Name: characterizing cell migration within three-dimensional in vitro wound environments
Uploaded: 2017-08-16T13:00:00
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El financiamiento de este trabajo fue proporcionado a través de la Asociación Americana del corazón (16SDG29870005) y la investigación de la Universidad del estado de Carolina del norte y financiación innovación.

1. día 1: la célula y preparación de los reactivos Nota: toda la preparación de la célula y el reactivo debe realizarse en un gabinete para prevenir la contaminación de las muestras de seguridad biológica.
<ol><li>Caliente filtrada Dulbecco &#39; s Modified Eagle &#39; s medio (DMEM), suero bovino fetal (FBS), L-glutamina y penicilina/estreptomicina en un baño de agua de 37 ° C.</li>
	<li>Prepare medios de fibroblastos dérmicos humanos neonatales (HDFn) complementando calentado D...

<ol>
	<li>Chester, D., Brown, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+biophysical+properties+of+provisional+matrix+proteins+in+wound+repair.">The role of biophysical properties of provisional matrix proteins in wound repair.</a> Matrix Biol. , (2016).</li><li>Martin, P., Leibovich, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+cells+during+wound+repair:+the+good,+the+bad+and+the+ugly.">Inflammatory cells during wound repair: the good, the bad and the ugly.</a> Trends in Cell Biology. 15 (11), 599-607 (2005).</li><li>Lin, B., Yin, T., Wu, Y. I., Inoue, T., Levchenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+chemotaxis+and+contact+inhibition+of+locomotion+determines+exploratory+cell+migration.">Interplay between chemotaxis and contact inhibition of locomotion determines exploratory cell migration.</a> Nat Commun. 6, 6619 (2015).</li><li>Ngalim, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+Adhesive+and+Soluble+Gradients+for+Imaging+Cell+Migration+with+Fluorescence+Microscopy.">Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy.</a> J Vis Exp. (74), (2013).</li><li>Charras, G., Sahai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+influences+of+the+extracellular+environment+on+cell+migration.">Physical influences of the extracellular environment on cell migration.</a> Nat Rev. Mol Cell Biol. 15 (12), 813-824 (2014).</li><li>Petrie, R. J., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+Lead+the+Way:+A+Unified+View+of+3D+Cell+Motility.">Fibroblasts Lead the Way: A Unified View of 3D Cell Motility.</a> Trends Cell Biol. 25 (11), 666-674 (2015).</li><li>Petrie, R. J., Gavara, N., Chadwick, R. S., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonpolarized+signaling+reveals+two+distinct+modes+of+3D+cell+migration.">Nonpolarized signaling reveals two distinct modes of 3D cell migration.</a> J Cell Biol. 197 (3), 439-455 (2012).</li><li>Carlson, M. W., Dong, S., Garlick, J. A., Egles, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-Engineered+Models+for+the+Study+of+Cutaneous+Wound-Healing.">Tissue-Engineered Models for the Study of Cutaneous Wound-Healing.</a> Bioengineering Research of Chronic Wounds. , 263-280 (2009).</li><li>Doyle, A. D., Wang, F. W., Matsumoto, K., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-dimensional+topography+underlies+three-dimensional+fibrillar+cell+migration.">One-dimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration.</a> J Cell Bio. 184 (4), 481-490 (2009).</li><li>Fraley, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinctive+role+for+focal+adhesion+proteins+in+three-dimensional+cell+motility.">A distinctive role for focal adhesion proteins in three-dimensional cell motility.</a> Nat Cell Biol. 12 (6), 598-604 (2010).</li><li>Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+versus+directionally+persistent+cell+migration.">Random versus directionally persistent cell migration.</a> Nat Rev. Mol Cell Biol. 10 (8), 538-549 (2009).</li><li>Rommerswinkel, N., Niggemann, B., Keil, S., Z&#228;nker, K. S., Dittmar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Cell+Migration+within+a+Three-dimensional+Collagen+Matrix.">Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix.</a> J Vis Exp. (92), (2014).</li><li>Jonkman, J. E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+the+wound+healing+assay+using+live-cell+microscopy.">An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy.</a> Cell Adh Migr. 8 (5), 440-451 (2014).</li><li>L&#228;mmermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+leukocyte+migration+by+integrin-independent+flowing+and+squeezing.">Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing.</a> Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).</li><li>Chen, Z., Yang, J., Wu, B., Tawil, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Three-Dimensional+Wound+Healing+Model.">A Novel Three-Dimensional Wound Healing Model.</a> J Dev Biol. 2 (4), 198-209 (2014).</li><li>Ross, R., Benditt, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing+and+collagen+formation.">Wound healing and collagen formation.</a> The J Cell Biol. 12 (3), 533-551 (1962).</li><li>Sproul, E. P., Argraves, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cytokine+axis+regulates+elastin+formation+and+degradation.">A cytokine axis regulates elastin formation and degradation.</a> Matrix Biol. 32 (2), 86-94 (2013).</li><li>Almine, J. F., Wise, S. G., Weiss, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastin+signaling+in+wound+repair.">Elastin signaling in wound repair.</a> Birth Defects REs C Embryo Today. 96 (3), 248-257 (2012).</li><li>Tracy, L. E., Minasian, R. A., Caterson, E. 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Este protocolo permite el examen de la migración celular en la cicatrización de heridas asociadas ECMs a través de un modelo 3D en vitro . Un paso crucial en la correcta ejecución del procedimiento es el correcto desarrollo de esferoides de fibroblastos; concentración celular durante la preparación se optimizó para dar una concentración inicial de 2.500 células/drop, permitiendo esferoides de forma fiable durante un período de incubación de 72 h. Si se usa un número insuficiente de células esferoide...

La cicatrización es un proceso complejo que resulta en la restauración de la integridad del tejido después de lesión. Este proceso se divide en cuatro etapas superpuestas de hemostasia, inflamación, proliferación y remodelación, que son cada uno regulado por una compleja combinación de señales solubles, las interacciones célula-matriz y célula-célula comunicaciones. 1 , 2 la orquestación de estas señales controla multitud de respuestas celulares en la cicatrización de heridas incluyendo, importantemente, migración de la célula. 3 , 4 migración celular es un proceso dinámico dependiente de fenotipos celulares y las propiedades bioquímicas y biofísicas de la medio de la matriz extracelular. 5 células sonda continuamente su entorno matriz extracelular a través de vías mediadas por integrinas; Este proceso permite a las células detectar una amplia gama de propiedades de la matriz incluyendo topografía, rigidez y aislamiento. Dos dimensiones (2D) el análisis de migración de la célula demuestra que la migración es impulsada por lamellipodia formación a la vanguardia a través de la generación de haces de filamentos de actina. Posterior formación de adherencias focales a la vanguardia, en combinación con actomyosin por contracción y retracción en el borde de fuga, unidades de la célula hacia adelante. 6 migración celular tridimensional (3D) en la actualidad no se entiende bien, sin embargo, estudios recientes demuestran que la migración 3D es marcadamente diferente a la anteriormente descrito mecanismo en 2D y es probablemente por mecanismos alterativo. Por ejemplo, estudios recientes por Petrie et al. demostró que, dependiendo de las propiedades de la ECM, las células matrices 3D pueden cambiar entre lamellipodium y lobopodium por mecanismos de la migración. 7 debido a migración de la célula es un componente crítico de la respuesta de cicatrización, modelos 3D de migración de la célula son críticos para la comprensión de respuestas fisiológicas a diferentes estímulos durante la cicatrización de heridas. Aunque el comportamiento migratorio de la célula en las superficies de la 2D se ha demostrado que varían mucho de la migración en matrices 3D, modelos en vitro más actuales de la migración celular durante el proceso, incluyendo el ensayo de rayado bien establecido, de cicatrización utilizan 2D cultivos de monocapa. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 más recientemente desarrollado análisis han utilizado una matriz 3D, pero aún las células en una monocapa sobre la matriz, lo que limita la capacidad de realmente recapitular la tridimensionalidad del entorno de la célula de la cultura en vivo. 15
El propósito del método descrito en este documento es estudiar la migración de células en un modelo 3D fisiológicamente relevante, en lugar de en una superficie 2D, para tener una comprensión más robusta de las respuestas de migración asociados con los estímulos aplicados. Este método permite la evaluación de la migración de la célula dentro de una matriz del coágulo de fibrina 3D en presencia de factores que activan o inhiben vías asociadas con la migración de la célula. Una matriz de fibrina fue elegida para este método debido al papel crítico que desempeña fibrina en las primeras etapas de la cicatrización de heridas; siguientes lesiones, un coágulo de fibrina se formaron dentro de los entornos de la herida para detener la pérdida de sangre y sirven como un andamio para la infiltración de la célula inicial durante la reparación del tejido y remodelación. 2 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 además, fibrina se utiliza clínicamente como un sellante quirúrgico y la composición de los selladores ha estado ligada a la migración de la célula y el último los resultados de curación. Un estudio previo por Cox et al. investigado la migración de fibroblastos con coágulos de fibrina compuestos de fibrina variable y concentraciones de trombina con el fin de optimizar un sellante de fibrina. En estos estudios, se cuantificó la migración de células de coágulos de fibrina en platos de plástico. 20 aquí presentamos un método que permite la cuantificación de la migración de las células en el entorno 3D de la fibrina. Aunque el método descrito en el presente Protocolo específicamente utiliza fibrina, este modelo puede ser modificado fácilmente para utilizar materiales alternativos de matriz como se desee, como el colágeno u otras matrices 3D. Además, presentamos el uso de esferoides de fibroblastos en este ensayo debido a la migración de fibroblastos en el lecho de la herida es de suma importancia para la síntesis de matriz extracelular y tejido reparación/remodelación. Sin embargo, durante la reparación proceso neutrófilos son el primer tipo de células a migrar en el lecho de la herida, seguido por los macrófagos. Fibroblastos comienzan entonces a infiltrarse en el entorno de la herida aproximadamente 48 horas después de lesión inicial, al comienzo de la fase proliferativa del proceso de cicatrización. 19 este ensayo podría ser fácilmente modificado para incluir neutrófilos, macrófagos y otros tipos de células para evaluar cómo alteraciones en la estructura del coágulo de fibrina afectan la migración de estos tipos celulares. 21
Para aplicar este análisis, en primer lugar, un esferoide del fibroblasto se forma utilizando una modificación de las técnicas descritas para el cultivo de células madre. 22 el esferoide del fibroblasto se transfiere posteriormente en una matriz de fibrina 3D, y consecuencia puede entonces fácilmente supervisar y cuantificar durante varios días. Este protocolo tiene en cuenta el 3D de sistemas fisiológicos incrustando esferoides celulares 3D dentro de una matriz de fibrina, evitando así las limitaciones en relevancia provocada por usar una superficie de crecimiento 2D con una monocapa de células al comportamiento migratorio de la modelo, mientras que que permite para la evaluación del comportamiento de la célula en un ambiente altamente controlado en vitro .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="692">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Materials</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:267px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium, 4.5 g/L Glucose, w/ Sodium Pyruvate, w/out L-Glutamine</td>
			<td style="width:91px;">VWR</td>
			<td>VWRL0148-0500</td>
			<td style="width:217px;">DMEM already containing L-glutamine can also be used</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">100mm Tissue Culture Dish, Non-Treated, Sterilized, Non-Pyrogenic</td>
			<td style="width:91px;">VWR</td>
			<td>10861-594</td>
			<td style="width:217px;">Dishes of any size can be used for hanging drop culture&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:267px;">Fetal Bovine Serum from USDA approved countries, heat inactivated, sterile-filtered, cell culture tested</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>12306C-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:91px;">Fisher Scientific</td>
			<td>ICN1680149</td>
			<td style="width:217px;">Not needed if using DMEM that already contains L-glutamine&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:267px;">Penicillin-Streptomycin Solution stabilized, sterile-filtered, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">Human Dermal Fibroblasts, neonatal</td>
			<td style="width:91px;">Thermo Fisher</td>
			<td>C0045C</td>
			<td style="width:217px;">Can be replaced with other cell type of interest</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">21 G x 1 1/2&#39; needle</td>
			<td style="width:91px;">BD&#160;</td>
			<td>305167</td>
			<td>22 G x 1 1/2 needles will also work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">1 mL syringe</td>
			<td style="width:91px;">VWR</td>
			<td>89174-491</td>
			<td>Syringes of any volume can be used</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:267px;">Cell Culture Multiwell Plates, Polystyrene, Greiner Bio-One (Individially Wrapped) (48 wells)</td>
			<td style="width:91px;">VWR</td>
			<td>82051-004&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:267px;">Human Fibrinogen - Plasminogen, von Willebrand Factor and Fibronectin Depleted</td>
			<td style="width:91px;">Enzyme Research Laboratories</td>
			<td>FIB 3</td>
			<td style="width:217px;">Can be replaced with matrix protein of interest</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:267px;">Human Alpha Thrombin</td>
			<td style="width:91px;">Enzyme Research Laboratories</td>
			<td>HT 1002a</td>
			<td style="width:217px;">May not be necessary depending on matrix protein of interest</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Equipment</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">BSL2 cell culture hood</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Cell culture incubator</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">Inverted microscope with 10X objective</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">Centrifuge compatibile with 15 mL tubes</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing cell migration within three-dimensional in vitro wound environments

Actualmente, mayoría en vitro de los modelos de cicatrización, como ensayos de rayado bien establecidos, implican estudiar celular migración herida cierre en superficies bidimensionales. Sin embargo, el ambiente fisiológico en que en vivo de cicatrización se lleva a cabo es tridimensional en lugar de dos dimensiones. Es cada vez más claro que el comportamiento celular difiere enormemente en dos dimensiones vs entornos tridimensionales; por lo tanto, hay una necesidad de más fisiológico relevantes en vitro modelos para estudiar comportamientos de migración celular en el encierro de la herida. El método aquí descrito permite el estudio de la migración celular en un modelo tridimensional que mejor refleja las condiciones fisiológicas que ensayos cero dos dimensiones previamente establecidos. El propósito de este modelo es evaluar consecuencia de células mediante el examen de la migración de la célula de un cuerpo esferoide incrustado dentro de una matriz de fibrina en presencia de factores de pro o anti migratory. Usando este método, fruto de célula del cuerpo esferoide en una matriz tridimensional puede ser observado y es fácilmente cuantificable en el tiempo mediante microscopía brightfield y análisis de la zona del cuerpo esferoide. El efecto de factores pro-migratorias o inhibitorios sobre migración de la célula puede también ser evaluado en este sistema. Este método ofrece a los investigadores con un método sencillo de análisis de migración de la célula en matrices tridimensionales herida asociada en vitro, aumentando la relevancia de in vitro células estudios previo a la utilización de animales en vivo modelos.

Cultura de esferoide puede ser utilizada para evaluar con éxito el efecto de agentes profesionales y anti migratorios sobre la migración de fibroblastos in vitro Esferoides 3D del fibroblasto pueden ser formados vía colgante gota cultura durante un periodo de 72 h (figura 1). Tras el período de la cultura, esferoides se encajan dentro de la matriz del coágulo y reflejada mediante microscopía de campo luminoso (fi...

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Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

El objetivo de este protocolo es evaluar el efecto de los factores pro y anti migratory en migración de la célula dentro de una matriz tridimensional de fibrina.

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