Name: horizontal whole mount: a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-sections of skin
Uploaded: 2017-08-02T15:00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin at JoVE.com

Författarna erkänner sponsring från Thermo-Fisher Scientific och tackar Nikon Imaging Center vid Kings College London för support under konfokal bildförvärv.

Alla djurförsök var föremål för lokalt etiskt godkännande och utfördes enligt villkoren i en brittisk regeringens hemkontorlicens. 1. Hudskörd och kryopreservering <ol><li> Beredningar. <ol><li> Förbered en 100 mm odlingsskål med 25 ml 4% PFA och två 100 mm odlingsrätter med 25 ml 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS). </li><li> Fyll rektangulära avlägsna cryomolds med två tredjedelar med optimal skärningstemperaturförening (OCT). </li><li> Placera en metallplatta, på vilken cryoblocken kan placeras i ett senare steg, in i -80 ° C frysen. </li></ol></li><li> Hudskörning, fixering och kryopreservering. <ol><li> Klipp ut dorsalområdet hos djurkadavern med en torr elektrisk rakapparat. OBS: I detta exempel användes postnatala dag 21 vildtypsmus. </li><li> Skörda områdena av intresse på huden. OBS: Den dorsomediella regionen av musshud ( <stronG class = &quot;xfig&quot;&gt; Figur 1a) innehåller den högsta andelen hårfolliklar som är jämnt fördelade och inriktade, vilket möjliggör optimal orientering för snittning. Avlägsnandet av underliggande icke-dermal vävnad är inte nödvändig men kan utföras vid behov. </li><li> Trim den skördade huden i rektangulära bitar av lämplig storlek för att passa in i botten av cryomold, med hänsyn till riktningstillväxten hos hårfollikelkornet. OBS! Mindre hudskivor kan vara enklare att hantera för nybörjare, eftersom de är mindre benägna att krossa under inkubations- och monteringsprocessen. Exemplet som visas här är en yta av 1 cm 2 med dorsal hud som passar in i en 22 x 30 x 20 mm kryomjöl ( figur 2a ). </li><li> Fixera huden vid rumstemperatur i 25 ml 4% PFA i 10-30 minuter, beroende på tjockleken på hudproverna ( Figur 1b ). </li><li> Tvätta hudproverna två gånger i 25 ml PBSI minst 5 min vardera ( figur 1b ). </li><li> Dab huden prov på en pappershandduk för att noggrant dränera vävnaden av överskott PBS, vilket kan resultera i kristallisering under frysningsprocessen och kan påverka kryosektionsresultat. OBS: En standard sackarosgradient är inte nödvändig. Detta kan emellertid också införlivas i protokollet efter användarens eget gottfinnande. </li><li> Var medveten om hårsäckarnas orientering för varje hudprov. Använd ett dissekeringsmikroskop för visuellt hjälpmedel (särskilt någon som utför protokollet för första gången). Sätt in hudprovet i den OCT-fyllda cryomolden och jämvikta alla delar av huden med OCT genom att ta bort några luftbubblor som är fästa på det klippta hårets yta med hjälp av tangor ( figurerna 2a och 2b ). </li><li> Skjut huden till botten av OCT-fylld block så att den ligger i spol med botten. OBS: Huden kan orienteras i vilken riktning som helst, aSå länge som hårfollikelns korn är noterat för korrekta skärprocedurer. Cryomolds kommer att omorienteras när blocken är fästa vid kryostat för kryosektion. Markera hårfollikelorienteringen på cryomolden, eftersom detta steg bestämmer den efterföljande orienteringen av kryostatskäret. </li><li> Överför kryoblocken till metallplattan i -80 ° C frysaren för att undvika flytande och dislokation av vävnaden. </li><li> Övervaka frysprocessen för att upprätthålla hudens orientering i botten av cryomolden, eftersom osynliga luftbubblor kan orsaka att huden stiger upp till cryomoldens yta. OBS: Cryomolds med frusen vävnad kan lagras i mer än ett år vid -80 ° C och kan återanvändas för ytterligare sektioner. </li></ol></li></ol><img alt="Figur 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56106/56106fig1.jpg" /> Figur 1. Skörd och fixering av mushud. </strong&gt; ( A ) Hudvävnad skördades från den dorsomediella regionen hos djurkadavern. Hårfolliklar i denna region är jämnt fördelade och inriktade och möjliggör därför optimal orientering under snittning, såsom indikeras av pilarna. ( B ) Efter skärning av kvadrater av lämplig storlek som passar in i cryomolden fixerades hudvävnaden i 4% PFA i 15 min och tvättades två gånger i PBS under 5 min vardera. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56106/56106fig1large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.</a> 2. Tjock vävnads tvärsnitt <ol><li> Förberedelse och vävnadsorientering för montering på kryostat. <ol><li> Förbered en 100 mm odlingsskål med 15 ml PBS. Placera det på ett lättåtkomligt område på kryostat. Dessutom förbereder en 12-brunnsplatta med 2,5 ml PBS per brunn; Märkning enligt proverna för långtidsförvaring av seCtioner vid 4 ° C. Använd tång för att hantera sektionerna. </li><li> Justera temperaturen på kryostat till -20 ° C. OBS! Temperaturen kan påverka sektionen, men en bra guide är att starta vid -20 ° C. </li><li> För att få avsnitt cirka två hårsäckar tjocka, justera kryostat för att skära sektionerna 150 μm tjocka. OBS: Tjockleken på sektionen kan varieras beroende på användarens behov och begränsningarna i mikroskopet som ska användas för analys. OBS: Orienteringen av provet är avgörande för att få hudsektioner med hårsäckar i lämplig orientering. Detta uppnås genom att montering ordentligt på kryostatblocket. Se till att sektionsplanet är parallellt med hårfollikelriktningen ( Figur 2c ). Som tidigare nämnts är korrekt riktning av sektionsplanet i hudprovet ett avgörande steg för att bestämma kvaliteten på de bilder som kommer att förvärvas iEtt senare steg. </li></ol></li></ol><img alt="Figur 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56106/56106fig2.jpg" /> Figur 2. Inbäddning, cryopreservation och sektionering. ( A ) Markering av hårfollikelriktningen (HF) på cryomolden, indikerad av de svarta pilarna, är viktig för korrekt orientering under kryosektion. ( B ) Sektionsplanet måste anpassas till hårfollikelorienteringen för att generera sektioner där hårsäckens hela längd förblir intakt. ( C ) Sektionerna skars per hårfollikelorienteringen som indikerades av de svarta pilarna på cryomold. ( D ) De tjocka vävnads-tvärsnitten uppsamlades med metallpincetter och ( e ) överfördes till en 100 mm odlingsskål innehållande 1x PBS. ( F ) Vid rumstemperatur löser PBS bort OC.T. Förening som omger de tjocka vävnadens tvärsnitt, vilket indikeras av de vita pilarna. Sektionerna flyter sedan fritt i PBS. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56106/56106fig2large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.</a> <ol start="2"><li> Cryosectioning. <ol><li> Klipp en sektion med hjälp av kryostat. Använd tång för att samla ULT som innehåller det inbäddade skiktet ( Figur 2d ). OBS! Använd en kryostat som möjliggör oberoende rörelse och justering längs axlarna X, Y och Z för optimal provplacering. Detta möjliggör generering av idealiskt inriktade vävnads tvärsnitt. </li><li> Överför sektionen ur kryostat till 100 mm odlingsskålen fylld med PBS och fortsätt med nästa skiva. Samla inte proverna på ett objektglas ( Figur 2e ). OBS: Vid rumstemperatur kommer PBS att lösas uppULT, lämnar skivor som är lätta att hantera med tångar ( Figur 2f ). OBS! Färsk PBS kan behövas i 100 mm odlingsskålen efter upplösning av många vävnadssnitt 100 μm tjocka och kan ändras i enlighet därmed. </li><li> Använd tång för att överföra flytande hudavsnitt till den korrekt märkta brunnen i en 12-brunnsplatta fylld med 2,5 ml PBS ( Figur 3a , vänster). OBS: Vid 4 ° C kan proverna lagras i minst två dagar. För långvarig förvaring av OCT-block som innehåller halt i huden, täta skärytan med en droppe färskt OCT. Efter frysning av OCT-droppen, sätt in det använda OCT-blocket i parafilm och sätt tillbaka det i frysen på -80 ° C . </li></ol></li></ol> 3. Immunfluorescerande märkning. <ol><li> Förbered PB bufferten (PBS kompletterad med 0,5% skummjölkspulver, 0,25% fiskhudgelatin och 0,5% Triton X-100) vid leasT 2 h i förväg, såsom beskrivits tidigare 5 . OBS: Natriumazid kan tillsättas till PB-buffert för antikroppsbesvarande för upprepad användning av färgningsbufferten. </li><li> Etikett 1,5 ml mikrocentrifugrör och tillsätt 500 μl PB-buffert per rör. Använd försiktigt tångar för att överföra hudskivorna från PBS till separata rör som innehåller PB-bufferten för att blockera ( Figur 3a , höger). Se till att alla skivor är helt nedsänkta. Placera mikrocentrifugrören på en sågknäppare vid hastigheter högst 10 oscillationer per minut, vilket inte bör störa vävnadsintegriteten i 1 timme vid rumstemperatur. OBS! Det är kritiskt att hastigheten inte överstiger 10 oscillationer per minut på sågsvaggen, eftersom det kommer att leda till förvirring. <ol><li> Medan det är möjligt att lägga till mer än en skiva per mikrocentrifugrör, för att spara antikroppar, placera bara en skiva per rör. Använd en volym för att minska antikroppsförbrukningenAv 250 pl. OBS: Vid behov ersätt mikrocentrifugrör med till exempel 96-brunnsplattor. Placeringen av de tjocka vävnadstvärsnitten i 1,5-ml mikropentrifugrör möjliggör emellertid den mest effektiva antikroppspenetrationen i vävnaden på grund av den förhöjda vätskestörningen. </li></ol></li><li> Märk separat 1,5 ml mikrocentrifugrör för varje hudskiva och tillsätt 500 μl PB-buffert och lämplig mängd primära antikroppar. Efter 1 timmars blockering, överför hudskivorna till de nyberedda rören som innehåller antikropparna. Inkubera skivorna vid 4 ° C över natten. OBS: I detta exempel användes följande primära antikroppar: FITC råtta anti-human CD49f vid en koncentration av 1:50 och get-anti-mus / råttintegrin alfa 8 vid en koncentration av 1: 100. </li><li> Nästa dag, förbereda två separata 1,5 ml mikrocentrifugrör innehållande 500 pl PBS per prov. Tvätta skivorna två gånger i 1 h vid rumstemperature. </li><li> Förbered separata 1,5 ml mikrocentrifugrör innehållande 500 | il PB buffert med lämplig koncentration av tillämpliga sekundära antikroppar och 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI). OBS: De sekundära antikropparna som används i detta exempel är Alexa Fluor 488 åsna anti-rått-IgG och Alexa Fluor 555 åsna anti-get IgG vid en koncentration av 1: 500. DAPI användes i en koncentration av 1: 100. </li><li> Överför försiktigt hudproverna till PB-bufferten, som innehåller sekundär antikroppen och DAPI, och inkubera hudskivorna vid rumstemperatur i 1 timme vid låg hastighet på en rotator eller skakapparat. </li><li> Förvara skivorna vid 4 ° C i PB-bufferten innehållande den sekundära antikroppen och DAPI i upp till fyra dagar och eventuellt längre om natriumazid tillsätts till PBS. </li></ol><img alt="Figur 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56106/56106fig3.jpg" /> Figur 3. ImmunofluorescMärkning och montering. ( A ) Vätsketvärsnittet kan lagras i 12-brunnsplattor under minst två dagar vid 4 ° C. Innan immunofluorescerande (IF) -märkning överför vävnadsövergångarna av intresse till 1,5 ml mikrocentrifugrör innehållande PB-buffert för blockering, såsom indikeras med pilen 1. För IF-märkning, klistra fast vid flerstegsförfarandet som utarbetats i steg 3. Varje En del av steg 3 kräver noggrann överföring av vävnadsövergångarna till färskberedda mikrocentrifugrör innehållande primär antikroppslösning, sekundär antikroppslösning eller tvättbuffert, vilket indikeras med pil 2. ( b ) Efter IF-märkning, Sektionerna unraveled och platta i en droppe glycerol, med hjälp av ett dissekeringsmikroskop. ( C ) När vävnadstvärsnittet är helt utplattat på botten av en skyddsskiva används en vanlig mikroskopskiva för att montera sektionen. <aHref = &quot;http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56106/56106fig3large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur. 4. Montering för mikroskopisk visualisering <ol><li> Före bildbehandling, överför hudskivorna till separata mikrocentrifugrör innehållande 500 μl PBS för att tvätta bort de sekundära antikropparna och DAPI. </li><li> Använd en pipette på 1000 μL, men avlägsna de första 0,5 cm pipettspetsen för att möjliggöra korrekt pipettering av den högviskösa glycerolen. Placera en 22 x 50 mm täckglas på en mörk bakgrund under ett dissekeringsmikroskop ( Figur 3b ). </li><li> Tillsätt en droppe av 100% glycerol på täcklocket ( Figur 3b ). Överför hudskivan från mikrocentrifugröret på glyceroldroppen. Använd dissekeringsmikroskopet och spetsiga tångar för att försiktigt varva ner de skivor som är krullade. OBS: Eftersom skivan flyter i glyenCeroldropp, kan den vara avlägsnad genom att koaxera vävnadens naturliga benägenhet att återgå till sin normala form. Tvinga inte den onaturliga rätningen på skivan, eftersom det kan orsaka skada på vävnaden. </li><li> Montera vävnaden när hela längden på hudavsnittet är ordentligt orienterad och plattad på locket. Använd en vanlig mikroskopglas. Detta steg kommer att räta ut skivskivan ytterligare. OBS: Undvik luftinfångning ( Figur 3c ). </li><li> Bild i de glycerolmonterade hudsektionerna inom de närmaste två dagarna. OBS: Förlängd lagring påverkar vävnads- och bildkvaliteten negativt. I detta exempel förvärvades alla bilder med ett upprätt konfokalmikroskop med 20x-objektiv. </li></ol>

<ol>
	<li>Plikus, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+dermal+BMP+signalling+regulates+stem+cell+activation+during+hair+regeneration.">Cyclic dermal BMP signalling regulates stem cell activation during hair regeneration.</a> Nature. 451 (7176), 340-344 (2008).</li><li>Zhang, Y. V., Cheong, J., Ciapurin, N., McDermitt, D. J., Tumbar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+self-renewal+and+differentiation+phases+in+the+niche+of+infrequently+dividing+hair+follicle+stem+cells.">Distinct self-renewal and differentiation phases in the niche of infrequently dividing hair follicle stem cells.</a> Cell Stem Cell. 5 (3), 267-278 (2009).</li><li>Jensen, U. B., Lowell, S., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spatial+relationship+between+stem+cells+and+their+progeny+in+the+basal+layer+of+human+epidermis:+a+new+view+based+on+whole-mount+labelling+and+lineage+analysis.">The spatial relationship between stem cells and their progeny in the basal layer of human epidermis: a new view based on whole-mount labelling and lineage analysis.</a> Development. 126 (11), 2409-2418 (1999).</li><li>Braun, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+stem+cell+proliferation+and+lineage+commitment:+visualisation+of+label-retaining+cells+in+wholemounts+of+mouse+epidermis.">Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis.</a> Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).</li><li>Driskell, R. R., Giangreco, A., Jensen, K. B., Mulder, K. W., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox2-positive+dermal+papilla+cells+specify+hair+follicle+type+in+mammalian+epidermis.">Sox2-positive dermal papilla cells specify hair follicle type in mammalian epidermis.</a> Development. 136 (16), 2815-2823 (2009).</li><li>Niculescu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+ablation+of+integrin+alpha-6+in+mouse+epidermis+leads+to+skin+fragility+and+inflammation.">Conditional ablation of integrin alpha-6 in mouse epidermis leads to skin fragility and inflammation.</a> Eur J Cell Biol. 90 (2-3), 270-277 (2011).</li><li>Fujiwara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basement+membrane+of+hair+follicle+stem+cells+is+a+muscle+cell+niche.">The basement membrane of hair follicle stem cells is a muscle cell niche.</a> Cell. 144 (4), 577-589 (2011).</li><li>Desciak, E. B., Maloney, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artifacts+in+frozen+section+preparation.">Artifacts in frozen section preparation.</a> Dermatol Surg. 26 (5), 500-504 (2000).</li><li>Driskell, R., Jahoda, C. A., Chuong, C. M., Watt, F., Horsley, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+dermal+adipose+tissue.">Defining dermal adipose tissue.</a> Exp Dermatol. 23 (9), 629-631 (2014).</li><li>Driskell, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+fibroblast+lineages+determine+dermal+architecture+in+skin+development+and+repair.">Distinct fibroblast lineages determine dermal architecture in skin development and repair.</a> Nature. 504 (7479), 277-281 (2013).</li><li>Snippert, H. J., Schepers, A. G., Delconte, G., Siersema, P. D., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slide+preparation+for+single-cell-resolution+imaging+of+fluorescent+proteins+in+their+three-dimensional+near-native+environment.">Slide preparation for single-cell-resolution imaging of fluorescent proteins in their three-dimensional near-native environment.</a> Nat Protoc. 6 (8), 1221-1228 (2011).</li><li>Sada, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+cellular+lineage+hierarchy+in+the+interfollicular+epidermis+of+adult+skin.">Defining the cellular lineage hierarchy in the interfollicular epidermis of adult skin.</a> Nat Cell Biol. 18 (6), 619-631 (2016).</li><li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLARITY+for+mapping+the+nervous+system.">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nat Methods. 10 (6), 508-513 (2013).</li><li>Tetteh, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replacement+of+Lost+Lgr5-Positive+Stem+Cells+through+Plasticity+of+Their+Enterocyte-Lineage+Daughters.">Replacement of Lost Lgr5-Positive Stem Cells through Plasticity of Their Enterocyte-Lineage Daughters.</a> Cell Stem Cell. 18 (2), 203-213 (2016).</li></ol>

Författarna skulle vilja avslöja att publikationen av detta manuskript finansierades av Thermo-Fisher Scientific Inc.

Here, we present the "horizontal whole mount" technique, which has several advantages over classical frozen sections. One advantage of our technique is that it can easily be performed with standard histology equipment and a confocal microscope. Second, the tissue integrity is preserved in a superior manner when compared to standard cryosections. For example, adipocytes within the hypodermal layer (i.e., dermal white adipocytes (DWAT))9 are severely disrupted in standard cryosections, which makes studying tissues that are adipose-laden impossible. Our technique allows for the full analysis of the adipocytes in this layer and may be adapted to other tissues with high adipocyte contents. Furthermore, this allows for the improved detection of mesenchymal cells in lineage-tracing studies 2,10. 
Standard cryosections, by their very nature, can never reveal the true 3D aspects of a tissue through confocal microscopy. This means that thicker sections are advantageous in the analysis of skin, since hair follicles, as well as their substructures, can traverse a depth that exceeds the standard thickness of 10 &#181;m used in classical crysosections. We are intrigued that other tissues, such as the intestine and brain, for example, possess similar challenges with regard to viewing the tissue as a 3D structure2,7,11,12,13. Intriguingly, our technique has already been shown to be beneficial for use in certain applications in the intestines14. We believe that our horizontal whole-mount protocol has the potential be applied to any other tissue requiring 3D analysis.

Revolutionen av mikroskopisk bildhanteringsutrustning möjliggör sofistikerade högupplösta bildhanteringsinstrument. När man förvärvar en mikroskopisk bild av ett komplett tredimensionellt (3D) vävnads tvärsnitt, ger provberedningen dock stora utmaningar och kan vara den begränsande faktorn när det gäller att definiera bildkvalitet. Varje separat steg förtjänar noggrann övervägning för att bevara vävnadsmorfologi och antigeniteten hos målproteiner, för att minimera bearbetningsinducerade artefakter och för att maximera den slutliga bildkvaliteten. Till exempel kräver den traditionella analysen av huden en bild med utsikt över epidermis och dermis, med hårsäckar som är ordentligt orienterade, vilket möjliggör anatomisk analys av stamcellsrumbidrag till hudhemostas 1 , 2 . Detta kräver noggrann koncentration om hur huden är inbäddad och snittad. Viktigt är att hårfolliklar kan vara tjockareÄn 100 μm, vilket i hög grad överstiger standardparafinen eller frusen snitttjocklek, vilket resulterar i en lägre analysanalys jämfört med hela fästen eller tjocka tvärsnitt 3 , 4 , 5 . Tillsammans är varje steg i provberedning för mikroskopisk analys en kritisk determinant som påverkar bildanalys. Här presenteras ett nytt behandlingsprotokoll för tjock 3D-tvärsnittsanalys, som vi kallar &quot;horisontellt helmonterat&quot;. Protokollet bevarar starkt antigenicitet och möjliggör fullt utnyttjande av tjocka delar av huden med hjälp av standard konfokalbildningsutrustning. Detta är en komplett guide till användning av hud för tjock tvärsnitt behandling och bildbehandling, inklusive vävnadsskörd och paraformaldehyd (PFA) -assisterad kryopreservering (steg 1), generering av 100 μm tjocka vävnads tvärsnitt med en kryostat (steg 2) Och immunofluorescerande märkning och montering (steg 3 och 4). De representativa resultaten jämför konfokala bilder av två distinkta histologiska förberedelsestekniker klassisk kryosektion och tjock 3D-tvärsnitt, vilket belyser fördelarna med &quot;horisontella hela fästen&quot; för den potentiella användaren av detta protokoll.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="658">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">PBS</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">homemade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Gelatin, from cold water fish skin</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G7765</td>
			<td>250ML</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:273px;">Glycerol</td>
			<td style="width:99px;">BDH Laboratory Supplies</td>
			<td style="width:119px;">444482V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">O.C.T. compound</td>
			<td style="width:99px;">VWR chemicals</td>
			<td style="width:119px;">361603E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Peel-A-Way embedding molds</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E6032-1CS</td>
			<td>Square S-22</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Non-Fat Powdered Milk</td>
			<td style="width:99px;">Bio Basic Inc.</td>
			<td style="width:119px;">NB0669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T9284</td>
			<td>500ML</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">4&#8242;,6-Diamidino-2-phenylindole, dilactate (DAPI)</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">FITC Rat Anti-Human CD49f</td>
			<td style="width:99px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:119px;">555735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Mouse/Rat Integrin alpha 8 Antibody</td>
			<td style="width:99px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:119px;">AF4076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">Alexa Fluor 488 donkey anti-rat IgG</td>
			<td style="width:99px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">A21208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">Alexa Fluor 555 donkey anti-goat IgG</td>
			<td style="width:99px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">A21432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:273px;">CryoStar NX70</td>
			<td style="width:99px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">100mm Culture dishes</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">Disposable scalpels</td>
			<td style="width:99px;">Swann-Morton</td>
			<td style="width:119px;">Ref 0501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">pointed metal forceps</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">1.5 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:99px;">VWR</td>
			<td dir="LTR">211-2130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">12 Well plates</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">CLS3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Dissecting microscope</td>
			<td style="width:99px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">20 ul and 1000 ul Pipette</td>
			<td style="width:99px;">Gilson</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;">1000&#181;l XL Graduated TipOne Filter Tip (Sterile)</td>
			<td style="width:99px;">Star Lab</td>
			<td dir="LTR">S1122-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;">20&#181;l Bevelled TipOne Filter Tip (Sterile)</td>
			<td style="width:99px;">Star Lab</td>
			<td>S1120-1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Rocking shaker plate</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">Microscope slides, menzel Glaeser</td>
			<td style="width:99px;">Thermos Scientific</td>
			<td style="width:119px;">631-9483</td>
			<td>Superfrost Plus</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">Cover Glasses, Menzel Glaeser</td>
			<td style="width:99px;">Thermos Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MENZBB024060AB</td>
			<td>24 x 60 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:99px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

horizontal whole mount: a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-sections of skin

Att bearbeta en vävnad av intresse för att skapa en mikroskopisk bild som stöder ett vetenskapligt argument kan vara utmanande. Förvärvet av högkvalitativa mikroskopiska bilder är inte helt beroende av mikroskopets kvalitet utan också på vävnadsprocessens metoder, vilket ofta innefattar flera kritiska åtgärder eller steg. Dessutom representerar mesenkymcelletyper i huden och andra vävnader en ny utmaning för vävnadstillverkning och bildbehandling. Här presenterar vi en komplett process, från vävnadsskörd till mikroskopi. Vår teknik kallad &quot;horisontell hel mount&quot; är en som nybörjare snabbt kan bli skicklig i och som möjliggör antigenskydd och detektion i 60-300 μm tjocka sektioner skärs med en kryostat. Sektioner av denna tjocklek ger förbättrad visualisering av vävnadsmikroarkitektur i en tredimensionell miljö. Dessutom bevarar protokollet mesenkymceller på ett sätt som förbättrar bildkvaliteten närJämfört med standardkryostat eller paraffinsektioner, varigenom effektiviteten och tillförlitligheten av immunostaining ökar. Vi tror att detta protokoll kommer att gynna alla laboratorier som visualiserar hud och eventuellt andra vävnader och organ.

För att betona fördelarna med vår teknik jämförde vi vår tjocka 3D-tvärsnittsteknik, &quot;horisontell helmontering&quot;, till klassiska frysta sektioner. Klassiska frusna sektioner skars som tidigare beskrivits 5 . För att ge en visuell struktur för epidermis i mikroskopiska bilder immunostaines vi för integrin alfa-6 (Itga6), vilket är en komponent som förankrar epidermala celler till det underliggande källarmembranet 6 . Vi märkte också arrector pili-muskeln (APM), som är ansvarig för piloerektion (även känd som &quot;goosebumps&quot;), med integrin alpha-8 7 . I de klassiska frusna sektionerna, var de flesta hårsäckar visualiserade med Itga6 inte snittade längs hela längden, vilket genererade övervägande ofullständiga hårsäckar per sektion jämfört med horisontella hela fästen ( Figur 4a -4d </strong&gt;). Tjocka vävnads tvärsnitt gör det möjligt att förvärva fler Z-stack lager jämfört med konventionella 10 μm sektioner, vilket möjliggör en mer komplett 3D-bild. Detta blir ännu mer uppenbart när man studerar integriteten hos APM, vilka är associerade med hårsäckarna och det överliggande basalmembranet. I klassiska kryosektioner fraktionerades den stora delen av APM ( Figur 4a -4d ). Dessutom är vävnadsintegriteten hos det hypodermala facket bevarat i horisontella hela fästen, jämfört med förstörelsen av adipocyter när kryosektioner är fästa vid varma glasskivor, vilket är en välkänd frysnings-upptining artefakt ( Figur 4a- b , jämför hypodermisk Regioner) 8 . <img alt="Figur 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56106/56106fig4.jpg" /> Figur 4. Horisontell hel mouNt jämfört med en klassisk kryosektion. (A) Klassiskt erhållen hud kryosnitt 10 um tjock och (b) 100 | j, m tjock 3D vävnadstvärsektioner märktes med grin alfa-6 (Itga6) och integrin-alfa-8 (Itga8) för att visualisera de epidermala utrymmet och arrector pili muskler , Respektive. Bilderna av de tjocka vävnadstvärsnitten är representerade som maximala projektioner av en stor Z-stapel. De vita ramarna anger de områden som är förstorade, visas i ( c ) de klassiska och ( d ) horisontella helmonteringssektionerna. ( E ) intakta hårsäckar och ( f ) intakta arrectorpili-muskler kvantifierades i både de klassiska och de horisontella helmonterade sektionerna. Skalstänger indikerar 100 μm. Data representeras som medelvärde ± standardfel av medelvärdet (SEM). En sektion per biologisk replikat ( n = 3) kvantifierades. Unpaired t-test * P &lt;0,05, *** P &lt;0,0005. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56106/56106fig4large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin at JoVE.com

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Horisontell helmontering: Ett nytt bearbetnings- och bildprotokoll för tjocka, tredimensionella vävnads tvärsnitt av huden

Detta arbete presenterar ett nytt bearbetnings- och bildningsprotokoll för tjock, tredimensionell vävnadstvärsnittsanalys som möjliggör fullständig utnyttjande av konfokala avbildningsmodeller. Detta protokoll bevarar antigenicitet och representerar ett robust system för att analysera hudhistologi och eventuellt andra vävnadstyper.

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

A Novel Use of Three-dimensional High-frequency Ultrasonography for Early Pregnancy Characterization in the Mouse

En ny användning av tredimensionella högfrekvent ultraljud för tidig graviditet karakterisering i musen

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualisera Multiciliated celler i zebrafisk genom en kombinerad protokoll av hela Mount fluorescerande In Situ hybridisering och immunofluorescens

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Hela-mount Clearing och färgning av Arabidopsis blomma organ och Siliques

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Kvantitativa hela-mount immunofluorescens analys av hjärt stamceller populationer i musembryon

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

Tredimensionell Rendering och analys av Immunolabeled, klargöras mänskliga placenta villösa vaskulär nätverk

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

Three-dimensional Inflammatory Human Tissue Equivalents of Gingiva

Tredimensionella inflammatoriska mänsklig vävnad motsvarigheter av Gingiva

Periodontal diseases (such as gingivitis and periodontitis) are the leading causes of tooth loss in adults. Inflammation in gingiva is the fundamental ...

Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution

Hela-mount konfokalmikroskopi för vuxna öron hud: modellsystem studera Neuro-vaskulär förgrenade morfogenes och immunceller Distribution

Here, we present a protocol of a whole-mount adult ear skin imaging technique to study comprehensive three-dimensional neuro-vascular branching ...

Three-dimensional Organotypic Cultures of Vestibular and Auditory Sensory Organs

Tredimensionella Organotypic kulturer av vestibulära och auditiv sinnesorgan

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Hela berget immunofluorescens och follikeln kvantifiering av odlade mus äggstockarna

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

En förenklad och effektiv metod att isolera primära mänskliga keratinocyter från vuxen hudvävnad

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...