Name: horizontal whole mount: a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-sections of skin
Uploaded: 2017-08-02T15:00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin at JoVE.com

De auteurs erkennen sponsoring van Thermo-Fisher Scientific en bedanken het Nikon Imaging Center bij Kings College London voor ondersteuning tijdens confocal image acquisition.

Alle dierproeven werden onderworpen aan lokale ethische goedkeuring en uitgevoerd onder de voorwaarden van een Britse regeringskantoor. 1. Skin Harvest en Cryopreservation <ol><li> Voorbereidende werkzaamheden. <ol><li> Bereid één 100 mm kweekschotel met 25 ml 4% PFA en twee 100 mm kweekgerechten met 25 ml 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). </li><li> Vul rechthoekige afscheidende cryomolds met tweederde met optimale snijtemperatuurverbinding (OCT). </li><li> Plaats een metalen plaat waarop de cryoblocks in een latere stap kunnen worden geplaatst in de -80 ° C vriezer. </li></ol></li><li> Huid oogsten, fixatie en cryopreservering. <ol><li> Knip het dorsale gebied van de dierencadaver met een droge elektrische scheerapparaat. OPMERKING: In dit voorbeeld werden postnatale dag 21 wildtype muizen gebruikt. </li><li> Oog de gebieden van belang op de huid op. OPMERKING: Het dorsomediale gebied van de muishuid ( <stronG class = &quot;xfig&quot;&gt; Figuur 1a) bevat het hoogste percentage haarfollikels dat evenwijdig is gespannen en uitgelijnd, waardoor optimale oriëntatie voor snede mogelijk is. Het verwijderen van onderliggende niet-dermale weefsels is niet nodig maar kan indien nodig worden uitgevoerd. </li><li> Trim de geoogste huid in rechthoekige stukken van passende grootte om in de bodem van de cryomold te passen, waarbij rekening wordt gehouden met de richtinggroei van de haarfollikelkoren. OPMERKING: Kleiner huidschijven kunnen makkelijker zijn voor beginners, aangezien ze minder waarschijnlijk zijn tijdens het incubatie- en montageproces. Het hier getoonde voorbeeld is een gebied van 1 cm 2 dorsale huid, die past in een 22 x 30 x 20 mm cryomold ( figuur 2a ). </li><li> Bevestig de huid bij kamertemperatuur in 25 ml 4% PFA gedurende 10-30 minuten, afhankelijk van de dikte van de huidmonsters ( Figuur 1b ). </li><li> Was de huidmonsters twee keer in 25 ml PBSVoor tenminste 5 minuten elk ( figuur 1b ). </li><li> Druppel de huidmonsters op een papieren handdoek om het weefsel van overtollig PBS zorgvuldig af te voeren, wat kan resulteren in kristallisatie tijdens het vriesproces en kan de cryosectie resultaten beïnvloeden. OPMERKING: een standaard sucrose gradiënt is niet nodig. Dit kan echter ook in het protocol worden opgenomen in de discretie van de gebruiker. </li><li> Wees bewust van de oriëntatie van de haarfollikels voor elk huidmonster. Gebruik een dissectiemicroscoop voor visuele bijstand (vooral iemand die het protocol voor het eerst uitvoert). Steek het huidmonster in de OCT-gevulde cryomold en evenwicht alle gebieden van de huid met OCT door luchtbellen aan de bovenkant van het geknipt haar te verwijderen door middel van tang ( figuren 2a en 2b ). </li><li> Duw de huid naar de bodem van het OCT gevulde blok, zodat het in de bodem ligt. OPMERKING: De huid kan in elke richting worden georiënteerd, aS lang als de korrel van de haarfollikel wordt genoteerd voor de juiste snijprocedures. De cryomolds worden opnieuw georiënteerd wanneer de blokken aan de cryostat worden gekoppeld voor cryosectie. Merk de hair follicle oriëntatie op de cryomold, aangezien deze stap de latere oriëntatie van de cryostat snede bepaalt. </li><li> Breng de cryoblocks op de metalen plaat in de -80 ° C vriezer om zwevend en ontwrichting van het weefsel te vermijden. </li><li> Bewaar het vriesproces om de oriëntatie van de huid onder de cryomold te behouden, aangezien onzichtbare luchtbellen de huid tot het oppervlak van de cryomold kunnen opkomen. OPMERKING: Cryomolds met bevroren weefsel kunnen langer dan een jaar bij -80 ° C worden opgeslagen en kunnen worden hergebruikt voor extra afdelingen. </li></ol></li></ol><img alt="Figuur 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56106/56106fig1.jpg" /> Figuur 1. Oogst en fixatie van de muishuid. </strong&gt; (A) Huidweefsel werd geoogst uit de dorsomediale gebied van het dier kadaver. Haarfollikels in deze regio zijn evenwijdig geplaatst en uitgelijnd en zorgen dus voor een optimale oriëntatie tijdens het snijden, zoals aangegeven door de pijlen. ( B ) Na het knippen van vierkanten van een passende grootte die in de cryomold past, werd het huidweefsel gedurende 15 minuten in 4% PFA gefixeerd en gedurende 5 minuten twee keer in PBS gewassen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56106/56106fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> 2. Dikte Weefsel Doorsnede <ol><li> Voorbereiding en weefsel oriëntatie om op de cryostat te monteren. <ol><li> Bereid een 100 mm kweekschotel met 15 ml PBS. Plaats het op een gemakkelijk toegankelijke plaats op de cryostat. Voer daarnaast een 12-putjesplaat op met 2,5 ml PBS per putje; Label volgens de monsters voor de lange termijn opslag van de zeeCtions bij 4 ° C. Gebruik pincet om de secties te behandelen. </li><li> Stel de temperatuur van de cryostat in op -20 ° C. OPMERKING: de temperatuur kan de doorsnede beïnvloeden, maar een goede gids moet beginnen bij -20 ° C. </li><li> Om afdelingen ongeveer twee haarfollikels dik te maken, pas de cryostaat aan om 150 μm dik te snijden. OPMERKING: De dikte van de sectie kan worden gevarieerd, afhankelijk van de behoeften van de gebruiker en de beperkingen van de microscoop die gebruikt wordt voor analyse. OPMERKING: De oriëntatie van het monster is van cruciaal belang voor het verkrijgen van huiddelen met haarfollikels in de juiste oriëntatie. Dit wordt bereikt door goed op het cryostatblok te monteren. Zorg ervoor dat het deelvlak parallel is met de haarfollikelrichting ( Figuur 2c ). Zoals eerder vermeld, is de juiste oriëntatie van het snijvlak in het huidmonster een cruciale stap om de kwaliteit van de afbeeldingen te bepalen die worden verworven inEen latere stap. </li></ol></li></ol><img alt="Figuur 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56106/56106fig2.jpg" /> Figuur 2. Inbedding, cryopreservering en sectie. (A) Het markeren van de haarfollikelrichting (HF) op de cryomold, aangegeven door de zwarte pijlen, is belangrijk voor een goede oriëntatie tijdens cryosectie. ( B ) Het deelvlak moet worden afgestemd op de haarfollikeloriëntatie om secties te genereren waarin de volledige lengte van de haarfollikels intact blijft. ( C ) Afdelingen werden gesneden per de hair follicle orientatie die door de zwarte pijlen op de cryomold. ( D ) De dikke weefsel dwarsdoorsneden werden verzameld met metalen tang en ( e ) overgebracht in een 100 mm kweekschotel die 1x PBS bevatte. ( F ) Bij kamertemperatuur lost de PBS de OC weg.T. Verbinding die de dikke weefsel dwarsdoorsneden omringt, zoals aangegeven door de witte pijlen. De secties drijven dan vrij in de PBS. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56106/56106fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <ol start="2"><li> Cryosectioning. <ol><li> Snijd een sectie met behulp van de cryostat. Gebruik pincet om de OCT te verzamelen die het ingebedde stukje huid bevat ( Figuur 2d ). OPMERKING: gebruik een cryostaat die de onafhankelijke beweging en aanpassing mogelijk maakt langs de axes X, Y en Z voor een optimale positionering van het monster. Dit zorgt voor het genereren van ideaal uitgelijste weefsel dwarsdoorsneden. </li><li> Breng het gedeelte uit de cryostaat over in de 100 mm kweekschaal, gevuld met PBS, en ga verder met de volgende plak. Verzamel de monsters niet op een dia ( Figuur 2e ). OPMERKING: bij kamertemperatuur zal de PBS oplossenDe OCT, waardoor de plakken die makkelijk te hanteren zijn met handvaten ( figuur 2f ) verlaten. OPMERKING: Verse PBS kan nodig zijn in de 100 mm kweekschotel na het oplossen van veel weefselsecties 100 μm dik en kunnen dienovereenkomstig worden gewijzigd. </li><li> Gebruik pincet om de drijvende huidafdelingen over te brengen naar de goed gemarkeerde put in een 12-vel plaat gevuld met 2,5 ml PBS ( Figuur 3a , links). OPMERKING: bij 4 ° C kunnen de monsters gedurende minstens twee dagen worden opgeslagen. Voor de langdurige opslag van OCT-blokken na het snijden van de huid, sluit het snijvlak met een druppel verse OCT. Na het vriezen van de OCT-druppel, draai het gebruikte OCT-blok in parafilm en plaats deze terug in de -80 ° C diepvriezer . </li></ol></li></ol> 3. Immunofluorescente etikettering. <ol><li> Bereid de PB buffer (PBS aangevuld met 0,5% schuimmelkpoeder, 0,25% vishuidgelatine en 0,5% Triton X-100) bij leasT 2 uur van tevoren, zoals eerder beschreven 5 . OPMERKING: Natriumazide kan worden toegevoegd aan PB buffer voor het behoud van antilichamen voor het herhaalde gebruik van de kleurbuffer. </li><li> Meng 1,5 ml microcentrifugebuizen en voeg 500 μL PB buffer per buis toe. Gebruik pincet zorgvuldig om de huidplakken van de PBS in aparte buizen over te brengen die de PB-buffer bevatten om te blokkeren ( Figuur 3a , rechts). Zorg ervoor dat alle huidplakken volledig ondergedompeld zijn. Plaats de microcentrifugebuizen op een zaagzaagrooster bij snelheden van niet meer dan 10 oscillaties per minuut, die de weefselintegriteit niet moeten verstoren gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. OPMERKING: Het is van cruciaal belang dat de snelheid niet meer dan 10 oscillaties per minuut overschrijdt op de zaagknijper, aangezien het in beweging komt. <ol><li> Terwijl het mogelijk is om meer dan een snij per microcentrifugebuis toe te voegen, om antilichamen op te slaan, plaatst u slechts een snij per buis. Gebruik een volume om het antilichaamgebruik te verminderenVan 250 μl. OPMERKING: vervang eventueel microcentrifugebuizen met bijvoorbeeld 96-putjesplaten. Echter, de plaatsing van de dikke weefsel dwarsdoorsneden in 1,5 ml microcentrifuge buizen zorgt voor de meest effectieve antilichaam penetratie in het weefsel als gevolg van de verhoogde vloeistof verstoring. </li></ol></li><li> Label aparte 1,5 ml microcentrifugebuizen voor elke huidschijf en voeg 500 μl PB buffer en de geschikte hoeveelheid primaire antilichaam toe. Na 1 uur blokkeren, verplaats de huidplakken in de vers bereide buizen die de antilichamen bevatten. Incubeer de plakjes bij 4 ° C overnacht. OPMERKING: In dit voorbeeld werden de volgende primaire antilichamen gebruikt: FITC rat anti-menselijke CD49f bij een concentratie van 1:50 en geit anti-muis / rat integrin alpha 8 bij een concentratie van 1: 100. </li><li> De volgende dag bereiden twee afzonderlijke 1,5 ml microcentrifugebuizen die 500 μl PBS per monster bevatten. Was de snijplakken twee keer gedurende 1 uur bij kamertemperatuure. </li><li> Bereid aparte 1,5 ml microcentrifugebuizen die 500 μl PB buffer bevatten met de juiste concentratie van toepasselijke secundaire antilichamen en 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenylindool (DAPI). OPMERKING: De secundaire antilichamen die in dit voorbeeld worden gebruikt zijn Alexa Fluor 488 ezel anti-rat IgG en Alexa Fluor 555 ezel anti-geiten IgG in een concentratie van 1: 500. DAPI werd gebruikt bij een concentratie van 1: 100. </li><li> Verzorg de huidmonsters zorgvuldig in de PB buffer, die het secundaire antilichaam en DAPI bevat, en incubeer de huidschijven bij kamertemperatuur gedurende 1 uur bij een lage snelheid op een rotator of shaker. </li><li> Bewaar de plakjes bij 4 ° C in de PB buffer die het secundaire antilichaam en DAPI bevat gedurende maximaal vier dagen, en mogelijk langer als natriumazide aan de PBS wordt toegevoegd. </li></ol><img alt="Figuur 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56106/56106fig3.jpg" /> Figuur 3. ImmunofluorescEtikettering en montage. (A) De drijvende weefsel doorsneden kunnen worden opgeslagen in 12-putsplaten gedurende ten minste twee dagen bij 4 ° C. Voordat immunofluorescerende (IF) etikettering de overige delen van het weefsel overbrengen in 1,5 ml microcentrifugebuizen die PB buffer bevatten om te blokkeren, zoals aangegeven door pijl 1. Voor IF-etikettering, houden u aan bij de multi-step procedure die in stap 3 is uitgewerkt. Onderdeel van stap 3 vereist de zorgvuldige overdracht van de weefsel dwarsdoorsneden in vers bereide microcentrifugebuizen die primaire antilichaamoplossing, secundaire antilichaamoplossing of wasbuffer bevatten, die door pijl 2 wordt aangegeven. ( B ) na de IF-etikettering, Secties worden ontrafeld en platgedraaid in een druppel glycerol, met behulp van de hulp van een dissectiemicroscoop. ( C ) Zodra het weefsel dwarsdoorsnede volledig op de bodem van een deklaag is afgemaakt, wordt er een regelmatige microscoopschuif gebruikt om het gedeelte te monteren. <aHref = &quot;http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56106/56106fig3large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te zien. 4. Montage voor microscopische visualisatie <ol><li> Voorafgaand aan beeldvorming, overdracht van de huidplakken naar aparte microcentrifugebuizen die 500 μl PBS bevatten om de secundaire antilichamen en DAPI weg te wassen. </li><li> Gebruik een 1000 μL pipet, maar snijd de eerste 0,5 cm van de pipettip af om de juiste pipettering van het sterk viskeuze glycerol mogelijk te maken. Plaats een 22 x 50 mm deklaag op een donkere achtergrond onder een dissectiemicroscoop ( Figuur 3b ). </li><li> Voeg één druppel 100% glycerol op de deklaag toe ( Figuur 3b ). Breng de huidschijf van de microcentrifugebuis over op de glyceroldruppel. Gebruik de dissectiemicroscoop en de spitse tang om de huidschijfjes die opgerold zijn, zorgvuldig te ontspannen. OPMERKING: als de schijf in de gly drijftCerol druppel, kan het untangled worden door de natuurlijke geneigdheid van het weefsel te coaxeren om terug te keren naar zijn normale vorm. Doe niet de onnatuurlijke rechthoek van de plak, want dit kan schade aan het weefsel veroorzaken. </li><li> Monteer het weefsel zodra de gehele lengte van het huidgedeelte correct is georiënteerd en plat op de deklaag Gebruik een regelmatige microscoopschuif. Deze stap zal de huidschijf verder uitlijnen. OPMERKING: Vermijd luchtbevestiging ( Figuur 3c ). </li><li> Afbeelding in de glycerol-gemonteerde huid secties binnen de komende twee dagen. OPMERKING: Langdurige opslag heeft een weerslag op de weefsel- en beeldkwaliteit. In dit voorbeeld werden alle beelden verkregen met een oprechte confocale microscoop met een 20x doelstelling. </li></ol>

<ol>
	<li>Plikus, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+dermal+BMP+signalling+regulates+stem+cell+activation+during+hair+regeneration.">Cyclic dermal BMP signalling regulates stem cell activation during hair regeneration.</a> Nature. 451 (7176), 340-344 (2008).</li><li>Zhang, Y. V., Cheong, J., Ciapurin, N., McDermitt, D. J., Tumbar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+self-renewal+and+differentiation+phases+in+the+niche+of+infrequently+dividing+hair+follicle+stem+cells.">Distinct self-renewal and differentiation phases in the niche of infrequently dividing hair follicle stem cells.</a> Cell Stem Cell. 5 (3), 267-278 (2009).</li><li>Jensen, U. B., Lowell, S., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spatial+relationship+between+stem+cells+and+their+progeny+in+the+basal+layer+of+human+epidermis:+a+new+view+based+on+whole-mount+labelling+and+lineage+analysis.">The spatial relationship between stem cells and their progeny in the basal layer of human epidermis: a new view based on whole-mount labelling and lineage analysis.</a> Development. 126 (11), 2409-2418 (1999).</li><li>Braun, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+stem+cell+proliferation+and+lineage+commitment:+visualisation+of+label-retaining+cells+in+wholemounts+of+mouse+epidermis.">Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis.</a> Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).</li><li>Driskell, R. R., Giangreco, A., Jensen, K. B., Mulder, K. W., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox2-positive+dermal+papilla+cells+specify+hair+follicle+type+in+mammalian+epidermis.">Sox2-positive dermal papilla cells specify hair follicle type in mammalian epidermis.</a> Development. 136 (16), 2815-2823 (2009).</li><li>Niculescu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+ablation+of+integrin+alpha-6+in+mouse+epidermis+leads+to+skin+fragility+and+inflammation.">Conditional ablation of integrin alpha-6 in mouse epidermis leads to skin fragility and inflammation.</a> Eur J Cell Biol. 90 (2-3), 270-277 (2011).</li><li>Fujiwara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basement+membrane+of+hair+follicle+stem+cells+is+a+muscle+cell+niche.">The basement membrane of hair follicle stem cells is a muscle cell niche.</a> Cell. 144 (4), 577-589 (2011).</li><li>Desciak, E. B., Maloney, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artifacts+in+frozen+section+preparation.">Artifacts in frozen section preparation.</a> Dermatol Surg. 26 (5), 500-504 (2000).</li><li>Driskell, R., Jahoda, C. A., Chuong, C. M., Watt, F., Horsley, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+dermal+adipose+tissue.">Defining dermal adipose tissue.</a> Exp Dermatol. 23 (9), 629-631 (2014).</li><li>Driskell, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+fibroblast+lineages+determine+dermal+architecture+in+skin+development+and+repair.">Distinct fibroblast lineages determine dermal architecture in skin development and repair.</a> Nature. 504 (7479), 277-281 (2013).</li><li>Snippert, H. J., Schepers, A. G., Delconte, G., Siersema, P. D., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slide+preparation+for+single-cell-resolution+imaging+of+fluorescent+proteins+in+their+three-dimensional+near-native+environment.">Slide preparation for single-cell-resolution imaging of fluorescent proteins in their three-dimensional near-native environment.</a> Nat Protoc. 6 (8), 1221-1228 (2011).</li><li>Sada, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+cellular+lineage+hierarchy+in+the+interfollicular+epidermis+of+adult+skin.">Defining the cellular lineage hierarchy in the interfollicular epidermis of adult skin.</a> Nat Cell Biol. 18 (6), 619-631 (2016).</li><li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLARITY+for+mapping+the+nervous+system.">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nat Methods. 10 (6), 508-513 (2013).</li><li>Tetteh, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replacement+of+Lost+Lgr5-Positive+Stem+Cells+through+Plasticity+of+Their+Enterocyte-Lineage+Daughters.">Replacement of Lost Lgr5-Positive Stem Cells through Plasticity of Their Enterocyte-Lineage Daughters.</a> Cell Stem Cell. 18 (2), 203-213 (2016).</li></ol>

De auteurs zouden willen onthullen dat de publicatie van dit manuscript werd gefinancierd door Thermo-Fisher Scientific Inc.

Here, we present the "horizontal whole mount" technique, which has several advantages over classical frozen sections. One advantage of our technique is that it can easily be performed with standard histology equipment and a confocal microscope. Second, the tissue integrity is preserved in a superior manner when compared to standard cryosections. For example, adipocytes within the hypodermal layer (i.e., dermal white adipocytes (DWAT))9 are severely disrupted in standard cryosections, which makes studying tissues that are adipose-laden impossible. Our technique allows for the full analysis of the adipocytes in this layer and may be adapted to other tissues with high adipocyte contents. Furthermore, this allows for the improved detection of mesenchymal cells in lineage-tracing studies 2,10. 
Standard cryosections, by their very nature, can never reveal the true 3D aspects of a tissue through confocal microscopy. This means that thicker sections are advantageous in the analysis of skin, since hair follicles, as well as their substructures, can traverse a depth that exceeds the standard thickness of 10 &#181;m used in classical crysosections. We are intrigued that other tissues, such as the intestine and brain, for example, possess similar challenges with regard to viewing the tissue as a 3D structure2,7,11,12,13. Intriguingly, our technique has already been shown to be beneficial for use in certain applications in the intestines14. We believe that our horizontal whole-mount protocol has the potential be applied to any other tissue requiring 3D analysis.

De omwenteling van microscopische beeldapparatuur zorgt voor geavanceerde beeldvormingsinstrumenten met hoge resolutie. Bij het verwerven van een microscopische afbeelding van een complete driedimensionale (3D) weefsel dwarsdoorsnede, levert het voorbereiden van een monster aanzienlijke uitdagingen op en kan de beperkende factor zijn bij de bepaling van de beeldkwaliteit. Elke afzonderlijke stap verdient een zorgvuldige overweging om de weefselmorfologie en de antigeniciteit van doelwit proteïnen te behouden, om verwerkingsgeïnduceerde artefacten te minimaliseren en de uiteindelijke beeldkwaliteit te maximaliseren. Bijvoorbeeld, de traditionele analyse van de huid vereist een beeld met het oog op de epidermis en dermis, met haarfollikels die goed zijn georiënteerd, waardoor de anatomische analyse van stamcellencompartimenten aan de homeostase 1 , 2 van de huid mogelijk is . Dit vereist een grondige concentratie op hoe de huid ingebed en gesneden is. Het is belangrijk dat haarfollikels dikker zijnDan 100 μm, die de standaard paraffine of bevroren sectie dikte aanzienlijk overschrijdt, wat resulteert in een lagere standaard van analyse ten opzichte van gehele montages of dikke dwarsdoorsneden 3 , 4 , 5 . Samengevat is elke stap van het voorbereiden van het monster voor microscopische analyse een kritische determinant die beeldanalyse zal beïnvloeden. Hier wordt een nieuw verwerkingsprotocol voor dikke 3D-weefsel-doorsnede-analyse, die we &quot;horizontale gehele berg&quot; noemen, gepresenteerd. Het protocol behoudt de antigeniciteit sterk en maakt het mogelijk om dikke delen van de huid optimaal te gebruiken door gebruik te maken van standaard confocal beeldvormende apparatuur. Dit is een complete gids voor het gebruik van de huid voor het verwerken en imaging van weefsel dwarsdoorsnede, inclusief weefseloogst en paraformaldehyde (PFA) -assistente cryopreservering (stap 1), de generatie van 100 μm dikke weefsel dwarsdoorsneden met een cryostat (stap 2), En immunofluorescente etikettering en montage (stappen 3 en 4). De representatieve resultaten vergelijken confocale beelden van twee verschillende histologische voorbereidingstechnieken-klassieke cryosectie en dikke 3D-weefsel dwarsdoorsneden-de voordelen van &quot;horizontale gehele mounts&quot; voor de potentiële gebruiker van dit protocol te benadrukken.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="658">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">PBS</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">homemade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Gelatin, from cold water fish skin</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G7765</td>
			<td>250ML</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:273px;">Glycerol</td>
			<td style="width:99px;">BDH Laboratory Supplies</td>
			<td style="width:119px;">444482V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">O.C.T. compound</td>
			<td style="width:99px;">VWR chemicals</td>
			<td style="width:119px;">361603E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Peel-A-Way embedding molds</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E6032-1CS</td>
			<td>Square S-22</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Non-Fat Powdered Milk</td>
			<td style="width:99px;">Bio Basic Inc.</td>
			<td style="width:119px;">NB0669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T9284</td>
			<td>500ML</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">4&#8242;,6-Diamidino-2-phenylindole, dilactate (DAPI)</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">FITC Rat Anti-Human CD49f</td>
			<td style="width:99px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:119px;">555735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Mouse/Rat Integrin alpha 8 Antibody</td>
			<td style="width:99px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:119px;">AF4076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">Alexa Fluor 488 donkey anti-rat IgG</td>
			<td style="width:99px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">A21208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">Alexa Fluor 555 donkey anti-goat IgG</td>
			<td style="width:99px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">A21432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:273px;">CryoStar NX70</td>
			<td style="width:99px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">100mm Culture dishes</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">Disposable scalpels</td>
			<td style="width:99px;">Swann-Morton</td>
			<td style="width:119px;">Ref 0501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">pointed metal forceps</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">1.5 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:99px;">VWR</td>
			<td dir="LTR">211-2130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">12 Well plates</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">CLS3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Dissecting microscope</td>
			<td style="width:99px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">20 ul and 1000 ul Pipette</td>
			<td style="width:99px;">Gilson</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;">1000&#181;l XL Graduated TipOne Filter Tip (Sterile)</td>
			<td style="width:99px;">Star Lab</td>
			<td dir="LTR">S1122-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;">20&#181;l Bevelled TipOne Filter Tip (Sterile)</td>
			<td style="width:99px;">Star Lab</td>
			<td>S1120-1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Rocking shaker plate</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">Microscope slides, menzel Glaeser</td>
			<td style="width:99px;">Thermos Scientific</td>
			<td style="width:119px;">631-9483</td>
			<td>Superfrost Plus</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">Cover Glasses, Menzel Glaeser</td>
			<td style="width:99px;">Thermos Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MENZBB024060AB</td>
			<td>24 x 60 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:99px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

horizontal whole mount: a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-sections of skin

Het verwerken van een weefsel van belang om een ​​microscopisch beeld te genereren dat een wetenschappelijk argument ondersteunt, kan uitdagend zijn. De aanschaf van microscopische beelden van hoge kwaliteit is niet volledig afhankelijk van de kwaliteit van de microscoop, maar ook op de weefselsverwerking, die vaak meerdere kritische acties of stappen omvat. Bovendien vormen mesenchymale celsoorten in de huid en andere weefsels een nieuwe uitdaging voor weefselbereiding en beeldvorming. Hier presenteren we een compleet proces, van weefsel oogst naar microscopie. Onze techniek, genaamd &quot;horizontale gehele berg&quot;, is een die beginners snel kunnen begrijpen en die het mogelijk maakt om antigeen te behouden en te detecteren in 60-300 μm dikke delen die met een cryostat worden gesneden. Afdelingen van deze dikte zorgen voor een verbeterde visualisatie van weefselmicroarchitectuur in een driedimensionale omgeving. Daarnaast behoudt het protocol mesenchymale cellen op een manier die de beeldkwaliteit verhoogt wanneerVergeleken met standaard cryostat of paraffine secties, waardoor de werkzaamheid en betrouwbaarheid van immunostaining verhoogd worden. Wij geloven dat dit protocol alle laboratoria die de huid visualiseren, en eventueel andere weefsels en organen zullen kunnen profiteren.

Om de voordelen van onze techniek te benadrukken hebben we onze dikke 3D-weefsel doorsnedechniek, &quot;horizontale gehele berg&quot;, vergeleken met klassieke bevroren delen. Klassieke bevroren delen werden gesneden zoals eerder beschreven 5 . Om een ​​visuele structuur voor de epidermis in te microscopische beelden te geven, immunostainen we voor integrin alpha-6 (Itga6), dat een component is die epidermale cellen verankert naar het onderliggende keldermembraan 6 . We hebben ook de arrector pili spier (APM) genoemd, die verantwoordelijk is voor piloerectie (ook bekend als &quot;goosebumps&quot;), met integrin alpha-8 7 . In de klassieke bevroren secties werden de meeste haarfollikels die met Itga6 werden zichtbaar niet doorsneden over de gehele lengte, waardoor overwegend onvolledige haarfollikels per sectie werden genereerd in vergelijking met horizontale gehele mounts ( Figuur 4a -4d </strong&gt;). Dikke weefsel dwarsdoorsneden maken het mogelijk om meer Z-stapel lagen te verwerven in vergelijking met conventionele 10 μm secties, waardoor een vollediger 3D-afbeelding mogelijk is. Dit wordt nog duidelijker bij het bestuderen van de integriteit van APM&#39;s, die geassocieerd zijn met de haarfollikels en het overliggende keldermembraan. In klassieke cryosecties werden het grote gedeelte van APM&#39;s gefractioneerd ( Figuur 4a -4d ). Daarnaast wordt de weefselintegriteit van het hypodermale compartiment bewaard in horizontale gehele mounts, in vergelijking met de vernietiging van adipocyten wanneer cryosecties zijn gehecht aan glazen glijbanen, die een bekend bevriezing ontdooft artefact is ( Figuur 4a- b , vergelijk hypodermale Regio&#39;s) 8 . <img alt="Figuur 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56106/56106fig4.jpg" /> Figuur 4. Horizontale gehele mouNt vergeleken met een klassieke cryosectie. (A) Klassiek verkregen huid vriescoupes 10 urn dik en (b) 100 urn dikke 3D weefsel doorsneden werden gemerkt met integrine alfa-6 (Itga6) en integrine alfa-8 (Itga8) te visualiseren de epidermale compartiment en arrector pili spieren , Respectievelijk. De afbeeldingen van de dikke weefsel dwarsdoorsneden worden weergegeven als maximale projecties van een grote Z-stack. De witte frames geven aan op de gebieden die worden vergroot, weergegeven in ( c ) de klassieke en ( d ) horizontale gehele bergafdelingen. ( E ) Intacte haarfollikels en ( f ) intacte arrector-pili-spieren werden gekwantificeerd in zowel de klassieke als de horizontale gehele secties. Schaalstaven geven 100 μm aan. De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± standaardfout van de gemiddelde (SEM). Een sectie per biologisch replicaat ( n = 3) werd gekwantificeerd. Unpaired t-test * P &lt;0,05, *** P &lt;0,0005. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56106/56106fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin at JoVE.com

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Horizontale gehele berging: Een nieuw verwerkings- en beeldprotocol voor dikke, driedimensionale weefsel dwarsdoorsneden van de huid

Dit werk presenteert een nieuw verwerkings- en beeldprotocol voor dikke, driedimensionale weefsel doorsnede analyse die de volledige exploitatie van confocale beeldvormingsmodaliteiten mogelijk maakt. Dit protocol behoudt de antigeniciteit en vertegenwoordigt een robuust systeem om huidhistologie en mogelijk andere weefstypen te analyseren.

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

A Novel Use of Three-dimensional High-frequency Ultrasonography for Early Pregnancy Characterization in the Mouse

Een roman gebruik van driedimensionale hoogfrequente Ultrasonografie voor vroege zwangerschap karakterisering in de muis

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualiseren van Multiciliated cellen in de zebravis via een gecombineerde Protocol van hele Mount fluorescentie In Situ hybridisatie en immunofluorescentie

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Geheel-mount Clearing en kleuring van Arabidopsis bloem organen en Siliques

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Kwantitatieve geheel-mount immunofluorescentie analyse van cardiale Progenitor populaties in muis embryo 's

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

Driedimensionale weergave en analyse van Immunolabeled, verduidelijkt menselijke placenta Villous vasculaire netwerken

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

Three-dimensional Inflammatory Human Tissue Equivalents of Gingiva

Driedimensionale inflammatoire menselijk weefsel equivalenten van tandvlees

Periodontal diseases (such as gingivitis and periodontitis) are the leading causes of tooth loss in adults. Inflammation in gingiva is the fundamental ...

Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution

Geheel-mount confocale microscopie voor volwassen oor huid: een modelsysteem om te studeren, Neuro-vasculaire vertakkende genuitdrukking en immuun cel distributie

Here, we present a protocol of a whole-mount adult ear skin imaging technique to study comprehensive three-dimensional neuro-vascular branching ...

Three-dimensional Organotypic Cultures of Vestibular and Auditory Sensory Organs

Driedimensionale Organotypic culturen van vestibulaire en auditieve zintuigen

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Hele Mount immunofluorescentie en follikel kwantificering van gekweekte muis eierstokken

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

Een vereenvoudigde en efficiënte methode om te isoleren van de primaire mens keratinocyten van volwassen huidweefsel

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...