento migratore cella su superfici 2D è stato indicato per variare notevolmente dalla migrazione in matrici 3D, modelli più attuali in vitro della migrazione cellulare durante il processo, compreso il saggio di gratta e Vinci ben consolidato, di cicatrizzazione utilizzano 2D colture dello strato monomolecolare. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 più recentemente sviluppati saggi hanno utilizzato una matrice 3D, ma ancora della coltura le cellule in un monostrato in cima la matrice, limitando così la possibilità di veramente ricapitolare la tridimensionalità dell'ambiente delle cellule in vivo. 15
Lo scopo del metodo descritto nel presente documento è quello di studiare la migrazione delle cellule in un modello 3D fisiologicamente rilevante, piuttosto che su una superficie 2D, al fine di ottenere una comprensione più robusta delle risposte di migrazione associati con gli stimoli applicati. Questo metodo permette la valutazione della migrazione cellulare all'interno di una matrice di coagulo di fibrina 3D in presenza di fattori che attivano o inibiscono vie connesse con migrazione cellulare. Una matrice di fibrina è stato scelto per questo metodo per i giochi di ruolo critico della fibrina nelle prime fasi di guarigione della ferita; seguenti lesioni, un coagulo di fibrina sono formata all'interno degli ambienti di ferita per arginare la perdita di sangue e serve come impalcatura per infiltrazione iniziale delle cellule durante la riparazione dei tessuti e il rimodellamento. 2 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 inoltre, fibrina è usata clinicamente come sigillante chirurgico e la composizione dei sigillanti è stata legata alla migrazione cellulare e risultati di guarigione definitiva. Uno studio precedente da Cox et al. studiato la migrazione dei fibroblasti con coaguli di fibrina composto da varia fibrina e trombina concentrazioni allo scopo di ottimizzare un sigillante di fibrina. In questi studi, è stato quantificato la migrazione delle cellule fuori coaguli di fibrina su piatti di plastica. 20 qui presentiamo un metodo che consente la quantificazione della migrazione delle cellule all'interno dell'ambiente 3D della fibrina. Mentre il metodo descritto in questo protocollo specificamente utilizza fibrina, questo modello può essere modificato facilmente per utilizzare materiali alternativi matrice come desiderato, ad esempio collagene o altre matrici 3D. Inoltre, presentiamo l'uso di sferoidi del fibroblasto in questo saggio, poiché la migrazione dei fibroblasti nel letto della ferita è di fondamentale importanza per la sintesi di matrice extracellulare e la riparazione/rimodellamento tissutale. Tuttavia, durante la riparazione processo neutrofili sono il tipo di cella primo di migrare nel letto della ferita, seguito dai macrofagi. Fibroblasti allora cominciano a infiltrarsi l'ambiente della ferita circa 48 ore dopo la lesione iniziale, all'inizio della fase proliferativa del processo di guarigione arrotolato. 19 questo test potrebbe essere facilmente modificato per includere i neutrofili, macrofagi o altri tipi di cellule per valutare come alterazioni nella struttura del coagulo di fibrina influiscono sulla migrazione di questi tipi di cellule. 21
Per implementare questo test, in primo luogo, uno sferoide del fibroblasto è formato usando una modifica delle tecniche descritte in precedenza per la coltura delle cellule staminali. 22 la sferoide dei fibroblasti è successivamente trasferita in una matrice di fibrina 3D, e la conseguenza quindi può essere facilmente monitorata e quantificata per diversi giorni. Questo protocollo prende in considerazione il 3D dei sistemi fisiologici incorporando sferoidi cellulare 3D all'interno di una matrice di fibrina, evitando così le limitazioni nella rilevanza provocata da un uso di una superficie di crescita 2D con un monostrato di cellule per comportamento migratore modello, mentre consentendo comunque per la valutazione del comportamento delle cellule in un ambiente altamente controllato in vitro .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="692">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Materials</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:267px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium, 4.5 g/L Glucose, w/ Sodium Pyruvate, w/out L-Glutamine</td>
			<td style="width:91px;">VWR</td>
			<td>VWRL0148-0500</td>
			<td style="width:217px;">DMEM already containing L-glutamine can also be used</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">100mm Tissue Culture Dish, Non-Treated, Sterilized, Non-Pyrogenic</td>
			<td style="width:91px;">VWR</td>
			<td>10861-594</td>
			<td style="width:217px;">Dishes of any size can be used for hanging drop culture&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:267px;">Fetal Bovine Serum from USDA approved countries, heat inactivated, sterile-filtered, cell culture tested</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>12306C-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:91px;">Fisher Scientific</td>
			<td>ICN1680149</td>
			<td style="width:217px;">Not needed if using DMEM that already contains L-glutamine&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:267px;">Penicillin-Streptomycin Solution stabilized, sterile-filtered, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">Human Dermal Fibroblasts, neonatal</td>
			<td style="width:91px;">Thermo Fisher</td>
			<td>C0045C</td>
			<td style="width:217px;">Can be replaced with other cell type of interest</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">21 G x 1 1/2&#39; needle</td>
			<td style="width:91px;">BD&#160;</td>
			<td>305167</td>
			<td>22 G x 1 1/2 needles will also work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">1 mL syringe</td>
			<td style="width:91px;">VWR</td>
			<td>89174-491</td>
			<td>Syringes of any volume can be used</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:267px;">Cell Culture Multiwell Plates, Polystyrene, Greiner Bio-One (Individially Wrapped) (48 wells)</td>
			<td style="width:91px;">VWR</td>
			<td>82051-004&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:267px;">Human Fibrinogen - Plasminogen, von Willebrand Factor and Fibronectin Depleted</td>
			<td style="width:91px;">Enzyme Research Laboratories</td>
			<td>FIB 3</td>
			<td style="width:217px;">Can be replaced with matrix protein of interest</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:267px;">Human Alpha Thrombin</td>
			<td style="width:91px;">Enzyme Research Laboratories</td>
			<td>HT 1002a</td>
			<td style="width:217px;">May not be necessary depending on matrix protein of interest</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Equipment</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">BSL2 cell culture hood</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Cell culture incubator</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">Inverted microscope with 10X objective</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">Centrifuge compatibile with 15 mL tubes</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing cell migration within three-dimensional in vitro wound environments

Attualmente, maggior parte dei modelli in vitro di cicatrizzazione, come ben consolidate saggi gratta e Vinci, coinvolgono studiando la chiusura della ferita e di migrazione di cellule su superfici bidimensionali. Tuttavia, l'ambiente fisiologico in cui in vivo di cicatrizzazione avviene è tridimensionale, piuttosto che bidimensionale. Sta diventando sempre più chiaro che il comportamento delle cellule differisce notevolmente in bidimensionale vs ambienti tridimensionali; di conseguenza, c'è una necessità per i modelli più fisiologicamente rilevanti in vitro per studiare i comportamenti di migrazione cellulare in chiusura della ferita. Il metodo descritto nel presente documento consente lo studio della migrazione cellulare in un modello tridimensionale che meglio riflette le condizioni fisiologiche di saggi di gratta e Vinci bidimensionale precedentemente stabiliti. Lo scopo di questo modello è di valutare di conseguenza delle cellule tramite l'esame della migrazione cellulare lontano un corpo sferoide incorporato all'interno di una matrice di fibrina in presenza di fattori pro - o anti - migratory. Utilizzando questo metodo, conseguenza delle cellule dal corpo sferoide in una matrice tridimensionale può essere osservato ed è facilmente quantificabile nel tempo tramite microscopia in campo chiaro e analisi dell'area del corpo di sferoide. L'effetto dei fattori pro-migratori e/o inibitori su migrazione delle cellule possa anche essere valutato in questo sistema. Questo metodo fornisce ai ricercatori con un semplice metodo di analizzare la migrazione cellulare in matrici tridimensionali ferita associata in vitro, aumentando così la rilevanza di in vitro delle cellule studia prima dell'uso di in vivo animale modelli.

Cultura della sferoide possa essere utilizzata per valutare correttamente l'effetto di agenti pro e anti-migratori sulla migrazione dei fibroblasti in vitro Sferoidi del fibroblasto 3D possono essere formate tramite sospensione goccia cultura per un periodo di 72 h (Figura 1). Dopo il periodo di coltura, sferoidi sono incorporati all'interno della matrice di coagulo ed imaged utilizzando la microscopia a campo chiaro (...

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Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

L'obiettivo del presente protocollo è quello di valutare l'effetto dei fattori pro - e anti - migratory su migrazione delle cellule all'interno di una matrice tridimensionale di fibrina.

Che caratterizzano la migrazione delle cellule all'interno del tridimensionale In Vitro ferita ambienti

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