Name: the c. elegans intestine as a model for intercellular lumen morphogenesis and in vivo polarized membrane biogenesis at the single-cell level: labeling by antibody staining, rnai loss-of-function analysis and imaging
Uploaded: 2017-10-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Anti

אנו מודים מריו דה בונו (MRC מעבדה לביולוגיה מולקולרית, קיימברידג ', בריטניה), קנת ג'יי Kemphues (אוניברסיטת קורנל, איתקה, ארה ב), מישל Labouesse (Institut de Seine בפריז Biologie, אוניברסיטת פייר et מארי קירי, פריז, צרפת), מישו Grégoire (אוניברסיטת deRennes 1, רנה, צרפת), CGC, במימון משרד NIH תוכניות תשתית מחקר (P40 OD010440), זנים, נוגדנים. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים NIH GM078653, 224570 הוא MGH, SAA 223809 כדי כלל

1. תיוג המעי C. elegans הערה: ראית את העיתון המלווה על ידי המחברים על הניתוח של תעלת excretory tubulogenesis 2 לבנייה של רקמות ספציפיות סמן פלורסנט פלסמידים, הדור של בעלי חיים מהונדס, כולל דיונים על גנים ברמת השעתוק והתרגום פיוז'ן חלבונים (האחרון נדרש עבור ההתאמה subcellular של מ?...

<ol>
	<li>Bryant, D. M., Mostov, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+cells+to+organs:+building+polarized+tissue.">From cells to organs: building polarized tissue.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (11), 887-901 (2008).</li><li>Zhang, N., Membreno, E., Raj, S., Zhang, H., Khan, L. A., Gobel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+excretory+canal+as+a+model+for+intracellular+lumen+morphogenesis+and+in+vivo+polarized+membrane+biogenesis+in+a+single+cell.">The C. elegans excretory canal as a model for intracellular lumen morphogenesis and in vivo polarized membrane biogenesis in a single cell.</a> JoVE. , (2017).</li><li>Rodriguez-Boulan, E., Macara, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+execution+of+the+epithelial+polarity+programme.">Organization and execution of the epithelial polarity programme.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15 (4), 225-242 (2014).</li><li>Mellman, I., Nelson, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+protein+sorting,+targeting+and+distribution+in+polarized+cells.">Coordinated protein sorting, targeting and distribution in polarized cells.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (11), 833-845 (2008).</li><li>Nelson, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+core+mechanisms+to+generate+cell+polarity.">Adaptation of core mechanisms to generate cell polarity.</a> Nature. 422, 766-774 (2003).</li><li>Goldstein, B., Macara, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PAR+Proteins:+Fundamental+Players+in+Animal+Cell+Polarization.">The PAR Proteins: Fundamental Players in Animal Cell Polarization.</a> Dev. Cell. 13 (5), 609-622 (2007).</li><li>Rodriguez-Boulan, E., Kreitzer, G., Musch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+vesicular+trafficking+in+epithelia.">Organization of vesicular trafficking in epithelia.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6 (3), 233-247 (2005).</li><li>Zegers, M. M., O'Brien, L. E., Yu, W., Datta, A., Mostov, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+polarity+and+tubulogenesis+in+vitro.">Epithelial polarity and tubulogenesis in vitro.</a> Trends Cell Biol. 13 (4), 169-176 (2003).</li><li>Tepass, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+apical+polarity+protein+network+in+Drosophila+epithelial+cells:+regulation+of+polarity,+junctions,+morphogenesis,+cell+growth,+and+survival.">The apical polarity protein network in Drosophila epithelial cells: regulation of polarity, junctions, morphogenesis, cell growth, and survival.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 28, 655-685 (2012).</li><li>Shivas, J. M., Morrison, H. A., Bilder, D., Skop, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarity+and+endocytosis:+reciprocal+regulation.">Polarity and endocytosis: reciprocal regulation.</a> Trends Cell Biol. 20 (8), 445-452 (2010).</li><li>Bryant, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+network+for+de+novo+generation+of+the+apical+surface+and+lumen.">A molecular network for de novo generation of the apical surface and lumen.</a> Nat. Cell Biol. 12 (11), 1035-1045 (2010).</li><li>Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apicobasal+domain+identities+of+expanding+tubular+membranes+depend+on+glycosphingolipid+biosynthesis.">Apicobasal domain identities of expanding tubular membranes depend on glycosphingolipid biosynthesis.</a> Nat. Cell Biol. 13 (10), 1189-1201 (2011).</li><li>Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clathrin+and+AP-1+regulate+apical+polarity+and+lumen+formation+during+C.+elegans+tubulogenesis.">Clathrin and AP-1 regulate apical polarity and lumen formation during C. elegans tubulogenesis.</a> Development. 139 (11), 2071-2083 (2012).</li><li>Asan, A., Raiders, S. A., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+of+the+C.+elegans+Intestine+Involves+Axon+Guidance+Genes.">Morphogenesis of the C. elegans Intestine Involves Axon Guidance Genes.</a> PLoS Genet. 12 (4), e1005950 (2016).</li><li>Leung, B., Hermann, G. J., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organogenesis+of+the+Caenorhabditis+elegans+intestine.">Organogenesis of the Caenorhabditis elegans intestine.</a> Dev. Biol. 216 (1), 114-134 (1999).</li><li>Altun, Z. F., Hall, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alimentary+system,+intestine.">Alimentary system, intestine.</a> WormAtlas. , (2009).</li><li>Sulston, J. E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-embryonic+cell+lineages+of+the+nematode,+Caenorhabditis+elegans.">Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 56 (1), 110-156 (1977).</li><li>Rasmussen, J. P., English, K., Tenlen, J. R., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+and+morphogenesis+of+single-cell+tubes+in+the+C.+elegans+digestive+tract.">Notch signaling and morphogenesis of single-cell tubes in the C. elegans digestive tract.</a> Dev. Cell. 14 (4), 559-569 (2008).</li><li>Maduro, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+development+in+C.+elegans.">Gut development in C. elegans.</a> Seminars in cell &amp; developmental biology. , (2017).</li><li>McGhee, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+intestine.">The Caenorhabditis elegans intestine.</a> Wiley Interdiscip. Rev. Dev. Biol. 2 (3), 347-367 (2013).</li><li>Gobel, V., Barrett, P. L., Hall, D. H., Fleming, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lumen+morphogenesis+in+C.+elegans+requires+the+membrane-cytoskeleton+linker+erm-1.">Lumen morphogenesis in C. elegans requires the membrane-cytoskeleton linker erm-1.</a> Dev. Cell. 6 (6), 865-873 (2004).</li><li>Fehon, R. G., McClatchey, A. I., Bretscher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organizing+the+cell+cortex:+the+role+of+ERM+proteins.">Organizing the cell cortex: the role of ERM proteins.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11 (4), 276-287 (2010).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li><li>Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ingestion+of+bacterially+expressed+dsRNAs+can+produce+specific+and+potent+genetic+interference+in+Caenorhabditis+elegans.">Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans.</a> Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).</li><li>Shakes, D. C., Miller, D. M., Nonet, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+microscopy.">Immunofluorescence microscopy.</a> Methods Cell Biol. 107, 35-66 (2012).</li><li>Kamath, R. S., Martinezcampos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biol. 2 (1), RESEARCH0002 (2001).</li><li>Simmer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+the+Putative+RNA-Directed+RNA+Polymerase+RRF-3+Makes+C.+elegans+Hypersensitive+to+RNAi.">Loss of the Putative RNA-Directed RNA Polymerase RRF-3 Makes C. elegans Hypersensitive to RNAi.</a> Curr. Biol. 12 (15), 1317-1319 (2002).</li><li>Kennedy, S., Wang, D., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+siRNA-degrading+RNase+negatively+regulates+RNA+interference+in+C.+elegans.">A conserved siRNA-degrading RNase negatively regulates RNA interference in C. elegans.</a> Nature. 427 (6975), 645-649 (2004).</li><li>Maddox, A. S., Maddox, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+imaging+of+cellular+processes+in+Caenorhabditis+elegans.">High-resolution imaging of cellular processes in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Cell Biol. 107, 1-34 (2012).</li><li>Netherlands, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nomarski Differential Interference Contrast Microscopy. , (2008).</li><li>Bates, M., Jones, S. A., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM):+a+method+for+superresolution+fluorescence+imaging.">Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM): a method for superresolution fluorescence imaging.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 6, 498-520 (2013).</li><li>Jorgensen, E. M., Mango, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+art+and+design+of+genetic+screens:+caenorhabditis+elegans.">The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans.</a> Nat. Rev. Genet. 3, 356-369 (2002).</li><li>Lee, Y. U., Son, M., Kim, J., Shim, Y. H., Kawasaki, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CDC-25.2,+a+C.+elegans+ortholog+of+cdc25,+is+essential+for+the+progression+of+intestinal+divisions.">CDC-25.2, a C. elegans ortholog of cdc25, is essential for the progression of intestinal divisions.</a> Cell Cycle. 15 (5), 654-666 (2016).</li><li>Hall, D. H., Hartwieg, E., Nguyen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modern+electron+microscopy+methods+for+C.+elegans.">Modern electron microscopy methods for C. elegans.</a> Methods Cell Biol. 107, 93-149 (2012).</li><li>Shi, A., Grant, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+analysis+of+recycling+endosomes+in+Caenorhabditis+elegans.">In vivo analysis of recycling endosomes in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Cell Biol. 130, 181-198 (2015).</li><li>. Transgeneome website Available from: <a target="_blank" href="https://transgeneome.mpi-cbg.de/transgeneomics/index.html">https://transgeneome.mpi-cbg.de/transgeneomics/index.html</a> (2017)</li><li>. National BioResource Project (NBRP)::C. elegans Available from: <a target="_blank" href="https://shigen.nig.ac.jp/c.elegans/">https://shigen.nig.ac.jp/c.elegans/</a> (2017)</li><li>Kamath, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screening+in+Caenorhabditis+elegans.">Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 30 (4), 313-321 (2003).</li><li>Kamath, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi.">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).</li><li>Rual, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+improving+Caenorhabditis+elegans+phenome+mapping+with+an+ORFeome-based+RNAi+library.">Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library.</a> Genome Res. 14 (10B), 2162-2168 (2004).</li></ol>

פרוטוקול זה מתאר כיצד לשלב גישות (תיוג ו מיקרוסקופיים) כדי לנצל אפיתל המעי של C. elegans כמודל עבור visual ומולקולרית ניתוח ויוו רגיל אובדן-של-פונקציה גנטית/RNAi והדמיה להן קרום ו לומן מקוטב.
תיוג
פרוטוקול זה מתמקד נוגדן מכתים. בחיי עיר תיוג באמצ...

הדור של הסלולר, subcellular asymmetries, כגון היווצרות קרום מקוטב תחומים, חיונית מורפוגנזה והתפקוד של תאים, רקמות ואיברים1. מחקרים על קרום מקוטב להן ב- epithelia להישאר אתגר טכני, מאז כיוונית שינויים בחלוקת רכיבי subcellular תלויים מרובות רצופות, וצירוף חוץ-תאית, תאיים אותות? קשה להפריד בין רוב הדגמים ותלויות חריפה במערכת מודל. המודל המוצג כאן - את הכוללים שכבה אחת Caenorhabditis elegans המעי - הוא רקמה של פשטות משובח. יחד עם החד-תאיים C. elegans excretory תעלה (ראה המלווה נייר על קרום מקוטב להן בתוך התעלה excretory C. elegans )2, הוא מספק מספר יתרונות ייחודיים לצורך הזיהוי ו אפיון של מולקולות הדרושות להן קרום מקוטב. שימור רמזים קוטביות מולקולרית של שמרים לאדם להפוך איבר הגעה פשוטה זה מצוין"ויוו רקמות הקאמרית" שאלות לגבי אפיתל קוטביות שאינן רלוונטיות ישירות למערכת האנושית, שהיא עדיין יותר מדי מתחם כדי לאפשר את הקרע חזותי של אירועים אלה על הסינגל תא רמה בתוך vivo.
למרות מספר רמזים שנשמרת קוטביות מטריצה extracelluar (1), (2) קרום פלזמה, צמתי, והאטרקציות (3) vesicular וגדילת היה להיות מזוהה3, עקרונות היסוד של שילובם בתהליך של מקוטב להן קרום של רקמת אפיתל הוא ממעטים להבין4. קלאסית תא בודד ויוו הדגמים (e.g.S. cerevisiae וגם את הזיגוטה C. elegans ) סייעו בהגדרת עקרונות מקוטב חלוקת התא הקדמי-אחוריים קוטביות, זיהו קריטי ממברנה-הקשורים קוטביות גורמים (קטן GTPases/CDC-42, את PARs תקינה למחיצות)5,6, אבל הם תלויים סימטריה ייחודי שבירת רמזים (ניצן הצלקת, הזנת הזרע) וחסרי מאובטחת-צומת apicobasal ממברנה תחומים, ככל הנראה, את apicobasal תאיים המתאימים מיון מכונות. הידע הנוכחי שלנו אודות ארגון מקוטב בבני אדם epithelia, עם זאת, בעיקר מסתמך על monocultures 2D בתרבית של7, אשר חסרים פיזיולוגיים רמזים חוץ-תאית והפיתוחים שיכולים לשנות עמדות של קרום תחומים וכיוונים של מסלולי הסחר בבני אדם (מתג ועד לכרטיסי תלת-ממד in vitro לקשרי תרבות מערכות לבד מספיק כדי היפוך קוטביות הממברנה בתאי MDCK (מדין טומי הכלבי הכליה))8. In vivo מחקרים התפתחותיים על קוטביות אפיתל דגם הגעה אורגניזמים נערכו תחילה epithelia שטוח, למשל באפידרמיס דרוזופילה melanogaster , איפה הם זיהו את התרומה קריטי צומת dynamics נדידת תאים מקוטב, תנועה לתא גליון9, ואת endocytic סחר קוטביות תחזוקה10. תלת-ממד במבחנה וניתוח ויוו של לומן מורפוגנזה ב epithelia צינורי בתאים MDCK ו במעי C. elegans , בהתאמה, לאחרונה זיהו את הדרישה של וגדילת עבור דה נובו תחום (הפסגה) ו לומן להן והמיקום11,12,13. העובי של הכרישים (לעומת שטוח) לתאי האפיתל היא יתרון לניתוח 3D של subcellular asymmetries מאז היא מתירה הבחנה חזותית מעולה של קרום הפסגה-lumenal, apico-לרוחב צמתי, ממברנה לרוחב, ו עמדות organelles תאיים. יתרונות אלו חזותי, דגם C. elegans מוסיף vivo בתוך ההגדרה, ציר התפתחותית, שקיפות, הפשטות של תוכנית גוף, שושלת היוחסין של תאי קבוע ומוגדר, אנליטי (גנטית) ויתרונות נוספים המתוארים להלן.
C. elegans עצמו הוא התולעת העגולה של מבנה צינורי שקיפות של מי ואדריכלות פשוטה להפוך את האיברים הפנימיים בדומה צינורי נגישים ישירות לניתוח חזותי של לומן ובשעות מורפוגנזה. תאי עשרים שלו המעי (21 או 22 תאים מדי פעם)14 נגזרים מתוך תאים ובתאים יחיד (E) ולפתח של האפיתל שכבות כפול על ידי העיבור צעד לתוך צינור נשימה סימטרית של תשע טבעות INT (ארבעה תאי הטבעת הראשונה; איור 1 סכמטי)14,15,16. ניתוח שושלת היוחסין ורקמות של המעי, בתחילה נקבע על-ידי Nomarski אופטיקה באמצעות זהויות גרעיני17ולאחר מכן על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ דרך ממברנות שכותרתו, סיפקה קריטי תובנות מורפוגנזה שלה, ב מסוים הדרישות תא-אוטונומי, תא-שאינם-אוטונומי שלו חלוקות תאים כיוונית, תנועות (למשל, העיבור, מימין asymmetries, סיבוב התחתית anterior ואת אחורי)14,18 . בתחילת תא endodermal מפרט את רשת גנטית שליטה על התפתחות איבר המשובטים מודל זה טוב מאופיין19,20בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. במוקד הדיון כאן, זאת, על הניתוח של קרום מקוטב ושל לומן להן בתאים צינורי יחיד, ושל את asymmetries תאיים של endomembranes, מבנים cytoskeletal organelles המלוות תהליך זה. הניתוח בהנחייתם של הפשטות של הרכבת התחתית, איפה כל הפסגה ממברנות (ברמה ultrastructural מכובד על-ידי microvilli) מול לומן עם ממברנות הבזליים כל הפנים השטח צינור חיצוני, עם ממברנות לרוחב פנייה אל אחד את השני, הופרדו קרום הפסגה על-ידי צמתים (מפרטים טכנייםאיור 1 ; ראה הפניות (16,21) עבור C. elegans-ארגון ספציפי חזק ורכיבים צומת adherens). ממברנה הפסגה להן היא לפיכך חופפת מורפוגנזה לומן. יתר על כן, גודל תאי המעי למבוגרים - התאים הגדול של חיה קטנה זו (עם חריג של התא excretory) - אומדן גודל תא יונקים, המתיר ויוו חזותי המעקב של אלמנטים subcellular, למשל מסלולים שלפוחית, זה בדרך כלל ניסיון במבחנה בקערה תרבות.
למטרת ניתוח זה הסלולר, subcellular, תיוג מתאים הוא קריטי. מעיים אנדו - או -קרום פלזמה תחומים, צמתים, cytoskeletalעל-ידי תיוג ומרכיביהם מולקולרי מסוים, ניתן לאבחן מבנים, גרעינים, organelles subcellular אחרים. רכיבים רבים כאלה כבר שאפיינו וממשיכים להתגלות (טבלה 1 נותן כמה דוגמאות, מתייחס משאבים). למשל, מולקולות שונים הבחנה התאים צינורי ו/או vesicular של המערכת endomembrane מעיים, מחדר המיון גולג'י דרך פוסט-גולג'י שלפוחית על קרום פלזמה, היה מזוהה22. ספציפי חלבונים (כמו גם שומנים, סוכרים) יכול גם להיקרא במישרין, או בעקיפין באמצעות איגוד חלבונים. פרוטוקול זה מתמקד בחיי עיר נוגדן מכתים של דגימות קבוע, אחד של שתי טכניקות תיוג סטנדרטי (לראות את הנייר הנלווה על תעלת excretory tubulogenesis לקבלת תיאור של אחרים בטכניקת2 - ויוו תיוג באמצעות חלבון פלואורסצנטי fusions - אשר חל ישירות המעי; טבלה 2 מספק דוגמאות של היזמים המעי ספציפי שיכול לשמש לנסוע ביטוי של חלבונים היתוך כזה המעי). זוגי - או תיוג מרובים עם גישה או, או עם שילוב של שניהם פלוס נוספים כימי מכתים, מאפשר יותר מעמיק רזולוציה ויזואלית, בחינת שינויים יכולות בלוקליזציה שיתוף בגיוס ספציפי מולקולות או מרכיבים subcellular (איור 2). את הקיבעון, צביעת בהליכים המתוארים תחת תמיכה בפרוטוקול שימור חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) תיוג במהלך הליכי immunostaining. עבור הדמיה, מפתח נקודות הזיהוי ותיאר אפיון tubulogenesis פנוטיפים באמצעות הליכים סטנדרטיים מיקרוסקופיים (קרינה פלואורסצנטית ויבתר ו קונאפוקלית מיקרוסקופ) הם (איור 3, 4). אלה ניתן להרחיב ברזולוציה גבוהה יותר הדמיה גישות, עבור מופע superresolution מיקרוסקופ ושידור מיקרוסקופ אלקטרונים (לא המתוארים כאן).
בחוזק המפתח של מערכת זו הוא היכולת לנתח קוטביות בתאים בודדים בשלבים התפתחותיים שונים, מן מופרה דרך לבגרות. למשל, ממברנה הפסגה לומן והתחום להן ניתן לעקוב במהלך פיתוח ברמה תא בודד באמצעות תיוג עם ממברנה שנשמרת מאוד-אקטין מקשר של אזרין-Radixin-Moesin משפחה23,24, ERM-1 . ERM-1 מדמיין להן קרום הפסגה (1) במהלך מורפוגנזה צינור עובריים, כאשר היא מתרחשת יחד עם חלוקת התא מקוטב, העברה (להעביר תאים apically סביב לומן בזמן העיבור)15; (2) במהלך מאוחר שלוחה שפופרת של זחל ממשיך בהיעדרו של חלוקת התא או ההעברה; (3) במעי למבוגרים, שבו קרום מקוטב תחומים נשמרות (איור 1). בתוך האפיתל זחל שלאחר mitotic מתרחבת, דה נובו מקוטב ממברנה להן ובכך ניתן להפריד מן מורפוגנזה רקמות מקוטב, שאינו אפשרי רוב הדגמים ב- vivo ו- in vitro לקשרי קוטביות אפיתל, כולל עם רזולוציה תא בודד (למשל 3D MDCK ציסטה דגם8). עם תיוג עבור רכיבים אחרים, הגדרה זו מספקת את ההזדמנות (במיוחד ב- L1 הזחל כאשר התאים יש יחס ציטופלזמה/גרעין גבוה יותר) כדי להבחין בין שינויים תאיים אלה שהינם ספציפיים מקוטב (להן קרום למשל ולהתפכחות של מסלולי הסחר בבני אדם) אלה/ת הנדרשים עבור חלוקת התא מקוטב והעברה.
צדדיות גנטי של C. elegans הוא ידוע25והופכת אותו מערכת מודל רב עוצמה לניתוח מולקולרית של כל שאלה ביולוגית. מחקר על מורפוגנזה, למשל, יכול להתחיל עם זן פראי-סוג, זן מהונדס שבו המבנה של הריבית (למשל קרום) נקראת עם סמן פלורסנט, או עם מוטציה הפסד או רווח-של-פונקציה עם פגם בזה מבנה. מחקר גנטי הפוכה טיפוסי עשוי ליצור מוטציה איפה הגן עניין נמחק ב germline (למשל על ידי מחיקה יישוב), השתנה על-ידי מוטגנזה מכוונת (בדרך כלל לייצר מוטציות נקודה עם אובדן הסוגר, הפחתה או הגברה בפונקציה של הגן), או איפה התעתיק שלו הוא מופחת על ידי RNAi. הקלות של RNAi מאכילים ב- C. elegans26 גם משאיל את עצמו בעיצוב של מסכי יישוב לבחון קבוצה גדולה יותר של הגנים של עניין. הכוח החזק ביותר ניתן לטעון של אורגניזם מודל גנטי הוא היכולת לנהל ויוו קדימה המסכים (למשל מוטגנזה מכוונת, מסכי שיטתית או ברמת הגנום RNAi) כי היתר חקירה לא משוחדת על הסיבה מולקולרית הפנוטיפ של ריבית. למשל, לא משוחדת visual C. elegans RNAi tubulogenesis מסך, החל חיה הטרנסגניים עם ממברנות הפסגה ERM 1-שכותרתו, גילו של המרה קוטביות מעיים הפיך מסקרן פנוטיפ לומן חוץ רחמי, המשמש כאן כדוגמה עבור סוג זה של ניתוח. מסך זה זוהה דלדול של glycosphingolipids (GSLs; ממברנה גידול שומנים, מזוהה באמצעות אנזימים biosynthetic הוחלף נגזר GLS שלהם) ורכיבים של clathrin המעיל של שלפוחית, מתאם AP-1 שלו הליקויים מולקולרי מסוים גורם קוטביות זו פנוטיפ ההמרה, ובכך אפיון אלה סחר מולקולות כמו ויוו רמזים עבור ממברנה הפסגה קוטביות ו לומן מיצוב12,13. כאשר החל הפנוטיפ מוטציה גנטית ספציפית/מורפוגנזה, מסכי כזה (או ניסויים יחיד האינטראקציה הגנטית/RNAi) ניתן גם לבחון פונקציונלי האינטראקציות בין גנים מרובים או עניין (ראה המלווה נייר על excretory תעלת לקבלת דוגמה של ניתוח כזה)2. פרוטוקול זה מתמקד RNAi אשר, בנוסף היכולת שלה ישירות לזהות את הגן אובדן אשר גורמת פנוטיפ של המסכים הקדמיים, מספק יתרונות ספציפיים לניתוח של מורפוגנזה. מאז הגן מוצרים בימוי מורפוגנזה לעיתים קרובות עובדים באופן תלוי מינון, RNAi הוא מצליח בדרך כלל יוצר קשת של פנוטיפים. היכולת להפיק פנוטיפים חלקית-אובדן-של-פונקציה אינפורמטיבי מסייעת גם לטפל בבעיה כי הרוב המכריע של גנים tubulogenesis חשוב הם חיוניים, כי ההפסדים שלהם לגרום עקרות, lethality עובריים מוקדם. פרוטוקול זה כולל אסטרטגיות RNAi מותנה כדי להתגבר על הקושי הזה, מציע דרכים כדי למטב את הדור של קשת רחבה של הפנוטיפים, כגון סדרות allelic המיוצר על ידי מוטגנזה מכוונת.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td>Antibody staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A949SK-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Tween</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-213-612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Permount</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SP15-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Powdered milk</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MT409-1BTL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>MH27 (mouse)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Concentration: 1:20 Resources: Developmental Studies Hybridoma Bank.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td>MH33 (mouse)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Concentration: 1:10 Resources: Developmental Studies Hybridoma Bank.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td>anti-ICB4 (rabbit)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Concentration: 1:5 Resources: A gift from MariodeBono (Medical Research Council, England)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td>anti-PAR-3 (rabbit)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Concentration: 1:50 Resources: A gift from Kenneth J. Kemphues (Cornell University)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Alexa Floor 568 (anti-rabbit)</td>
			<td>ABCam</td>
			<td>AB175471</td>
			<td>Concentration: 1:200</td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Cy5 (anti-mouse)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A10524</td>
			<td>Concentration: 1:200</td>
		</tr>
		<tr >
			<td>TRITC (anti-rabbit)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T2769</td>
			<td>Concentration: 1:200</td>
		</tr>
		<tr >
			<td>FITC (anti-mouse)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F9006</td>
			<td>Concentration: 1:100</td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Labeled chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Texas Red-Phalloidin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Concentration: 1:100 Resources: Molecular Probes-T7471</td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Vacuum Grease Silicone</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>335148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>4448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Microscope coverslips (22x22-1)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-542-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>C. elegans related</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>see reference29 for standardC. elegans culture and maintenance procedures.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td>LB Medium and plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>see reference29 for protocols.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Tryptone</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>611845000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>214040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>M9 Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>see reference29 for protocols.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>NGM plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>see reference29 for protocols.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Peptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Tryptone</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>611845000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>214040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>RNAi plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>see reference30 for protocols.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Peptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Tryptone</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>611845000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>214040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>IPTG</td>
			<td>US Biological</td>
			<td>I8500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SS266-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Sodium hypochlorite</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50371500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Bacteria</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>OP50 bacteria</td>
			<td>CGC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>HT115 bacteria</td>
			<td>CGC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Genome-wide RNAi libraries Ahringer genome-wide RNAi feeding library (ref 30,49,50)</td>
			<td>Source BioScience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>C. elegans ORF-RNAi feeding library (ref51)</td>
			<td>Source BioScience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Imaging related</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9221-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>dissecting microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>dissecting microscope equipped with a high-power stereo fluorescence attachment (Kramer Scientific), CCD camera with Q capture software and X-Cite fluorescent lamp (Photonic Solutions)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Laser-scanning confocal microscope</td>
			<td>Leica Microsystem</td>
			<td>TCS SL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>laser-scanning confocal mounted on an ECLIPSE Ti-E inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>C2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the c. elegans intestine as a model for intercellular lumen morphogenesis and in vivo polarized membrane biogenesis at the single-cell level: labeling by antibody staining, rnai loss-of-function analysis and imaging

צינורות multicellular, יחידות היסוד של האיברים הפנימיים הכל, מורכבים של תאי אפיתל או אנדותל מקוטב, עם ממברנות הפסגה רירית בקרום לומן, basolateral קשר עם אחד את השני ו/או של מטריצה חוץ-תאית. איך אסימטריה ממברנה הייחודי הזה הוא הוקם ומתוחזק במהלך מורפוגנזה איברים היא עדיין שאלה לא פתורות של ביולוגיה של התא. פרוטוקול זה מתאר את המעי C. elegans כמודל לניתוח של קרום מקוטב להן במהלך מורפוגנזה שפופרת, תוך שימת דגש על הפסגה להן קרום של לומן. C. elegans עשרים תאים הכוללים שכבה אחת מעיים האפיתל מסודר לתוך צינור נשימה סימטרית פשוטה, המתיר ניתוח ברמה תא בודד. ממברנה קיטוב מתרחשת/ת עם חלוקת התא מקוטב והעברה במהלך מופרה מוקדם, אבל דה נובו מקוטב להן קרום ממשיך לאורך כל התפתחות הזחל, כאשר התאים כבר לא להתרבות ולהעביר. ההגדרה השנייה מאפשרת להפריד subcellular שינויים בו-זמנית המתווכות שונים מהפכנית תהליכים אלה, קשה להבחין רוב הדגמים קוטביות. הפסגה, basolateral ממברנה-, מהחיבור-, cytoskeletal- ו endomembrane רכיבים שניתן שכותרתו, רחבי פיתוח על ידי GFP פיוז'ן חלבונים או לאומדן בחיי עיר מכתים נוגדן. יחד עם צדדיות הגנטי של האורגניזם, המעי C. elegans ובכך מספקת מודל ייחודי ויוו על ההמחשה, התפתחותית, ניתוח גנטי מולקולרי של קרום מקוטב, שפופרת להן. שיטות ספציפיות (הכל רגיל) המתוארים כאן כוללים כיצד: תווית מעיים רכיבים subcellular על ידי נוגדנים מכתימה; לנתח את הגנים המעורבים ממברנה מקוטב להן על ידי מחקרים אובדן-של-פונקציה מותאמת הגנים tubulogenesis בדרך כלל חיוני; להעריך את הקוטביות ליקויים בשלבים התפתחותיים שונים; לפרש פנוטיפים epifluorescence, התערבות דיפרנציאלית ניגודיות (DIC), מיקרוסקופיה קונפוקלית; לכמת לקות. פרוטוקול זה ניתן להתאים כדי לנתח כל של מולקולות שנשמרת לעיתים קרובות מאוד מעורב קוטביות אפיתל, להן קרום, מורפוגנזה ובשעות לומן.

פרוטוקול זה מתאר כיצד מולקולרי נתח והמחש להן קרום מקוטב מורפוגנזה לומן במעי C. elegans , תא בודד, רמת subcellular. עשרים תאים הכוללים שכבה אחת. C. elegans המעי נוצרת על ידי חלוקת התא מכוונת והעברה במהלך אמצע מופרה. זה הזמן, מקוטב קרום תחומים להפוך הוקמה, אך דה נובו להן קרום מ...

Watch this Scientific Journal Video about The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Anti

The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analy

שקופים C. elegans המעי יכול לשמש"ויוו הרקמה תא" ללמוד apicobasal להן קרום ו לומן ברמה תא בודד, subcellular במהלך multicellular tubulogenesis. פרוטוקול זה מתאר כיצד לשלב תיוג סטנדרטי, אובדן-של-פונקציה גנטית/RNAi וגישות מיקרוסקופיים לנתח תהליכים אלה ברמה המולקולרית.

C. elegans המעי כמו המודל עבור המערכת לומן מורפוגנזה ו Vivo ב מקוטב ממברנה להן ברמה תא בודד: תיוג על ידי נוגדנים מכתים, ניתוח אובדן RNAi-של-פונקציה והדמיה

Multicellular tubes, fundamental units of all internal organs, are composed of polarized epithelial or endothelial cells, with apical membranes lining the ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

מעקב תאים דג הזברה GFP מהונדס שימוש במערכת photoconvertible PSmOrange

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

הדמיה הותרה עוברית ולבבות אחרי לידה ברזולוצית תא בודד

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

שיטות לבדיקת בלוטת לימפה hemocytes ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; זחלים

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

ניתוח במרחב ובזמן של ERK פעיל<em&gt; C. elegans</em&gt; germline

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

התעלה Excretory C. elegans כמודל עבור מורפוגנזה לומן תאיים ו Vivo ב מקוטב ממברנה להן בתא יחיד: תיוג על ידי התכה GFP, RNAi אינטראקציה עם המסך הדמיה

The four C. elegans excretory canals are narrow tubes extended through the length of the animal from a single cell, with almost equally far extended ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

ניתוח Immunofluorescent מכתים של פטריות הגוף והנפש ומה קולט אור נוירונים במוח למבוגרים דרוזופילה melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

היישום של RNAi חום-הלם-induced בביטוי פקטור שעתוק כדי לתכנת בתאי הנבט את הנוירונים C . elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

בתיווך CRISPR אובדן ניתוח פונקציה גרגר אסטרוציטומה תאים באמצעות בתוך הרחם מבוסס-אלקטרופורציה את ההעברה של ג'ין

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors ...

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

הערכת Alkalinization Lysosomal ב המעי של חיים Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU

Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU

ניתוח מחזור התא C. elegans Germline עם עידו אנלוגי תימידין

Cell cycle analysis in eukaryotes frequently utilizes chromosome morphology, expression and/or localization of gene products required for various phases ...