Name: the c. elegans intestine as a model for intercellular lumen morphogenesis and in vivo polarized membrane biogenesis at the single-cell level: labeling by antibody staining, rnai loss-of-function analysis and imaging
Uploaded: 2017-10-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Anti

Vi takker Mario de Bono (Molekylærbiologisk Institut, MRC Laboratory, Cambridge, England), Kenneth J. Kemphues (Cornell University, Ithaca, USA), Michel Labouesse (Institut de Biologie Paris Seine, Université Pierre et Marie Curie, Paris, Frankrig), Grégoire Michaux (Université deRennes 1, Rennes, Frankrig) og CGC, finansieret af NIH Office for forskning infrastruktur programmer (P40 OD010440), stammer og antistoffer. Dette arbejde blev støttet af tilskud NIH GM078653, MGH er 224570 og SAA 223809 at V.G.

1. Mærkning C. elegans tarmen Note: Se den ledsagende papir af forfatterne på analysen af ekskretionsorganerne canal tubulogenesis 2 til opførelse af væv specifikke fluorescerende markør plasmider og generation af transgene dyr, herunder drøftelser på transkriptionel og translationel fusion proteiner (sidstnævnte kræves for subcellulært lokalisering af et molekyle af interesse). Disse procedurer kan tilpasses ved hjælp af specifikke initiativtagere ...

<ol>
	<li>Bryant, D. M., Mostov, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+cells+to+organs:+building+polarized+tissue.">From cells to organs: building polarized tissue.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (11), 887-901 (2008).</li><li>Zhang, N., Membreno, E., Raj, S., Zhang, H., Khan, L. A., Gobel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+excretory+canal+as+a+model+for+intracellular+lumen+morphogenesis+and+in+vivo+polarized+membrane+biogenesis+in+a+single+cell.">The C. elegans excretory canal as a model for intracellular lumen morphogenesis and in vivo polarized membrane biogenesis in a single cell.</a> JoVE. , (2017).</li><li>Rodriguez-Boulan, E., Macara, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+execution+of+the+epithelial+polarity+programme.">Organization and execution of the epithelial polarity programme.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15 (4), 225-242 (2014).</li><li>Mellman, I., Nelson, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+protein+sorting,+targeting+and+distribution+in+polarized+cells.">Coordinated protein sorting, targeting and distribution in polarized cells.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (11), 833-845 (2008).</li><li>Nelson, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+core+mechanisms+to+generate+cell+polarity.">Adaptation of core mechanisms to generate cell polarity.</a> Nature. 422, 766-774 (2003).</li><li>Goldstein, B., Macara, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PAR+Proteins:+Fundamental+Players+in+Animal+Cell+Polarization.">The PAR Proteins: Fundamental Players in Animal Cell Polarization.</a> Dev. Cell. 13 (5), 609-622 (2007).</li><li>Rodriguez-Boulan, E., Kreitzer, G., Musch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+vesicular+trafficking+in+epithelia.">Organization of vesicular trafficking in epithelia.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6 (3), 233-247 (2005).</li><li>Zegers, M. M., O'Brien, L. E., Yu, W., Datta, A., Mostov, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+polarity+and+tubulogenesis+in+vitro.">Epithelial polarity and tubulogenesis in vitro.</a> Trends Cell Biol. 13 (4), 169-176 (2003).</li><li>Tepass, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+apical+polarity+protein+network+in+Drosophila+epithelial+cells:+regulation+of+polarity,+junctions,+morphogenesis,+cell+growth,+and+survival.">The apical polarity protein network in Drosophila epithelial cells: regulation of polarity, junctions, morphogenesis, cell growth, and survival.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 28, 655-685 (2012).</li><li>Shivas, J. M., Morrison, H. A., Bilder, D., Skop, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarity+and+endocytosis:+reciprocal+regulation.">Polarity and endocytosis: reciprocal regulation.</a> Trends Cell Biol. 20 (8), 445-452 (2010).</li><li>Bryant, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+network+for+de+novo+generation+of+the+apical+surface+and+lumen.">A molecular network for de novo generation of the apical surface and lumen.</a> Nat. Cell Biol. 12 (11), 1035-1045 (2010).</li><li>Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apicobasal+domain+identities+of+expanding+tubular+membranes+depend+on+glycosphingolipid+biosynthesis.">Apicobasal domain identities of expanding tubular membranes depend on glycosphingolipid biosynthesis.</a> Nat. Cell Biol. 13 (10), 1189-1201 (2011).</li><li>Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clathrin+and+AP-1+regulate+apical+polarity+and+lumen+formation+during+C.+elegans+tubulogenesis.">Clathrin and AP-1 regulate apical polarity and lumen formation during C. elegans tubulogenesis.</a> Development. 139 (11), 2071-2083 (2012).</li><li>Asan, A., Raiders, S. A., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+of+the+C.+elegans+Intestine+Involves+Axon+Guidance+Genes.">Morphogenesis of the C. elegans Intestine Involves Axon Guidance Genes.</a> PLoS Genet. 12 (4), e1005950 (2016).</li><li>Leung, B., Hermann, G. J., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organogenesis+of+the+Caenorhabditis+elegans+intestine.">Organogenesis of the Caenorhabditis elegans intestine.</a> Dev. Biol. 216 (1), 114-134 (1999).</li><li>Altun, Z. F., Hall, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alimentary+system,+intestine.">Alimentary system, intestine.</a> WormAtlas. , (2009).</li><li>Sulston, J. E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-embryonic+cell+lineages+of+the+nematode,+Caenorhabditis+elegans.">Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 56 (1), 110-156 (1977).</li><li>Rasmussen, J. P., English, K., Tenlen, J. R., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+and+morphogenesis+of+single-cell+tubes+in+the+C.+elegans+digestive+tract.">Notch signaling and morphogenesis of single-cell tubes in the C. elegans digestive tract.</a> Dev. Cell. 14 (4), 559-569 (2008).</li><li>Maduro, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+development+in+C.+elegans.">Gut development in C. elegans.</a> Seminars in cell &amp; developmental biology. , (2017).</li><li>McGhee, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+intestine.">The Caenorhabditis elegans intestine.</a> Wiley Interdiscip. Rev. Dev. Biol. 2 (3), 347-367 (2013).</li><li>Gobel, V., Barrett, P. L., Hall, D. H., Fleming, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lumen+morphogenesis+in+C.+elegans+requires+the+membrane-cytoskeleton+linker+erm-1.">Lumen morphogenesis in C. elegans requires the membrane-cytoskeleton linker erm-1.</a> Dev. Cell. 6 (6), 865-873 (2004).</li><li>Fehon, R. G., McClatchey, A. I., Bretscher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organizing+the+cell+cortex:+the+role+of+ERM+proteins.">Organizing the cell cortex: the role of ERM proteins.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11 (4), 276-287 (2010).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li><li>Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ingestion+of+bacterially+expressed+dsRNAs+can+produce+specific+and+potent+genetic+interference+in+Caenorhabditis+elegans.">Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans.</a> Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).</li><li>Shakes, D. C., Miller, D. M., Nonet, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+microscopy.">Immunofluorescence microscopy.</a> Methods Cell Biol. 107, 35-66 (2012).</li><li>Kamath, R. S., Martinezcampos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biol. 2 (1), RESEARCH0002 (2001).</li><li>Simmer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+the+Putative+RNA-Directed+RNA+Polymerase+RRF-3+Makes+C.+elegans+Hypersensitive+to+RNAi.">Loss of the Putative RNA-Directed RNA Polymerase RRF-3 Makes C. elegans Hypersensitive to RNAi.</a> Curr. Biol. 12 (15), 1317-1319 (2002).</li><li>Kennedy, S., Wang, D., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+siRNA-degrading+RNase+negatively+regulates+RNA+interference+in+C.+elegans.">A conserved siRNA-degrading RNase negatively regulates RNA interference in C. elegans.</a> Nature. 427 (6975), 645-649 (2004).</li><li>Maddox, A. S., Maddox, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+imaging+of+cellular+processes+in+Caenorhabditis+elegans.">High-resolution imaging of cellular processes in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Cell Biol. 107, 1-34 (2012).</li><li>Netherlands, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nomarski Differential Interference Contrast Microscopy. , (2008).</li><li>Bates, M., Jones, S. A., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM):+a+method+for+superresolution+fluorescence+imaging.">Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM): a method for superresolution fluorescence imaging.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 6, 498-520 (2013).</li><li>Jorgensen, E. M., Mango, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+art+and+design+of+genetic+screens:+caenorhabditis+elegans.">The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans.</a> Nat. Rev. Genet. 3, 356-369 (2002).</li><li>Lee, Y. U., Son, M., Kim, J., Shim, Y. H., Kawasaki, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CDC-25.2,+a+C.+elegans+ortholog+of+cdc25,+is+essential+for+the+progression+of+intestinal+divisions.">CDC-25.2, a C. elegans ortholog of cdc25, is essential for the progression of intestinal divisions.</a> Cell Cycle. 15 (5), 654-666 (2016).</li><li>Hall, D. H., Hartwieg, E., Nguyen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modern+electron+microscopy+methods+for+C.+elegans.">Modern electron microscopy methods for C. elegans.</a> Methods Cell Biol. 107, 93-149 (2012).</li><li>Shi, A., Grant, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+analysis+of+recycling+endosomes+in+Caenorhabditis+elegans.">In vivo analysis of recycling endosomes in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Cell Biol. 130, 181-198 (2015).</li><li>. Transgeneome website Available from: <a target="_blank" href="https://transgeneome.mpi-cbg.de/transgeneomics/index.html">https://transgeneome.mpi-cbg.de/transgeneomics/index.html</a> (2017)</li><li>. National BioResource Project (NBRP)::C. elegans Available from: <a target="_blank" href="https://shigen.nig.ac.jp/c.elegans/">https://shigen.nig.ac.jp/c.elegans/</a> (2017)</li><li>Kamath, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screening+in+Caenorhabditis+elegans.">Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 30 (4), 313-321 (2003).</li><li>Kamath, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi.">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).</li><li>Rual, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+improving+Caenorhabditis+elegans+phenome+mapping+with+an+ORFeome-based+RNAi+library.">Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library.</a> Genome Res. 14 (10B), 2162-2168 (2004).</li></ol>

Denne protokol beskriver hvordan man kombinerer standard tab af funktion genetiske/RNAi og imaging (mærkning og mikroskopiske) tilgange for at drage fordel af den intestinale epitel, C. elegans som en model for den visuelle og molekylær dissektion af in vivo polariseret membran og lumen Biogenese.
Mærkning
Denne protokol fokuserer på antistoffarvning. In situ mærkning af antistoffer er en meget specifik alternativ til...

Generation af cellulært og subcellulært asymmetrier, såsom dannelsen af polariseret membran domæner, er afgørende for morfogenese og funktion af celler, væv og organer1. Undersøgelser på polariseret membran Biogenese i epitheler forblive en teknisk udfordring, da retningsbestemt ændringer i fordelingen af subcellulært komponenter afhænger af flere på hinanden følgende og sammenfaldende ekstracellulære og intracellulære signaler, der er vanskelige at adskille i de fleste modeller og høj grad afhænge af modelsystemet. Modellen præsenteres her - enkelt-lags Caenorhabditis elegans tarmen - er et væv af udsøgte enkelhed. Sammen med encellede C. elegans ekskretionsorganerne canal (Se ledsager papir på polariseret membran Biogenese i C. elegans ekskretionsorganerne canal)2, det giver flere unikke fordele til identifikation og karakterisering af molekyler kræves for polariseret membran Biogenese. Bevarelse af Molekylær polaritet stikord fra gær til manden laver dette simple hvirvelløse organ en fremragende"i vivo væv kammer" at behandle spørgsmål på epitelial polaritet, som er af direkte relevans for det menneskelige system, som stadig er alt for kompleks at tillade den visuelle dissektion af disse begivenheder på enkelt celle niveau in vivo.
Selv om flere bevarede polaritet cues fra (1) extracelluar matrix, har (2) plasma membran og dens vejkryds og (3) intracellulære vesikulære handel været identificeret3, de underliggende principper i deres integration i forbindelse med polariseret epitelial membran og væv Biogenese er dårligt forstået4. Klassisk én celle i vivo modeller (e.g.S. cerevisiae og C. elegans zygote) har været medvirkende til at definere principperne for polariseret celledeling og anterior-posterior polaritet og har identificeret kritiske membran-associerede polaritet determinanter (den lille GTPases/CDC-42, partitionering defekte PARs)5,6, men de afhænger af unikke symmetri bryde stikord (bud ar, sperm post) og mangler junction-sikret apicobasal membran domæner og formentlig er den tilsvarende intracellulære apicobasal sortering maskiner. Vores nuværende viden om organisation af polariseret handel i epitheler, dog bygger primært på pattedyr 2D monokulturer7, som mangler fysiologiske ekstracellulære og udviklingsmæssige stikord, der kan ændre holdninger af membran domæner og retninger af menneskehandel baner (et skift fra 2D til 3D i vitro kultur systemer alene er nok til at invertere membran polaritet i MDCK (Madin-Darby canine nyre) celler)8. In vivo udviklingsmæssige undersøgelser på epitelial polaritet i hvirvelløse modelorganismer blev oprindeligt udført i flade epitheler, for eksempel i Drosophila melanogaster epidermis, hvor de identificerede de kritiske bidrag af krydset dynamics for polariseret celle migration og cell ark bevægelse9og endocytic handel for polaritet vedligeholdelse10. 3D i in vitro og i vivo analyse af lumen morfogenese i rørformede epitheler i MDCK celler og C. elegans tarmen, henholdsvis, har for nylig identificeret kravet om intracellulære handel for de Novo (apikale) domæne og lumen Biogenese og positionering11,12,13. Tykkelsen af rørformede (versus flad) epitelceller er en fordel for den 3D analyse af subcellulært asymmetrier da det giver en overlegen visuelle skelnen af den apikale-lumenal membran, apico-lateral vejkryds, lateral membranen, og den positioner af intracellulære organeller. Disse visuelle fordele, C. elegans model tilføjer in vivo indstilling, udviklingsmæssige akse, gennemsigtighed, enkelhed af organ planen, invariante og definerede celle afstamning, analytisk (genetiske) og yderligere fordele beskrevet nedenfor.
C. elegans sig selv er en rundorm rørformet struktur hvis gennemsigtighed og enkle arkitektur gør dens ligeledes rørformede indre organer direkte tilgængeligt for den visuelle analyse af rør og lumen morfogenese. Tyve cellerne i sin tarmen (21 eller 22 celler på lejlighed)14 er afledt fra en enkelt stamfader celle (E) og udvikle sig fra et dobbelt lag epitel af et intercalation skridt ind i et bilateralt symmetrisk rør af ni INT ringe (fire celler i den første ring; Figur 1 skematisk)14,15,16. Tarmens afstamning og væv analyse, i første omgang bestemmes af Nomarski optik via nukleare identiteter17og efterfølgende af Fluorescens mikroskopi via mærket membraner, har givet kritisk indsigt i dens morfogenese, i særlig de celle-selvstændig og celle-ikke-selvstændige krav til dets retningsbestemt celledelinger og bevægelser (f.eks.intercalation, højre-venstre asymmetrier, anterior og posterior tube rotation)14,18 . Tidlige endodermal celle specifikation og gen regulerende netværk kontrollere udviklingen af denne klonede model orgel er godt præget19,20. Fokus her, er imidlertid på analyse af polariseret membran og lumen Biogenese i single rørformede celler, og de intracellulære asymmetrier endomembranes, cytoskeletal strukturer og organeller, der ledsager denne proces. Analysen lettes af enkelheden i dette rør, hvor alle apikale membraner (på ultrastrukturelle niveau adskilles på microvilli) står over for lumen og alle basale membraner ansigt ydre rør overflade, med lateral membraner at kontakte hinanden, adskilt fra den apikale membran af knudepunkter (figur 1 skematisk; Se referencer (16,21) til C. elegans-bestemt organisation af stramme og adherens krydset komponenter). Apikale membran Biogenese er dermed sammenfaldende med lumen morfogenese. Endvidere, størrelsen af voksen tarmcellerne - de største celler af denne lille dyr (med undtagelse af cellen ekskretionsorganerne) - omtrentlige størrelse af et pattedyr celle, tillader i vivo visuel sporing af subcellulært elementer, f.eks. vesikel baner, der er typisk forsøg in vitro- i en kultur parabol.
Med henblik på denne analyse af cellulært og subcellulært er passende mærkning kritisk. Tarm endo - eller plasma-membran domæner, vejkryds, cytoskeletalstrukturer, kerner og andre subcellulært organeller kan visualiseres ved mærkning deres specifikke molekylære komponenter. Mange sådanne komponenter er blevet karakteriseret og fortsætte med at blive opdaget (tabel 1 giver et par eksempler og refererer til ressourcer). For eksempel, har forskellige molekyler skelne de rørformede og/eller vesikulær rum af tarm endomembrane system, fra Skadestuen til Golgi via post-Golgi vesikler til plasma membran, været identificeret22. Den specifikke proteiner (samt lipider og sukker) kan enten være mærket direkte eller indirekte via bindende proteiner. Denne protokol fokuserer på i situ antistoffarvning af faste enheder, en af to standard mærkning teknikker (se den ledsagende papir på ekskretionsorganerne canal tubulogenesis for en beskrivelse af andre teknik2 - i vivo mærkning via fluorescerende proteiner fusions - som er direkte anvendelige til tarmen; Tabel 2 giver eksempler på tarmen-specifikke initiativtagere, der kan bruges til at drive udtryk for sådanne fusion proteiner til tarmen). Dobbelt- eller flere mærkning med enten tilgang, eller med en kombination af begge plus yderligere kemisk farvning, giver mulighed for større grundig visuel opløsning og undersøgelse af rumlige og tidsmæssige ændringer i co lokalisering og rekruttering af specifikke molekyler eller subcellulært komponenter (figur 2). Fiksering og farvning procedurerne i denne protokol støtte bevarelsen af grøn fluorescerende proteiner (NGL) mærkning under immunfarvning procedurer. For billeddannelse, de vigtigste punkter for påvisning og karakterisering af tubulogenesis fænotyper via standard mikroskopiske procedurer (Fluorescens dissekere og konfokal mikroskopi) er beskrevet ()figur 3, 4). Disse kan omfatte højere opløsning imaging tilgange, for eksempel superresolution mikroskopi og transmissions Elektron Mikroskopi (ikke beskrevet her).
En nøglestyrke af dette system er evnen til at analysere polaritet i enkelte celler på forskellige udviklingsstadier, fra embryogenese gennem voksenalderen. For eksempel, kan apikale membran domæne og lumen Biogenese spores i hele udvikling på én celle-niveau via mærkning med ERM-1, en yderst velbevarede membran-actin linker den Ezrin-Radixin-Moesin familie23,24 . ERM-1 visualiserer apikale membran Biogenese (1) under embryonale tube morfogenese, når det sker samtidig med polariserede celledeling og migration (celler flytte apikalt omkring lumen under intercalation)15; (2) i løbet af sene embryonale og larver tube forlængelse, at provenuet i mangel af celledeling eller migration; og (3) i den voksne tarmen, hvor polariseret membran domæner vedligeholdes (figur 1). I den ekspanderende post mitotiske larve epitel, de novo polariseret membran Biogenese kan således være adskilt fra polariseret væv morfogenese, hvilket ikke er muligt i de fleste i vivo og in vitro- epitelial polaritet modeller, herunder dem med enkelt-celle opløsning (f.eks. 3D MDCK cyste model8). Med mærkning for andre komponenter, denne indstilling giver mulighed for (især på L1 larver tidspunkt når celler har en højere cytoplasma/kerne ratio) at skelne de intracellulære ændringer, der er specifikke for polariseret membran Biogenese ( f.eks. omlægning af menneskehandel baner) fra dem, der samtidig kræves for polariseret celledeling og migration.
C. elegans genetiske alsidighed er velkendt25og gør det en kraftfuld modelsystem for Molekylær analyse af biologiske spørgsmål. En undersøgelse på morfogenese, for eksempel, kan starte med en wild-type belastning, en transgene stamme, hvor strukturen af interesse (f.eks. en membran) er mærket med en fluorescerende markør, eller med en tab eller gevinst-af-funktion mutant med en defekt i denne struktur. En typisk omvendt genetisk undersøgelse kan generere en mutant, hvor gen af interesse er slettet i den germline (f.eks. ved en målrettet sletning), ændret ved mutagenese (typisk producere punktmutationer med deraf følgende tab, reduktion eller gevinst i funktion af genet), eller hvor dens udskrift er reduceret med RNAi. Lethed af RNAi af fodring i C. elegans26 også egner sig til udformningen af målrettede skærme, der undersøger en større gruppe af gener af interesse. En genetisk model organisme vel nok største styrke er evnen til at udføre i vivo fremad skærme (fx mutagenese, systematisk eller genome-wide RNAi skærme) at tillade en uvildig undersøgelse af den molekylære årsag til en fænotype af interesse. For eksempel, en fordomsfri visual C. elegans RNAi tubulogenesis skærmen, begyndende med en transgene dyr med ERM-1-mærket apikale membraner, opdagede en spændende reversible intestinal polaritet konvertering og ektopisk lumen fænotype, anvendes her som eksempel for denne form for analyse. Denne skærm identificeret nedbrydningen af glycosphingolipids (GSLs; obligat membran lipider, identificeret via deres GLS-biosyntetiske enzymer) og komponenter af vesikel frakke clathrin og dens AP-1 adapter som de specifikke molekylære defekter forårsager denne polaritet konvertering fænotype, hvilket kendetegner disse handel molekyler som in vivo cues for apikale membran polaritet og lumen positionering12,13. Når du starter med en bestemt genetisk mutation/morfogenese fænotype, kan sådanne skærme (eller enkelt genetiske/RNAi interaktion eksperimenter) også undersøge funktionel interaktioner mellem to eller flere gener af interesse (Se ledsager papir på den ekskretionsorganerne kanalen for et eksempel på en sådan analyse)2. Denne protokol fokuserer på RNAi, som ud over dens evne til direkte identificere det gen, som tab forårsager fænotype i fremad skærme, giver specifikke fordele til analyse af morfogenese. Da genprodukter lede morfogenese ofte arbejde i en dosisafhængig måde, er RNAi som regel en succes i at generere et spektrum af fænotyper. Evnen til at generere informative delvis tab af funktion fænotyper hjælper også til at løse det problem, at størstedelen af vigtige tubulogenesis gener er væsentlige og at deres tab forårsage sterilitet og tidlige embryonale dødelighed. Denne protokol indeholder betinget RNAi strategier for at overvinde denne vanskelighed og foreslår måder at optimere generation af et bredere spektrum af fænotyper, såsom en allel serie produceret af mutagenese.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td>Antibody staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A949SK-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Tween</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-213-612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Permount</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SP15-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Powdered milk</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MT409-1BTL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>MH27 (mouse)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Concentration: 1:20 Resources: Developmental Studies Hybridoma Bank.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td>MH33 (mouse)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Concentration: 1:10 Resources: Developmental Studies Hybridoma Bank.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td>anti-ICB4 (rabbit)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Concentration: 1:5 Resources: A gift from MariodeBono (Medical Research Council, England)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td>anti-PAR-3 (rabbit)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Concentration: 1:50 Resources: A gift from Kenneth J. Kemphues (Cornell University)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Alexa Floor 568 (anti-rabbit)</td>
			<td>ABCam</td>
			<td>AB175471</td>
			<td>Concentration: 1:200</td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Cy5 (anti-mouse)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A10524</td>
			<td>Concentration: 1:200</td>
		</tr>
		<tr >
			<td>TRITC (anti-rabbit)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T2769</td>
			<td>Concentration: 1:200</td>
		</tr>
		<tr >
			<td>FITC (anti-mouse)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F9006</td>
			<td>Concentration: 1:100</td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Labeled chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Texas Red-Phalloidin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Concentration: 1:100 Resources: Molecular Probes-T7471</td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Vacuum Grease Silicone</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>335148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>4448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Microscope coverslips (22x22-1)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-542-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>C. elegans related</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>see reference29 for standardC. elegans culture and maintenance procedures.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td>LB Medium and plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>see reference29 for protocols.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Tryptone</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>611845000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>214040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>M9 Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>see reference29 for protocols.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>NGM plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>see reference29 for protocols.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Peptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Tryptone</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>611845000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>214040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>RNAi plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>see reference30 for protocols.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Peptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Tryptone</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>611845000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>214040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>IPTG</td>
			<td>US Biological</td>
			<td>I8500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SS266-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Sodium hypochlorite</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50371500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Bacteria</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>OP50 bacteria</td>
			<td>CGC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>HT115 bacteria</td>
			<td>CGC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Genome-wide RNAi libraries Ahringer genome-wide RNAi feeding library (ref 30,49,50)</td>
			<td>Source BioScience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>C. elegans ORF-RNAi feeding library (ref51)</td>
			<td>Source BioScience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Imaging related</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9221-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>dissecting microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>dissecting microscope equipped with a high-power stereo fluorescence attachment (Kramer Scientific), CCD camera with Q capture software and X-Cite fluorescent lamp (Photonic Solutions)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Laser-scanning confocal microscope</td>
			<td>Leica Microsystem</td>
			<td>TCS SL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>laser-scanning confocal mounted on an ECLIPSE Ti-E inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>C2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the c. elegans intestine as a model for intercellular lumen morphogenesis and in vivo polarized membrane biogenesis at the single-cell level: labeling by antibody staining, rnai loss-of-function analysis and imaging

Flercellede rør, grundlæggende enheder af alle interne organer, er sammensat af polariseret epitelial eller endothelial celler, apikale membraner foring lumen og basolateral membraner at kontakte hinanden og/eller den ekstracellulære matrix. Hvordan denne særprægede membran asymmetri er etableret og vedligeholdes under orgel morfogenese er stadig et uløst spørgsmål for cellebiologi. Denne protokol beskriver C. elegans tarmen som en model til analyse af polariseret membran Biogenese under tube morfogenese, med vægt på apikale membran og lumen Biogenese. C. elegans tyve-celle enkelt-lags intestinale epitel er arrangeret i en simpel bilateralt symmetrisk tube, tillader analyse på en enkelt celle niveau. Membran polarisering opstår samtidig med polariserede celledeling og migration i tidlige embryogenese, men de novo polariseret membran Biogenese fortsætter gennem hele larve vækst, når cellerne ikke længere formere sig og flytte. Den sidstnævnte indstilling gør det muligt at adskille subcellulært ændringer, der samtidig mægle disse forskellige polariserende processer, vanskeligt at skelne i de fleste polaritet modeller. Apikale-, basolateral membran-, junctional-, cytoskeletal- og endomembrane komponenter kan være mærket og spores gennem hele udviklingen af normal god landbrugspraksis fusion proteiner eller vurderet af i situ antistoffarvning. Sammen med den organisme genetiske alsidighed giver C. elegans tarmen således en unik i vivo model for det visuelle, udviklingsmæssige, og molekylær genetisk analyse af polariseret membran og tube Biogenese. De specifikke metoder (alle standard) beskrevet her omfatter sådan: label intestinal subcellulært komponenter af antistoffarvning; analysere gener involveret i polariserede membran Biogenese ved tab af funktion undersøgelser tilpasses typisk væsentlige tubulogenesis gener; vurdere polaritet defekter under forskellige udviklingstrin; fortolke fænotyper af epifluorescensmikroskop, differential interferens kontrast (DIC) og konfokal mikroskopi; kvantificere visuelle defekter. Denne protokol kan tilpasses til at analysere nogen af de ofte meget bevaret molekyler involveret i epitelial polaritet, membran Biogenese, rør og lumen morfogenese.

Denne protokol beskriver, hvordan molekylemæssigt analysere og visualisere polariseret membran Biogenese og lumen morfogenese i C. elegans tarmen på enkelt celle og subcellulært niveau. Tyve-celle enkelt-lags C. elegans tarmen er dannet af styret celledeling og migration i midten af embryogenese. På dette tidspunkt, polariseret membran domæner blive etableret, men de novo polariseret membran Biogenese fortsætter i den modne, men udvide epitel i hele fire l...

Watch this Scientific Journal Video about The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Anti

The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analy

Den gennemsigtige C. elegans tarmen kan tjene som en"i vivo væv kammer" for at studere apicobasal membran og lumen Biogenese på enkelt-celle og subcellulært niveau i flercellede tubulogenesis. Denne protokol beskriver hvordan man kombinerer standard mærkning, tab af funktion genetiske/RNAi og mikroskopiske tilgange til dissekere disse processer på molekylært niveau.

C. elegans tarmen som en Model for intercellulære Lumen morfogenese og In Vivo polariseret membran Biogenese på én celle niveau: mærkning af antistoffarvning, RNAi tab af funktion analyse og billedbehandling

Multicellular tubes, fundamental units of all internal organs, are composed of polarized epithelial or endothelial cells, with apical membranes lining the ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

Sporing Celler i GFP-transgene zebrafisk Brug af Photoconvertible PSmOrange System

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

Imaging Cleared Embryonale og postnatal hjerter på Single-celle Opløsning

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Metoder til at undersøge lymfeknuder kirtel og hæmocytter i<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Rumlig og tidsmæssig analyse af Active ERK i<em&gt; C. elegans</em&gt; Kimcellelinje

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

C. elegans Excretory kanalen som en Model for intracellulære Lumen morfogenese og In Vivo polariseret membran Biogenese i en enkelt celle: mærkning af normal god landbrugspraksis-fusioner, RNAi interaktion skærm og billedbehandling

The four C. elegans excretory canals are narrow tubes extended through the length of the animal from a single cell, with almost equally far extended ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissektion og immunfluorescent farvning af champignon krop og fotoreceptor neuroner i voksen Drosophila melanogaster hjerner

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Anvendelse af RNAi og Heat-shock-induceret transskription faktor udtryk til at omprogrammere kønsceller til neuroner i C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

CRISPR-medieret tab af funktion analyse i cerebellare granula celler ved hjælp af In Utero elektroporation-baseret overførsel af gener

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors ...

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Vurdering af lysosomale basisk i tarmen af Live Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU

Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU

Cellecyklus analyse i C. elegans kønscelleoverførsel med Thymidine Analog EdU

Cell cycle analysis in eukaryotes frequently utilizes chromosome morphology, expression and/or localization of gene products required for various phases ...