Name: the c. elegans excretory canal as a model for intracellular lumen morphogenesis and in vivo polarized membrane biogenesis in a single cell: labeling by gfp-fusions, rnai interaction screen and imaging
Uploaded: 2017-10-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fu

Nous remercions M. Buechner (Université du Kansas, Kansas, USA), K. Nehrke (centre médical de l’Université de Rochester, Rochester, New York, é.-u.) et le centre de génétique de Caenorhabditis , financée par les National Institutes of Health, bureau de l’Infrastructure de recherche Programmes (P40 OD010440). Ce travail a été soutenu par subventions GM078653 NIH, HGM est 224570 et SAA 223809 à V.G.

1. étiquetant le c. elegans Excretory Canal par des protéines de Fusion fluorescentes 14 Remarque : Voir le document ci-joint sur tubulogenèse intestinale 3 pour l’étiquetage par in situ les anticorps adaptable au canal excréteur de procédures de coloration. Voir le tableau 1 pour des exemples de molécules sont avérées utiles pour la visualisation de c. elegans canal excréteur endo - et ...

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Polyvalence génétique c. elegans , transparence, plan simple corps et lignage cellulaire invariant rendent un excellent modèle pour l’analyse de la morphogénèse. Ce protocole décrit comment combiner des manipulations génétiques standards et imagerie études pour profiter de 2 micron minces canaux excréteurs c. elegans afin d’étudier la membrane polarisée et biogenèse lumen intracellulaire dans un tube de cellule unique.
L’étiquetage Les ...

Tous les organes internes sont composés de tubes, cruciales pour leurs nombreuses fonctions différentes, tels que le transport et l’échange de gaz, les liquides et les nutriments et l’excrétion des déchets métaboliques. Leur caractère polarisé, avec les membranes apicales et lumière distinctes, est adaptée à ces fonctions spécifiques, et les défauts dans la biogenèse des systèmes endo - et la membrane plasmique sont une cause fréquente de maladie humaine1,2. La plupart des tubes du système vasculaire et des organes internes est pluricellulaire et forme une lumière entre les cellules ; Cependant, tubes unicellulaires qui forment la lumière dans les cellules, peuvent, par exemple, représenter autant que 30 à 50 % des humains lits capillaires2. Les membranes polarisées de multi - tubes et unicellulaires sont semblables dans la composition, bien que leur microdomaines peuvent différer basé sur la fonction spécifique du tube (p. ex., les canalicules de canal excréteur versus microvillosités intestinales dans Caenorhabditis elegans; Voir document d’accompagnement sur c. elegans tubulogenèse intestinale)3. Les principes de la biogenèse membranaire polarisée et tubulogenèse sont conservés chez les métazoaires, et un mécanisme moléculaire similaire leur ordonne1,2,4.
Le système excréteur de c. elegans est constitué de cinq cellules : la cellule excrétoire (EC), cellule canaliculaire (DC), pores cellulaires (PC) et deux cellules de la glande. Ablation des EC, DC ou PC provoque l’accumulation de liquide dans la cavité du corps et l’animaux meurent à un début de stade larvaire5. Curieusement, ces trois tubes unicellulaires créer leurs lumières de trois manières différentes : par cellule évidement (EC) ; habillage de cellule couplée avec la formation de jonctions autocellular (PC) ; et de l’enveloppe cellulaire couplé avec autofusion (DC) ; différents mécanismes de la morphogenèse de lumen qui sont toutes conservées phylogénétiquement6,7. La Communauté européenne, située sur le côté latéral gauche du bulbe pharyngé postérieur, envoie deux extensions latérales qui ramifient les quatre canaux d’étendre vers l’avant et vers l’arrière (sur le côté droit et gauche) jusqu'à l’extrémité du nez du ver et la queue , respectivement (Figure 1)5,6,8. La Communauté européenne s’étend d’environ 1 µm à 2 x 1 000 µm, ce qui en fait la plus grande cellule chez l’animal. Au niveau intracellulaire, le canal excréteur est un simple tube, généré à partir d’une membrane basale orientée vers le pseudocoelome et en tunnel par une membrane de lumière (endotube). La membrane de lumière canal relie à la membrane de lumière conduit à sa jonction intercellulaire seulement ; les canaux sont par ailleurs BostonMD le long de leur longueur (Figure 1). La membrane de lumière de canal excréteur et son cytosquelette submembraneous sont apicales, définies par leur composition moléculaire qui ressemble à la composition de la membrane apicale et submembraneous cytosquelette des tubes multicellulaires, tels que l’intestin, et d’autres épithéliums (p. ex., plat). Organites cytoplasmiques, y compris les endosomes vésiculaires et autres (p. ex., appareil de Golgi) endomembranes sont distribuées le long du canal. En outre, plusieurs vésicules canaliculaires - soit reliée à la membrane de lumière, et/ou reliées entre elles ou isolé - sont filetés sur le canal cytoplasme7,8,9,10 . Cette connexion plasma-membrane/canaliculaire dynamique plus développe le système membranaire du canal et contribue aux deux lumen morphogenèse et l’osmorégulation10. Le canal excréteur ainsi se compose presque entièrement de l’endo - et les membranes plasmiques, fournissant un excellent modèle pour l’analyse de la biogenèse membranaire polarisée et la régulation de l’endo-interface membrane plasmique. L’expansion spectaculaire de la membrane apicale au cours de la morphogenèse de canal - dans ce système monocellulaire qui coïncide avec l’extension lumen – permet également d’analyser les problèmes architecturaux qui découlent de la nécessité de stabiliser et de centrer une membrane intracellulaire de lumière . Ce protocole met l’accent sur l’analyse de la morphogénèse structurale du canal tube et de lumen et la dynamique de la membrane intracellulaire ce choix plutôt que sur les signaux qui dirigent les mouvements cellulaires générant la position de la Communauté européenne dans le système excréteur et construire ses liens complexes avec les autres éléments cellulaires (évaluées à6).
Un autre avantage du système c. elegans unicellulaires canal pour l’analyse de membrane polarisée et biogenèse lumen intracellulaire est sa capacité à séparer, à travers le temps du développement, la production des différentes composantes de ses membranes et jonctions. La ce est né au moment de la fermeture ventrale et s’installe en ventro-latéral du pharynx pendant milieu embryogenèse5,6,8, au cours de laquelle le branchement et prorogation du délai canal latéral se produisent. Il est suivi par extension antéro-postérieur canal durant l’embryogenèse fin, un processus qui se poursuit dans le stade larvaire L1 (Figure 1). Dans une larve nouvellement éclose, l’embout canalaire postérieur atteint approximativement au milieu du ver, entièrement s’étendant jusqu'à la queue à la fin de la phase L1, période après laquelle le canal s’allonge avec le ver8. Croissance de canal active à une vitesse dépassant celle de la croissance de l’animal ainsi se termine au premier stade larvaire, cependant, plus la croissance se produit parallèlement à la croissance de l’animal entier pendant les stades larvaires supplémentaires (L2-4). Ce paramètre fournit l’occasion d’analyser les différentes étapes de la biogenèse de membrane de novo polarisé, indépendamment de la division cellulaire polarisée ou migration. De plus, il permet la séparation de ce processus de l’assemblage des jonctions (qui se produisent chez l’embryon avant l’initiation de lumen) ; leurs besoins exacts en polarisation de la membrane est toujours une question ouverte dans le domaine de la polarité. Enfin, elle sépare uniquement apicale de l’expansion de la membrane basale, ce dernier procédé qui précède le premier dans les canaux excréteurs10. Le modèle de canal excréteur de c. elegans est donc un complément particulièrement instructif au modèle intestinal qui partage un certain nombre de ces avantages pour l’analyse de la biogenèse membranaire polarisée, mais l’exécute dans un contexte multicellulaire (voir le livre qui l’accompagne sur intestinale tubulogenèse3).
Bien que les canaux de type sauvage est ultra-minces tubules dans ce tout petit ver, leurs lumières peuvent être visualized directement par optique Nomarski chez cet animal transparent. En fait, les morphologies mutant canal cystique peuvent être caractérisés chez les animaux non étiquetés à l’aide de faible grossissement dissection microscopie, qui a été utilisé à bon escient en avancer les écrans génétiques pour identifier les gènes impliqués dans la tubulogenèse11. Meilleure visualisation de la morphologie des canaux et la distinction de leurs membranes polarisées, composants du cytosquelette, différents organites intracellulaires et autres structures subcellulaires, cependant, exige que l’étiquetage et de puissance plus élevée fluorescentes microscopie confocale et de dissection. Bien que la structure fine des canaux pose un certain nombre de difficultés pour l’étiquetage et la microscopie, membranes et composants subcellulaires peuvent être distinguées par les molécules spécifiques propres à chaque compartiment et animaux peut être montés en toute sécurité pour la microscopie si certaines précautions sont prises pour éviter d’introduire des artefacts (voir protocole et Discussion). L’étiquetage peut être fait par immunohistochimie dans échantillons fixés ou en générant les vers transgéniques exprimant des protéines de fusion fluorescent sous le contrôle de leurs propres ou des promoteurs spécifiques canal excréteurs pour l’imagerie in vivo . Ce protocole décrit la technique de marquage ce dernier (voir le document ci-joint tubulogenèse intestinale des anticorps coloration3).
La possibilité de combiner les études in vivo perte ou gain de-fonction avec in vivo imaging analyse à la seule cellule de niveau tout au long du développement rend le canal excréteur de c. elegans un modèle particulièrement fort pour le moléculaire et analyse cellulaire de tubulogenèse unicellulaires. Écrans génétiques avant ou arrière peuvent être effectuées en commençant par un animal transgénique sauvage ou étiqueté pour identifier les phénotypes de la morphogenèse de canal (par exemple, kystes) et ses défauts de gène sous-jacent. Sinon, ces écrans peuvent commencer avec un phénotype mutant (par exemple, un canal cystique) et identifier les suppresseurs ou exhausteurs de ce phénotype pour identifier les gènes qui interagissent sur le plan fonctionnel avec le gène qui cause le phénotype mutant. L’anomalie génétique provoquant le phénotype mutant peut induire une perte (par exemple, par délétion de gène) ou un gain (par exemple, via une mutation activatrice ou via l’introduction de copies du gène excès) de la fonction étudiée. Transmettre par mutagénèse ou RNAi systématique écrans sont sans a priori sur la fonction des gènes et permettent l’identification objective des gènes impliqués dans la fonction d’intérêt. Compte tenu de la disponibilité de l’ARNi pangénomique alimentation bibliothèques, presque chaque gène peut être facilement renversé par ARNi chez c. elegans, telle qu’un seul gène d’intérêt ou d’un groupe de gènes (par exemple, dans les écrans ciblés) peut également être rapidement sondé par son effet dans une approche de génétique inverse. Afin de démontrer une combinaison possible des approches, nous décrivons ici un écran d’interaction ciblé Arni, commençant par un mutant de gain de fonction kystique canal excréteur, marquées avec la protéine fluorescente verte cytoplasmique canal (GFP). Le phénotype mutant a été généré par la surexpression de MCE-1, un hautement conservée de c. elegans orthologues de la famille de l’éditeur de liens de membrane-actine Ezrin-radixine-moésine (MCE), qui a été impliquée dans la morphogenèse de lumen et membrane Organisation de nombreuses espèces12. C. elegans MCE-1 se localise aux membranes de lumière des organes internes, tels que le canal excréteur et l’intestin et est nécessaire pour la formation de lumière dans les deux13. ERM-1 surexpression recrute excès actine et vésicules de la membrane de lumière de canal, augmentant le flux dans la lumière et de générer un canal cystique court et une membrane de lumière sertie avec l’actine épaissie sous-poil9. Le protocole décrit comment générer des souches transgéniques avec canal excréteur-exprimés étiqueté protéines fusion (ou autres protéines) ; Comment réaliser des écrans de RNAi ciblées à partir de ces souches, d’identifier les modificateurs d’un phénotype de canal ; et comment analyser visuellement les résultats de ces écrans dissection et confocale en microscopie par fluorescence, y compris des moyens simples pour quantifier les phénotypes tubulogenèse instructif. Alternative étiquetage techniques ainsi que les détails de l’ARNi, ajusté aux gènes tubulogenèse souvent mortels, se trouvent dans le document qui l’accompagne sur intestinale tubulogenèse3. Toutes les méthodes peuvent être utilisées dans des combinaisons variées pour enquêter sur d’autres questions sur le canal tubulogenèse.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="983">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:811px;">Cloning</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plasmid pPD95.75</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Cat. No. 37464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PCR Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>Cat. No. 27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ligation kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>Cat. No. E2611L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DNA marker</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Cat. No. SM1331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agarose DNA grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat. No. BP164-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Competent cells</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>Cat. No. C2987H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat. No. BP154-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat. No. ED-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat. No. A38S-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethidium bromide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat. No. BP1302-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PCR machine&#160;</td>
			<td>MJ Research</td>
			<td>Cat. No. PTG-200&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>Cat. No. 5415C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Water Bath</td>
			<td>Precision Scientific&#160;</td>
			<td>Cat. No. 666A3&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gel running instrument</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat. No. 09-528-165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gel running power supply</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat. No. 45-000-465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Molecular Imager&#160;Gel Doc XR System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Cat. No. 1708195EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nanodrop Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Cat. No. ND1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">C. elegans related1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1see reference27 for standard C. elegans culture and maintenance procedures.</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">LB Medium and plates2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2see reference24 for protocols.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tryptone&#160;</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>Cat. no. 611845000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Yeast Extract</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Cat. no. 212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat. no. S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bacto Agar&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Cat. no. 214040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ampicillin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat. no. A0116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tetracycline</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat. no. BP912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td colspan="3" height="23" style="height:23px;">M9 Medium2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2see reference24 for protocols.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat. no. S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat. no. P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Na2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat. no. S7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat. no. M2773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">NGM plates 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2see reference24 for protocols.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat. no. S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Peptone&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Cat. no. 211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tryptone&#160;</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>Cat. no. 611845000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bacto Agar&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Cat. no. 214040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat. no. M2773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat. no. C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cholesterol&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat. no. C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">K2HPO4&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat. no. P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat. no. P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">RNAi plates3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3see reference60 for protocols.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat. no. S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Peptone&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Cat. no. 211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tryptone&#160;</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>Cat. no. 611845000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bacto Agar&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Cat. no. 214040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat. no. M2773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat. no. C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cholesterol&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat. no. C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">K2HPO4&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat. no. P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat. no. P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IPTG&#160;</td>
			<td>US Biological</td>
			<td>Cat. no. I8500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Carbenicillin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat. no. BP2648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat. no. SS266-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium hypochlorite</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat. no. 50371500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bacteria</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">OP50 bacteria</td>
			<td colspan="2">CGC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HT115 bacteria</td>
			<td colspan="2">CGC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Genome-wide RNAi libraries</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Ahringer genome-wide RNAi feeding library (ref29,49)</td>
			<td>Source BioScience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">C. elegans ORF-RNAi feeding library (ref50)</td>
			<td>Source BioScience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imaging related</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lidocaine</td>
			<td>MP Biomedicals,LLG</td>
			<td>Cat. no. 193917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vacuum Grease Silicone</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>Cat. no. 335148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscope slides&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat. no. 4448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscope coverslips (22&#215;22-1&#65289;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat. no. 12-542-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tissue culture plate, 6 well&#160;</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>Cat. no. 08-772-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SMZ-U dissecting microscope (Nikon)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:811px;">SZX12 dissecting microscope (Olympus), equipped with a high-power stereo fluorescence attachment (Kramer Scientific), CCD camera with Q capture software and X-Cite fluorescent lamp (Photonic Solutions).</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TCS SL Laser-scanning confocal microscope (Leica Microsystem)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">C2 laser-scanning confocal mounted on an ECLIPSE Ti-E inverted microscope (Nikon)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the c. elegans excretory canal as a model for intracellular lumen morphogenesis and in vivo polarized membrane biogenesis in a single cell: labeling by gfp-fusions, rnai interaction screen and imaging

Les quatre canaux excréteurs de c. elegans sont des tubes étroits étendus sur toute la longueur de l’animal d’une seule cellule, avec presque aussi beaucoup étendu endotubes intracellulaires qui génèrent et stabiliser la lumière avec une membrane et submembraneous cytosquelette des caractères apicale. La cellule excrétrice élargit sa longueur environ 2 000 fois pour générer ces canaux, rendant ce modèle unique pour l’évaluation in vivo de la biogenèse membranaire de novo polarisé, morphogenèse lumen intracellulaire et unicellulaires tubulogenèse. Le protocole présenté ici montre comment combiner la norme d’étiquetage, gain et perte de-fonction génétique ou l’interférence ARN (ARNi)-et des approches microscopiques d’utiliser ce modèle pour disséquer visuellement et fonctionnellement analyser ces processus au niveau moléculaire. Comme exemple d’une démarche d’étiquetage, le protocole décrit la production d’animaux transgéniques avec des protéines de fusion fluorescent pour analyse en direct tubulogenèse. Comme un exemple d’une approche génétique, il met en évidence les points clés d’un visuel d’Arni interaction écran visant à modifier un phénotype de gain de fonction canal cystique. Les méthodes spécifiques décrites sont Comment : étiqueter et visualiser les canaux en exprimant des protéines fluorescentes ; construire une bibliothèque de RNAi ciblée et élaborer des stratégies RNAi de dépistage pour l’analyse moléculaire de la morphogenèse du canal ; évaluer visuellement les modifications des phénotypes de canal ; marquer en disséquant la microscopie de fluorescence ; caractériser les composants subcellulaires canal à résolution plus élevée par microscopie confocale ; et de quantifier les paramètres visuels. L’approche est utile pour le chercheur qui s’intéresse en profitant du canal excréteur c. elegans pour identifier et caractériser des gènes impliqués dans les processus phylogénétiquement conservées de lumen intracellulaire et unicellulaires tube de morphogenèse.

Ce protocole décrit comment utiliser les canaux excréteurs de c. elegans visuellement et moléculairement analyser tubulogenèse unicellulaires et morphogenèse lumen intracellulaire dans une seule cellule. Pendant leur extension depuis le moment de Mid-l’embryogenèse à l’âge adulte, les quatre canaux excréteurs continuent d’accroître leur basolatérale et membranes apicales/lumière avec leur système endomembranaire canaliculaire et endosomes, offrant un modèle un...

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The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

Le c. elegans Excretory Canal comme modèle pour la morphogenèse Lumen intracellulaire et In Vivo polarisé la biogenèse membranaire dans une seule cellule : étiquetage de GFP-fusions, Arni Interaction écran et imagerie

Le canal excréteur de c. elegans est un modèle unique de cellules individuelles pour l’analyse visuelle in vivo de la biogenèse membranaire de novo polarisé. Ce protocole décrit une combinaison de génétique/Arni standard et approches, adaptables pour l’identification et la caractérisation des molécules diriger tubulogenèse unicellulaires et apicale biogenèse membranaire et lumen d’imagerie.

The four C. elegans excretory canals are narrow tubes extended through the length of the animal from a single cell, with almost equally far extended ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

en cours d&#39;analyse<em&gt; In Vivo</em&gt; Migration cellulaire en utilisant Transplantations cellulaires et imagerie time-lapse en Zebrafish Embryons

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Recherche

Biologie du développement

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Analyse spatiale et temporelle d&#39;Active ERK dans le<em&gt; C. elegans</em&gt; germinale

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Traitement de la toxicomanie et<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagerie des ostéoblastes-ostéoclastes Interactions dans un modèle Medaka poisson Ostéoporose

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

Une nouvelle technique de transplantation de graisse mammaire mammaire pour visualiser la génération de vaisseaux de cellules souches endothéliales vasculaires

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging

The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analy

Le c. elegans intestin comme un modèle intercellulaires Lumen morphogenèse et In Vivo polarisé la biogenèse membranaire au niveau unicellulaire : marquage par des anticorps, RNAi perte de fonction analyse et imagerie

Multicellular tubes, fundamental units of all internal organs, are composed of polarized epithelial or endothelial cells, with apical membranes lining the ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application de RNAi et Expression du facteur de Transcription induite par la chaleur-choc pour reprogrammer les cellules germinales de neurones chez c. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imagerie de la morphogénèse du Muscle-tendon en pupes de drosophile

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

Évaluation des dommages oxydatifs dans les cellules de surface oculaires de la souris primaire/cellules souches en réponse aux dommages causés par les ultraviolets-C (UV-C)

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

Une méthode d'imagerie semi-haut débit et une boîte à outils de visualisation de données pour analyser C. elegans Embryonic Development

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One ...

Visualizing Ocular Morphogenesis by Lightsheet Microscopy Using rx3:GFP Transgenic Zebrafish

Visualisation de la morphogenèse oculaire par microscopie Lightsheet à l’aide de rx3:GFP Transgenic Zebrafish

Vertebrate eye development is a complex process that begins near the end of embryo gastrulation and requires the precise coordination of cell migration, ...