Name: counting proteins in single cells with addressable droplet microarrays
Uploaded: 2018-07-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays at JoVE.com

ASR projetado experimentos, desenvolveu protocolos e analisados dados. SC e PS realizaram experimentos de tamanho de célula. ASR e OC escreveram o manuscrito. Os autores desejam reconhecer com gratidão o apoio do Prof David R. Klug para fornecer acesso a equipamentos. Os autores desejam agradecer a faculdade Imperial de Hackspace avançada para acesso às instalações de prototipagem e fabricação.

1. preparação
<ol><li>
Fazer fichas e Microarrays do anticorpo de impressão
	<ol>
<li>Anexe um isolador de silicone adesiva acrílica para uma lamela acrescida para apoiar um microarray do anticorpo. Isto é referido como o chip. Nota: Vários produtos químicos superficiais foram testados para sua adequação com gotículas endereçáveis. 5 superfície químicas podem precisar de ser otimizado para agentes de captura alternativos. Isoladores ADM estão disponíveis comer...

<ol>
	<li>Willison, K. R., Klug, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+single+cell+and+single+molecule+proteomics+for+clinical+studies.">Quantitative single cell and single molecule proteomics for clinical studies.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 24 (4), 745-751 (2013).</li><li>Heath, J. R., Ribas, A., Mischel, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+tools+for+drug+discovery+and+development.">Single-cell analysis tools for drug discovery and development.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 15 (3), 204-216 (2016).</li><li>Eyer, K., Stratz, S., Kuhn, P., K&#252;ster, S. K., Dittrich, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementing+enzyme-linked+immunosorbent+assays+on+a+microfluidic+chip+to+quantify+intracellular+molecules+in+single+cells.">Implementing enzyme-linked immunosorbent assays on a microfluidic chip to quantify intracellular molecules in single cells.</a> Anal. Chem. 85 (6), 3280-3287 (2013).</li><li>Salehi-Reyhani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+first+step+towards+practical+single+cell+proteomics:+a+microfluidic+antibody+capture+chip+with+TIRF+detection.">A first step towards practical single cell proteomics: a microfluidic antibody capture chip with TIRF detection.</a> Lab. Chip. 11 (7), 1256-1261 (2011).</li><li>Salehi-Reyhani, A., Burgin, E., Ces, O., Willison, K. R., Klug, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addressable+droplet+microarrays+for+single+cell+protein+analysis.">Addressable droplet microarrays for single cell protein analysis.</a> Analyst. 139 (21), 5367-5374 (2014).</li><li>Cristofanilli, M., Budd, G., Terstappen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells,+disease+progression,+and+survival+in+metastatic+breast+cancer.">Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer.</a> N. Engl. J. Med. 351 (8), 781-792 (2004).</li><li>Lan, F., Haliburton, J. R., Yuan, A., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+barcoding+for+massively+parallel+single-molecule+deep+sequencing.">Droplet barcoding for massively parallel single-molecule deep sequencing.</a> Nat. Commun. 7, 1-10 (2016).</li><li>Ramji, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+kinase+signaling+assay+using+pinched+flow+coupled+droplet+microfluidics.">Single cell kinase signaling assay using pinched flow coupled droplet microfluidics.</a> Biomicrofluidics. 8 (3), 34104 (2014).</li><li>He, M., Edgar, J. S., Jeffries, G. D. M., Lorenz, R. M., Shelby, J. P., Chiu, D. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+barcoding+for+single-cell+transcriptomics+applied+to+embryonic+stem+cells.">Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells.</a> Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).</li><li>Reck-Peterson, S. L., Derr, N. D., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+single+molecules+using+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+(TIRFM).">Imaging single molecules using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM).</a> Cold Spring Harb. Protoc. 5 (3), (2010).</li><li>Chen, D., Du, W., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+TIRF+microscopy+to+quantify+and+confirm+efficient+mass+transfer+at+the+substrate+surface+of+the+chemistrode.">Using TIRF microscopy to quantify and confirm efficient mass transfer at the substrate surface of the chemistrode.</a> New J. Phys. 11 (31), 75017 (2009).</li><li>Shi, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+proteomic+chip+for+profiling+intracellular+signaling+pathways+in+single+tumor+cells.">Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (2), 419-424 (2012).</li><li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+picoliter+droplet+array+for+parallel+real-time+polymerase+chain+reaction+based+on+double-inkjet+printing.">A novel picoliter droplet array for parallel real-time polymerase chain reaction based on double-inkjet printing.</a> Lab Chip. 14 (18), 3603 (2014).</li><li>Jogia, G., Tronser, T., Popova, A., Levkin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+Microarray+Based+on+Superhydrophobic-Superhydrophilic+Patterns+for+Single+Cell+Analysis.">Droplet Microarray Based on Superhydrophobic-Superhydrophilic Patterns for Single Cell Analysis.</a> Microarrays. 5 (4), 28 (2016).</li><li>Yen, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Assembled+Pico-Liter+Droplet+Microarray+for+Ultrasensitive+Nucleic+Acid+Quantification.">Self-Assembled Pico-Liter Droplet Microarray for Ultrasensitive Nucleic Acid Quantification.</a> ACS Nano. 9 (11), 10655-10663 (2015).</li><li>Labanieh, L., Nguyen, T. N., Zhao, W., Kang, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Floating+droplet+array:+An+ultrahigh-throughput+device+for+droplet+trapping,+real-time+analysis+and+recovery.">Floating droplet array: An ultrahigh-throughput device for droplet trapping, real-time analysis and recovery.</a> Micromachines. 6 (10), 1469-1482 (2015).</li><li>Lee, Y. Y., Narayanan, K., Gao, S. J., Ying, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+drug+resistance+properties+in+scarce+cancer+stem+cells+using+droplet+microarray.">Elucidating drug resistance properties in scarce cancer stem cells using droplet microarray.</a> Nano Today. 7 (1), 29-34 (2012).</li><li>Popova, A. A., Demir, K., Hartanto, T. G., Schmitt, E., Levkin, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet-microarray+on+superhydrophobic-superhydrophilic+patterns+for+high-throughput+live+cell+screenings.">Droplet-microarray on superhydrophobic-superhydrophilic patterns for high-throughput live cell screenings.</a> RSC Adv. 6 (44), 38263-38276 (2016).</li><li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inkjet+nanoinjection+for+high-thoughput+chemiluminescence+immunoassay+on+multicapillary+glass+plate.">Inkjet nanoinjection for high-thoughput chemiluminescence immunoassay on multicapillary glass plate.</a> Anal. Chem. 85 (15), 7413-7418 (2013).</li><li>Zhu, Y., Zhu, L. -. N., Guo, R., Cui, H. -. J., Ye, S., Fang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoliter-scale+protein+crystallization+and+screening+with+a+microfluidic+droplet+robot.">Nanoliter-scale protein crystallization and screening with a microfluidic droplet robot.</a> Sci. Rep. 4, 5046 (2014).</li><li>Sun, Y., Chen, X., Zhou, X., Zhu, J., Yu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet-in-oil+array+for+picoliter-scale+analysis+based+on+sequential+inkjet+printing.">Droplet-in-oil array for picoliter-scale analysis based on sequential inkjet printing.</a> Lab Chip. 15 (11), 2429-2436 (2015).</li><li>Liberski, A. R., Delaney, J. T., Schubert, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="One+cell-one+well":+A+new+approach+to+inkjet+printing+single+cell+microarrays.">"One cell-one well": A new approach to inkjet printing single cell microarrays.</a> ACS Comb. Sci. 13 (2), 190-195 (2011).</li><li>Yusof, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inkjet-like+printing+of+single-cells.">Inkjet-like printing of single-cells.</a> Lab a Chip - Miniaturisation Chem. Biol. 11 (14), 2447-2454 (2011).</li><li>Zhu, Y., Zhang, Y. -. X., Liu, W. -. W., Ma, Y., Fang, Q., Yao, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Printing+2-dimentional+droplet+array+for+single-cell+reverse+transcription+quantitative+PCR+assay+with+a+microfluidic+robot.">Printing 2-dimentional droplet array for single-cell reverse transcription quantitative PCR assay with a microfluidic robot.</a> Sci. Rep. 5, 9551 (2015).</li><li>Ueda, E., Geyer, F. L., Nedashkivska, V., Levkin, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+Microarray:+facile+formation+of+arrays+of+microdroplets+and+hydrogel+micropads+for+cell+screening+applications.">Droplet Microarray: facile formation of arrays of microdroplets and hydrogel micropads for cell screening applications.</a> Lab Chip. 12 (24), 5218-5224 (2012).</li><li>Kozak, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-volume+wall-less+immunoassays+using+patterned+planar+plates.">Micro-volume wall-less immunoassays using patterned planar plates.</a> Lab Chip. 13 (7), 1342-1350 (2013).</li><li>Yen, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Assembled+Pico-Liter+Droplet+Microarray+for+Ultrasensitive+Nucleic+Acid+Quantification.">Self-Assembled Pico-Liter Droplet Microarray for Ultrasensitive Nucleic Acid Quantification.</a> ACS Nano. 9 (11), 10655-10663 (2015).</li><li>Au, A. K., Lai, H., Utela, B. R., Folch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvalves+and+Micropumps+for+BioMEMS.">Microvalves and Micropumps for BioMEMS.</a> Micromachines. 2 (4), 179-220 (2011).</li><li>Lai, H. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+use+of+laser-based+lysis+for+cell+analysis+on-chip.">Characterization and use of laser-based lysis for cell analysis on-chip.</a> J. R. Soc. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detergent+effects+on+enzyme+activity+and+solubilization+of+lipid+bilayer+membranes.">Detergent effects on enzyme activity and solubilization of lipid bilayer membranes.</a> BBA - Biomembr. 733 (2), 210-215 (1983).</li><li>Ramji, R., Xiang, A. C., Ying, N. J., Teck, L. C., Hung, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Single+Mammalian+Cell+Lysis+in+Picolitre+Droplets.">Microfluidic Single Mammalian Cell Lysis in Picolitre Droplets.</a> J. Biosens. Bioelectron. S12 (1), 10-13 (2013).</li><li>Burgin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+quantification+of+protein+copy+number+using+a+single-molecule-sensitive+microarray.">Absolute quantification of protein copy number using a single-molecule-sensitive microarray.</a> Analyst. 139 (13), 3235 (2014).</li></ol>

Endereçáveis da gota de Microarrays são um método sensível e extensível para determinar quantitativamente o número absoluto de cópia da proteína dentro de uma única célula.
Limitar o nível de ligação não-específica (NSB) é fundamental no âmbito do protocolo para alcançar tão baixo limite de detecção como possível. Proteínas e outras espécies bioquímicas não especìfica podem ligar para um número de interfaces presentes dentro das gotas — a superfície de lamela, o...

O objetivo desse método é determinar a variação em abundância de uma proteína do alvo em uma população celular com resolução de célula única. Análise única célula fornece uma série de benefícios que não estão disponíveis com métodos bioquímicos tradicionais ensemble. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 em primeiro lugar, trabalhando no nível da célula única pode capturar a heterogeneidade rica de uma população de células que seria perdida caso contrário calculando a média do que ocorre com técnicas bioquímicas ensemble tradicional. A maioria dos métodos bioquímicos de cavalo de trabalho funciona com a maior parte, exigindo, como muitas vezes, milhões de células para produzir um resultado. Claro, as consequências da avaliação das populações de célula inteira depende de uma série de fatores, por exemplo, a heterogeneidade na expressão da proteína, onde algumas características importantes da distribuição de abundância de proteína podem ser perdidas. Do ponto de vista prática, a sensibilidade necessária de técnicas única célula torná-los capazes de trabalhar com quantidades de material biológico que é insuficiente para nem as técnicas em massa mais sensíveis funcionar. Um exemplo chave é o estudo dos tipos de células raras como circulantes de células de tumor (CTC) onde menos de 10 CTC pode estar presentes no sangue único 7,5 mL desenhar mesmo para pacientes com uma perspectiva de prognóstico pobre. 6 aqui apresentamos a metodologia necessária para realizar as medições de proteína de célula única usando um volume reduzido, ensaio baseado em anticorpos empregando gotículas de óleo-tampado impresso em um microarray do anticorpo.
Plataformas de gotículas microfluídicos são alto throughput, capaz de gerar milhares de gotas por segundo e capaz de isolar e até mesmo cultivo, células únicas em gotículas individuais para executar uma ampla gama de ensaios bioquímicos. Técnicas baseadas em gotículas são adequadas para a análise da única célula,7,8,9 com notáveis exemplos recentes incluindo DropSeq10 e inDrop11, que tem sido grandemente ajudado pelo poder de técnicas de amplificação. A quantidade limitada de material e não métodos de amplificação para proteínas tornam única célula proteomics especialmente desafiador.
As gotas podem ser analisadas por um número de métodos e microscopia de fluorescência tem sido amplamente utilizada. Técnicas de molécula como a microscopia de fluorescência (TIRF) de reflexão interna total permite moléculas fluorescentes ser visualizado com incomparável relação sinal-ruído. 12 devido ao decaimento exponencial do campo evanescente, apenas fluorophores alta próximo à superfície (ordem de 100nm) são excitadas fazendo TIRF uma boa estratégia na detecção de pequenas quantidades de uma molécula-alvo em uma mistura complexa. A força de corte óptica inerente de TIRF também ajuda a evitar as etapas de lavagem e ensaio de limites de tempo e complexidade. No entanto, TIRF requer superfícies planas e exemplos de microscopia TIRF aplicado em gotículas no fluxo envolvem a formação de uma superfície plana, de que a imagem. 13 para este fim, técnicas de proteomic única célula frequentemente projetar chips microfluídicos em torno de agentes de superfície-imobilizado captura em um formato de microarray. 4 , 14
As gotas, eles mesmos, podem ser formadas em matrizes em superfícies planas, chamados gotículas microarrays. 15 , 16 , 17 organizar espacialmente gotículas em matrizes permite-lhes ser convenientemente indexados, facilmente monitorados ao longo do tempo, individualmente abordados e, se necessário, obtida. Microarrays da gota pode alcançar uma elevada densidade de microreatores com milhares de elementos por chip que são free-standing ou suportadas por estruturas de microplacas. 18 , 19 , 20 eles podem ser formados pela deposição sequencial por robôs de manipulação de líquidos, observadores de jato de tinta, entre em contato com microarrayers21,22,23,24,25, 26 , ou eles podem montar auto em superfícies como superhydrophillic pontos estampados em uma superfície de superhydrophobic. 27 , 28 , 29
Com estas considerações em mente, endereçável Droplet Microarrays (ADMs) foram projetados para combinar a versatilidade, capacidade de endereçamento espacial e volumes reduzidos de microarrays da gota com a sensibilidade de microscopia TIRF única molécula para quantitativamente medir a abundância de proteínas. 5 ADMs permitem análise única célula formando um microarray de gotículas contendo células únicas sobre um microarray do anticorpo, que é então coberto com óleo para evitar a evaporação. Os volumes das gotas são discretos para evitar perda de amostra, que caso contrário seria alcançada em-microplaqueta válvulas em microfluídica de fluxo contínuo. 30 a quantidade absoluta de proteína do alvo de uma única célula é extremamente pequena; no entanto, o reduzido volume de gotas permite a concentração local relativamente alta a fim de que eles são detectados usando um sanduíche ensaio de anticorpo - anticorpo é imobilizada em uma região distinta, ou local, sobre uma superfície que capta a proteína, que por sua vez vincula para um anticorpo de detecção fluorescente etiquetado presente no volume da gota. Como uma rótulo abordagem livre (ou seja, proteínas alvos não precisa ser rotulado diretamente), ADMs são geralmente aplicável ao analisar células a partir de fontes primárias, tais como o sangue processado, bem preciso aspirados e biópsias de tumor dissociadas, bem como células de cultura e os lisados.
Medindo a variação em abundância de proteínas através de uma população celular é importante na determinação da heterogeneidade na resposta, por exemplo, para uma droga e vai ajudar no fornecimento de insight funções celulares e vias, avaliando subpopulações e seus comportamento, bem como identificar eventos raros que caso contrário poderia ser mascarados por métodos em massa. Este protocolo descreve como produzir e usar gota endereçável microarrays para determinar quantitativamente a abundância do fator de transcrição p53 em células cancerosas humanas e pode ser usado para investigar o papel de p53 em resposta a quimioterápicos. A proteína alvo é determinada pela escolha dos anticorpos de captura e deteção e pode ser modificada para incluir mais ou diferentes destinos. As instruções são fornecidas para construir um aparato simples, incorporando um bocal concêntrico de consumíveis de laboratório geral de matriz manualmente 10 gotas de nL tampadas com óleo. O processo completo experimental é descrito por meio de que cada gota é então carregada com uma única célula, que é então lysed e a expressão da proteína, determinada com resolução única molécula usando microscopia TIRF.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>S0115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>SIAL0639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcontact Arrayer</td>
			<td>DigiLab, UK</td>
			<td>OmniGrid Micro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcontact pin</td>
			<td>ArrayIt, USA</td>
			<td>946MP2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips (Nexterion)</td>
			<td>Schott, Europe</td>
			<td>1098523</td>
			<td>Size (mm): 65.0 x 25.0; Thickness (mm) 0.17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p53 capture antibody</td>
			<td>Enzo</td>
			<td>ADI-960-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p53 detection antibody, Alexa Fluor 488 labelled</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-126</td>
			<td>stock concentration 200&#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline-sodium citrate buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15557-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betaine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>61962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 well plate (low volume)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS4511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen gas cylinder</td>
			<td>BOC</td>
			<td>Industrial grade, oxygen-free</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplets</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Patchman NP2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Microinjector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>CellTram Vario</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td>Origio, Denmark</td>
			<td>MBB-FP-L-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pumps</td>
			<td>KD Scientific</td>
			<td>KDS-210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;L syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81020</td>
			<td>Gas tight, PTFE Luer lock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81327</td>
			<td>Gas tight, PTFE Luer lock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone isolator</td>
			<td>Grace Bio-Labs</td>
			<td>JTR24R-A-0.5</td>
			<td>6x4 well silicone isolator with adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser cutter</td>
			<td>VersaLASE</td>
			<td>VLS2.30 CO2 Laser 3W</td>
			<td>for laser cutting of custom isolators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1mm thick acrylic sheet</td>
			<td>Weatherall-UK</td>
			<td>Clarex Precision Sheet 001</td>
			<td>for laser cutting of custom isolators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive sheet</td>
			<td>3M</td>
			<td></td>
			<td>used to adhere custom isolators to microarrayed coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super glue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>LOCPFG3T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 &#956;m ID/360 &#956;m OD fused silica tubing</td>
			<td>IDEX</td>
			<td>FS-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 mm ID/1/16&#8221; OD PFA tubing</td>
			<td>IDEX</td>
			<td>1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.014&#8221; ID/0.062&#8221; OD PTFE tubing</td>
			<td>Kinesis</td>
			<td>008T16-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 mm ID/2.0 mm OD FEP tubing</td>
			<td>IDEX</td>
			<td>1673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumen (BSA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9700100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-pure water</td>
			<td>Millipore, Germany</td>
			<td>MilliQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy &#38; Optics</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIRF microscope with encoded XY stage</td>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td>Nikon Ti-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM-CCD</td>
			<td>Andor Technologies, Ireland</td>
			<td>IXON DU-897E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser excitation source</td>
			<td>Vortran, USA</td>
			<td>Stradus 488-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical lysis laser source</td>
			<td>Continuum, USA</td>
			<td>Surelite SLI-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope filter cube for TIRF</td>
			<td>Chroma, USA</td>
			<td>z488bp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope filter cube for Optical Lysis</td>
			<td>Laser 2000, UK</td>
			<td>LPD01-532R-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>Open Source</td>
			<td></td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>version 7.14 or higher</td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

counting proteins in single cells with addressable droplet microarrays

Muitas vezes celular comportamento e respostas celulares são analisadas a nível de população onde as respostas de muitas células são agrupadas como um resultado médio, mascarando o comportamento de ricos única célula dentro de uma população de complexo. Tecnologias de deteção e quantificação de proteínas de célula única têm feito um impacto notável nos últimos anos. Aqui nós descrevemos uma plataforma de análise de prático e flexível única célula baseada em microarrays endereçável da gota. Este estudo descreve como o número de cópias absoluta de proteínas do alvo pode ser medido com resolução de célula única. O tumor supressor p53 é o gene mais comumente mutado em câncer humano, com mais de 50% dos casos de câncer total, exibindo um padrão de expressão de p53 não-saudável. O protocolo descreve as etapas para criar 10 gotas de nL, dentro do qual as células de câncer humano único são isoladas e o número de cópia da proteína p53 é medido com resolução única molécula determinar com precisão a variabilidade na expressão. O método pode ser aplicado a qualquer tipo de célula incluindo material primário para determinar o número de cópia absoluta de qualquer proteínas alvo de interesse.

O número de cópia absoluta proteína basal de p53 foi determinado com resolução única célula em uma linhagem de células de câncer de cólon humano, células BE. Demonstramos como expressão de p53 pode variar ao longo de várias ordens de grandeza e mostrar uma correlação positiva fraca entre número de cópia tamanho e proteína celular dentro da população de célula BE descanso.
Endereçável Droplet Microarrays fo...

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Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

Aqui nós apresentamos gotículas endereçável microarrays (ADMs), um método de matriz com base gota capaz de determinar a abundância absoluta de proteínas em células únicas. Podemos demonstrar a capacidade de ADMs caracterizam a heterogeneidade na expressão do tumor supressor p53 de proteína em uma linhagem de células cancerosas humanas.

Contagem de proteínas em células únicas com gotículas endereçável Microarrays

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells

Aplicação de Laser Microirradiação para exame de Single e Double Strand reparação em células de mamíferos

Highly coordinated DNA repair pathways exist to detect, excise and replace damaged DNA bases, and coordinate repair of DNA strand breaks. While molecular ...

Pesquisa do câncer

Desthiobiotin-Streptavidin-Affinity Mediated Purification of RNA-Interacting Proteins in Mesothelioma Cells

Desthiobiotin-Streptavidin-afinidade mediada purificação de proteínas RNA-interagindo em células mesotelioma

The in vitro RNA-pulldown is still largely used in the first steps of protocols aimed at identifying RNA-binding proteins that recognize specific RNA ...

Phospho Flow Cytometry with Fluorescent Cell Barcoding for Single Cell Signaling Analysis and Biomarker Discovery

Citometria de fluxo phospho com Barcoding fluorescente de célula para célula única sinalização análise e descoberta de Biomarker

Aberrant cell signaling plays a central role in cancer development and progression. Most novel targeted therapies are indeed directed at proteins and ...

Using Microarrays to Interrogate Microenvironmental Impact on Cellular Phenotypes in Cancer

Usando Microarrays para interrogar o impacto microambiental em phenotypes celulares no cancro

Understanding the impact of the microenvironment on the phenotype of cells is a difficult problem due to the complex mixture of both soluble growth ...

An Orthotopic Endometrial Cancer Model with Retroperitoneal Lymphadenopathy Made From In Vivo Propagated and Cultured VX2 Cells

Um modelo de câncer endometrial ortotópico com linfadenopatia retroperitoneal feita a partir de in vivo propagadas e cultivadas VX2 células

Endometrial cancer is the most common gynecologic malignancy in North America and the incidence is rising worldwide. Treatment consists of surgery with or ...

Droplet Digital TRAP (ddTRAP): Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

Droplet Digital TRAP ddTRAP: Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

ARMADILHA digital da gota (ddTRAP): adaptação do protocolo da amplificação da repetição de telomere à reacção em cadeia da polimerase de droplet Digitas

The telomere repeat amplification protocol (TRAP) is the most widely used assay to detect telomerase activity within a given a sample. The polymerase ...

In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish

In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Fluorescente Sílica Nanopartículas em Zebrafish

Developing nanoparticles capable of detecting, targeting, and destroying cancer cells is of great interest in the field of nanomedicine. In vivo animal ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

Avaliação In Vitro da Transformação Oncogênica em Células Epiteliais Mamárias Humanas

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Multiparametric Tumor Organoid Drug Screening Using Widefield Live-Cell Imaging for Bulk and Single-Organoid Analysis

Triagem de Drogas Organoides Tumorais Multiparamétricas Usando Imagem de Células Vivas de Campo Amplo para Análise a Granel e Organoide Único

Patient-derived tumor organoids (PDTOs) hold great promise for preclinical and translational research and predicting the patient therapy response from ex ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

Implante Ortotópico de Células Cancerosas Derivadas do Paciente em Camundongos Recapitula o Câncer Colorretal Avançado

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...