Name: counting proteins in single cells with addressable droplet microarrays
Uploaded: 2018-07-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays at JoVE.com

ASR designad experiment, utvecklat protokoll och analyserade data. SC och PS utförde cell storlek experiment. ASR och OC skrev manuskriptet. Författarna vill tacksamt erkänner stöd av Prof. David R. Klug för att ge tillgång till utrustning. Författarna vill tacka de Imperial College avancerade Hackspace för tillgång till tillverkning och prototyping faciliteter.

1. beredning
<ol><li>
Gör chips och print antikropp microarrays
	<ol>
<li>Bifoga en självhäftande silikon/akryl isolator till ett täckglas functionalized för att stödja en antikropp microarray. Detta benämns som chip. Obs: Olika surface kemier har testats för sin lämplighet med adresserbara droppar. 5 surface kemier kan behöva optimeras för alternativa fånga agenter. ADM isolatorer finns kommersiellt eller kan produceras av laser skärning akryl (CAD fil för isol...

<ol>
	<li>Willison, K. R., Klug, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+single+cell+and+single+molecule+proteomics+for+clinical+studies.">Quantitative single cell and single molecule proteomics for clinical studies.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 24 (4), 745-751 (2013).</li><li>Heath, J. R., Ribas, A., Mischel, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+tools+for+drug+discovery+and+development.">Single-cell analysis tools for drug discovery and development.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 15 (3), 204-216 (2016).</li><li>Eyer, K., Stratz, S., Kuhn, P., K&#252;ster, S. K., Dittrich, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementing+enzyme-linked+immunosorbent+assays+on+a+microfluidic+chip+to+quantify+intracellular+molecules+in+single+cells.">Implementing enzyme-linked immunosorbent assays on a microfluidic chip to quantify intracellular molecules in single cells.</a> Anal. Chem. 85 (6), 3280-3287 (2013).</li><li>Salehi-Reyhani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+first+step+towards+practical+single+cell+proteomics:+a+microfluidic+antibody+capture+chip+with+TIRF+detection.">A first step towards practical single cell proteomics: a microfluidic antibody capture chip with TIRF detection.</a> Lab. Chip. 11 (7), 1256-1261 (2011).</li><li>Salehi-Reyhani, A., Burgin, E., Ces, O., Willison, K. R., Klug, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addressable+droplet+microarrays+for+single+cell+protein+analysis.">Addressable droplet microarrays for single cell protein analysis.</a> Analyst. 139 (21), 5367-5374 (2014).</li><li>Cristofanilli, M., Budd, G., Terstappen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells,+disease+progression,+and+survival+in+metastatic+breast+cancer.">Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer.</a> N. Engl. J. Med. 351 (8), 781-792 (2004).</li><li>Lan, F., Haliburton, J. R., Yuan, A., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+barcoding+for+massively+parallel+single-molecule+deep+sequencing.">Droplet barcoding for massively parallel single-molecule deep sequencing.</a> Nat. Commun. 7, 1-10 (2016).</li><li>Ramji, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+kinase+signaling+assay+using+pinched+flow+coupled+droplet+microfluidics.">Single cell kinase signaling assay using pinched flow coupled droplet microfluidics.</a> Biomicrofluidics. 8 (3), 34104 (2014).</li><li>He, M., Edgar, J. S., Jeffries, G. D. M., Lorenz, R. M., Shelby, J. P., Chiu, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+encapsulation+of+single+cells+and+subcellular+organelles+into+picoliter-+and+femtoliter-volume+droplets.">Selective encapsulation of single cells and subcellular organelles into picoliter- and femtoliter-volume droplets.</a> Anal. Chem. 77 (6), 1539-1544 (2005).</li><li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+parallel+genome-wide+expression+profiling+of+individual+cells+using+nanoliter+droplets.">Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li><li>Klein, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+barcoding+for+single-cell+transcriptomics+applied+to+embryonic+stem+cells.">Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells.</a> Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).</li><li>Reck-Peterson, S. L., Derr, N. D., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+single+molecules+using+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+(TIRFM).">Imaging single molecules using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM).</a> Cold Spring Harb. Protoc. 5 (3), (2010).</li><li>Chen, D., Du, W., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+TIRF+microscopy+to+quantify+and+confirm+efficient+mass+transfer+at+the+substrate+surface+of+the+chemistrode.">Using TIRF microscopy to quantify and confirm efficient mass transfer at the substrate surface of the chemistrode.</a> New J. Phys. 11 (31), 75017 (2009).</li><li>Shi, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+proteomic+chip+for+profiling+intracellular+signaling+pathways+in+single+tumor+cells.">Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (2), 419-424 (2012).</li><li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+picoliter+droplet+array+for+parallel+real-time+polymerase+chain+reaction+based+on+double-inkjet+printing.">A novel picoliter droplet array for parallel real-time polymerase chain reaction based on double-inkjet printing.</a> Lab Chip. 14 (18), 3603 (2014).</li><li>Jogia, G., Tronser, T., Popova, A., Levkin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+Microarray+Based+on+Superhydrophobic-Superhydrophilic+Patterns+for+Single+Cell+Analysis.">Droplet Microarray Based on Superhydrophobic-Superhydrophilic Patterns for Single Cell Analysis.</a> Microarrays. 5 (4), 28 (2016).</li><li>Yen, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Assembled+Pico-Liter+Droplet+Microarray+for+Ultrasensitive+Nucleic+Acid+Quantification.">Self-Assembled Pico-Liter Droplet Microarray for Ultrasensitive Nucleic Acid Quantification.</a> ACS Nano. 9 (11), 10655-10663 (2015).</li><li>Labanieh, L., Nguyen, T. N., Zhao, W., Kang, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Floating+droplet+array:+An+ultrahigh-throughput+device+for+droplet+trapping,+real-time+analysis+and+recovery.">Floating droplet array: An ultrahigh-throughput device for droplet trapping, real-time analysis and recovery.</a> Micromachines. 6 (10), 1469-1482 (2015).</li><li>Lee, Y. Y., Narayanan, K., Gao, S. J., Ying, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+drug+resistance+properties+in+scarce+cancer+stem+cells+using+droplet+microarray.">Elucidating drug resistance properties in scarce cancer stem cells using droplet microarray.</a> Nano Today. 7 (1), 29-34 (2012).</li><li>Popova, A. A., Demir, K., Hartanto, T. G., Schmitt, E., Levkin, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet-microarray+on+superhydrophobic-superhydrophilic+patterns+for+high-throughput+live+cell+screenings.">Droplet-microarray on superhydrophobic-superhydrophilic patterns for high-throughput live cell screenings.</a> RSC Adv. 6 (44), 38263-38276 (2016).</li><li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inkjet+nanoinjection+for+high-thoughput+chemiluminescence+immunoassay+on+multicapillary+glass+plate.">Inkjet nanoinjection for high-thoughput chemiluminescence immunoassay on multicapillary glass plate.</a> Anal. Chem. 85 (15), 7413-7418 (2013).</li><li>Zhu, Y., Zhu, L. -. N., Guo, R., Cui, H. -. J., Ye, S., Fang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoliter-scale+protein+crystallization+and+screening+with+a+microfluidic+droplet+robot.">Nanoliter-scale protein crystallization and screening with a microfluidic droplet robot.</a> Sci. Rep. 4, 5046 (2014).</li><li>Sun, Y., Chen, X., Zhou, X., Zhu, J., Yu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet-in-oil+array+for+picoliter-scale+analysis+based+on+sequential+inkjet+printing.">Droplet-in-oil array for picoliter-scale analysis based on sequential inkjet printing.</a> Lab Chip. 15 (11), 2429-2436 (2015).</li><li>Liberski, A. R., Delaney, J. T., Schubert, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="One+cell-one+well":+A+new+approach+to+inkjet+printing+single+cell+microarrays.">"One cell-one well": A new approach to inkjet printing single cell microarrays.</a> ACS Comb. Sci. 13 (2), 190-195 (2011).</li><li>Yusof, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inkjet-like+printing+of+single-cells.">Inkjet-like printing of single-cells.</a> Lab a Chip - Miniaturisation Chem. Biol. 11 (14), 2447-2454 (2011).</li><li>Zhu, Y., Zhang, Y. -. X., Liu, W. -. W., Ma, Y., Fang, Q., Yao, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Printing+2-dimentional+droplet+array+for+single-cell+reverse+transcription+quantitative+PCR+assay+with+a+microfluidic+robot.">Printing 2-dimentional droplet array for single-cell reverse transcription quantitative PCR assay with a microfluidic robot.</a> Sci. Rep. 5, 9551 (2015).</li><li>Ueda, E., Geyer, F. L., Nedashkivska, V., Levkin, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+Microarray:+facile+formation+of+arrays+of+microdroplets+and+hydrogel+micropads+for+cell+screening+applications.">Droplet Microarray: facile formation of arrays of microdroplets and hydrogel micropads for cell screening applications.</a> Lab Chip. 12 (24), 5218-5224 (2012).</li><li>Kozak, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-volume+wall-less+immunoassays+using+patterned+planar+plates.">Micro-volume wall-less immunoassays using patterned planar plates.</a> Lab Chip. 13 (7), 1342-1350 (2013).</li><li>Yen, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Assembled+Pico-Liter+Droplet+Microarray+for+Ultrasensitive+Nucleic+Acid+Quantification.">Self-Assembled Pico-Liter Droplet Microarray for Ultrasensitive Nucleic Acid Quantification.</a> ACS Nano. 9 (11), 10655-10663 (2015).</li><li>Au, A. K., Lai, H., Utela, B. R., Folch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvalves+and+Micropumps+for+BioMEMS.">Microvalves and Micropumps for BioMEMS.</a> Micromachines. 2 (4), 179-220 (2011).</li><li>Lai, H. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+use+of+laser-based+lysis+for+cell+analysis+on-chip.">Characterization and use of laser-based lysis for cell analysis on-chip.</a> J. R. Soc. Interface. 5, S113-S121 (2008).</li><li>Salehi-Reyhani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaling+advantages+and+constraints+in+miniaturized+capture+assays+for+single+cell+protein+analysis.">Scaling advantages and constraints in miniaturized capture assays for single cell protein analysis.</a> Lab Chip. 13 (11), 2066-2074 (2013).</li><li>Brown, R. B., Audet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+techniques+for+single-cell+lysis.">Current techniques for single-cell lysis.</a> J. R. Soc. Interface. 5, S131-S138 (2008).</li><li>Womack, M. D., Kendall, D. A., MacDonald, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detergent+effects+on+enzyme+activity+and+solubilization+of+lipid+bilayer+membranes.">Detergent effects on enzyme activity and solubilization of lipid bilayer membranes.</a> BBA - Biomembr. 733 (2), 210-215 (1983).</li><li>Ramji, R., Xiang, A. C., Ying, N. J., Teck, L. C., Hung, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Single+Mammalian+Cell+Lysis+in+Picolitre+Droplets.">Microfluidic Single Mammalian Cell Lysis in Picolitre Droplets.</a> J. Biosens. Bioelectron. S12 (1), 10-13 (2013).</li><li>Burgin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+quantification+of+protein+copy+number+using+a+single-molecule-sensitive+microarray.">Absolute quantification of protein copy number using a single-molecule-sensitive microarray.</a> Analyst. 139 (13), 3235 (2014).</li></ol>

Adresserbara Droplet Microarrays är en känslig och utbyggbar metod för att kvantitativt bestämma absoluta kopia antalet protein i en enskild cell.
Att begränsa nivån på icke-specifik bindning är (NSB) kritiska, i protokollet till att uppnå som låg en detektionsgräns som möjligt. Proteiner och andra biokemiska arter kan icke-specifikt binder till ett antal gränssnitt inom droppar — täckglas ytan, antikroppen spot och gränssnittet olja/vatten. Proteiner kan förloras genom uppde...

Målet med denna metod är att bestämma variationen i överflöd av ett målprotein i en cell befolkningen med enstaka cell upplösning. Enstaka cell analys ger ett antal fördelar som inte finns med traditionella ensemble biokemiska metoder. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 för det första arbetar på enstaka cellnivå kan fånga en cell befolkning som skulle annars förloras genom det genomsnitt som sker med traditionella ensemble biokemiska tekniker rika heterogenitet. Majoriteten av arbetshäst biokemiska metoder fungerar med huvuddelen, som kräver, som de ofta gör, miljontals celler att producera ett resultat. Naturligtvis, konsekvenserna av att bedöma hela cellpopulationer beror på ett antal faktorer, exempelvis heterogenitet i proteinuttryck där några viktiga funktioner av fördelningen av protein överflöd kan missas. Ur ett praktiskt perspektiv, den känslighet som krävs av enstaka cell tekniker gör dem kapabla att arbeta med mängder av biologiska material som är otillräcklig för ännu känsligare bulk teknik att fungera. Ett viktigt exempel på detta är studier av sällsynta celltyper såsom cirkulerande tumörceller (CTCs) där även för patienter med en dålig prognostisk outlook mindre än 10 CTCs kan finnas i en enda 7,5 mL blod rita. 6 här presenterar vi den metod som krävs för att utföra enstaka cell protein mätningar med en minskad volym antikroppsbaserade assay anställa olja-capped droppar tryckt på en antikropp microarray.
Mikroflödessystem droplet plattformar är hög genomströmning, kunna generera tusentals droppar per sekund, och kan isolera och även odling, enstaka celler i enskilda droppar att utföra en rad olika biokemiska analyser. Droplet-baserade tekniker är väl lämpade för enstaka cell analys,7,8,9 med anmärkningsvärda senaste exempel inklusive DropSeq10 och inDrop11, som har varit kraftigt med hjälp av kraften i förstärkning tekniker. Den begränsade mängden material och inga metoder för förstärkning av proteiner gör enstaka cell proteomik särskilt utmanande.
Droppar kan analyseras genom ett antal metoder och fluorescensmikroskopi har använts. Enda molekyl tekniker såsom totalreflexion fluorescensmikroskopi (Frida) tillåter fluorescerande molekyler för att visualiseras med oöverträffad signal-brus-förhållande. 12 på grund av exponentiell förfalla av fältet flyktig, endast fluorophores i hög närhet till ytan (efter 100nm) är glada att göra Frida en bra strategi att upptäcka små mängder av en målmolekyl i en komplex blandning. Inneboende optisk snittning styrkan av Frida också hjälper till att undvika tvätt steg och gränser assay tid och komplexitet. Men Frida kräver plana ytor och exempel på Frida mikroskopi tillämpas på droppar i flöde innebär bildandet av en plan yta som till bilden. 13 därför designa enstaka cell proteomiska tekniker ofta mikroflödessystem marker runt ytan-orörlig fånga agenter i en microarray format. 4 , 14
Droppar, själva, kan bildas i matriser på plana ytor, så kallade droplet microarrays. 15 , 16 , 17 rumsligt organisera droppar i matriser tillåter dem att bekvämt indexeras, enkelt övervakas över tid, individuellt riktat och, om så krävs, Hämtad. Droplet microarrays kan uppnå en hög täthet av mikro-reaktorer med tusentals element per chip som är antingen fristående eller stöds av mikrobrunn strukturer. 18 , 19 , 20 de kan bildas av sekventiell nedfall av vätskehantering robotar, inkjet spotters, kontakta microarrayers21,22,23,24,25, 26 eller de kan själv montera på ytor såsom superhydrophillic ställen mönstrade på en superhydrofobt yta. 27 , 28 , 29
Med dessa i åtanke utformades adresserbara Droplet Microarrays (ADMs) för att kombinera mångsidighet, fysisk adressering och minskade volymer av droplet microarrays med känsligheten hos enda molekyl Frida mikroskopi att kvantitativt mäta protein överflöd. 5 ADMs aktivera enda cell analys bildar en droplet microarray som innehåller enstaka celler över en antikropp microarray, som sedan är utjämnat med olja för att förhindra avdunstning. Volymerna av dropparna är diskret att förhindra prov förlust, som annars skulle uppnås genom på-chip ventilsystem i kontinuerligt flöde mikrofluidik. 30 den absoluta mängden målprotein från en enda cell är extremt liten; dock ger minskade volymen av droppar relativt hög lokal koncentration så att de upptäcks med en smörgås antikropp-analys - antikropp är orörlig i en särskild region, eller plats, på en yta som fångar protein vilket i sin tur binder till en fluorescently märkt detektionsantikropp närvarande i droplet volymen. Som en etikett-gratis strategi (dvs protein mål inte behöver märkas direkt), ADMs är allmänt tillämpliga på analysera celler från primära källor, såsom bearbetade blod behöver bra enkelarmade och dissocierade tumör biopsier, samt celler från kultur och deras lysates.
Mäta variationen i protein överflöd över en cell befolkningen är viktigt för att bestämma heterogeniteteten som svar, till exempel en drog och hjälper att ge inblick i cellulära funktioner och vägar, bedömning av subpopulationer och deras beteende samt identifiera sällsynta händelser som annars skulle maskeras av bulk metoder. Detta protokoll beskriver hur att producera och använda adresserbara droplet microarrays kvantitativt bestämma överflödet av de transkription faktorn p53 i mänskliga cancerceller och kan användas för att undersöka betydelsen av p53 svar på cellgifter. Målproteinet bestäms genom valet av avskiljning och identifiering av antikroppar och kan ändras för att omfatta mer eller olika mål. Instruktioner finns för att bygga en enkel apparater försedda med ett koncentriskt munstycke från allmänna lab förbrukningsartiklar till manuellt array 10 nL droppar utjämnade med olja. Full experimentella processen beskrivs whereby varje droppe laddas sedan med en enda cell, som sedan är lyserat och uttrycket av protein bestäms med enda molekyl upplösning med Frida mikroskopi.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>S0115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>SIAL0639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcontact Arrayer</td>
			<td>DigiLab, UK</td>
			<td>OmniGrid Micro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcontact pin</td>
			<td>ArrayIt, USA</td>
			<td>946MP2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips (Nexterion)</td>
			<td>Schott, Europe</td>
			<td>1098523</td>
			<td>Size (mm): 65.0 x 25.0; Thickness (mm) 0.17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p53 capture antibody</td>
			<td>Enzo</td>
			<td>ADI-960-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p53 detection antibody, Alexa Fluor 488 labelled</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-126</td>
			<td>stock concentration 200&#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline-sodium citrate buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15557-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betaine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>61962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 well plate (low volume)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS4511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen gas cylinder</td>
			<td>BOC</td>
			<td>Industrial grade, oxygen-free</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplets</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Patchman NP2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Microinjector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>CellTram Vario</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td>Origio, Denmark</td>
			<td>MBB-FP-L-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pumps</td>
			<td>KD Scientific</td>
			<td>KDS-210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;L syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81020</td>
			<td>Gas tight, PTFE Luer lock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81327</td>
			<td>Gas tight, PTFE Luer lock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone isolator</td>
			<td>Grace Bio-Labs</td>
			<td>JTR24R-A-0.5</td>
			<td>6x4 well silicone isolator with adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser cutter</td>
			<td>VersaLASE</td>
			<td>VLS2.30 CO2 Laser 3W</td>
			<td>for laser cutting of custom isolators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1mm thick acrylic sheet</td>
			<td>Weatherall-UK</td>
			<td>Clarex Precision Sheet 001</td>
			<td>for laser cutting of custom isolators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive sheet</td>
			<td>3M</td>
			<td></td>
			<td>used to adhere custom isolators to microarrayed coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super glue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>LOCPFG3T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 &#956;m ID/360 &#956;m OD fused silica tubing</td>
			<td>IDEX</td>
			<td>FS-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 mm ID/1/16&#8221; OD PFA tubing</td>
			<td>IDEX</td>
			<td>1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.014&#8221; ID/0.062&#8221; OD PTFE tubing</td>
			<td>Kinesis</td>
			<td>008T16-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 mm ID/2.0 mm OD FEP tubing</td>
			<td>IDEX</td>
			<td>1673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumen (BSA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9700100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-pure water</td>
			<td>Millipore, Germany</td>
			<td>MilliQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy &#38; Optics</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIRF microscope with encoded XY stage</td>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td>Nikon Ti-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM-CCD</td>
			<td>Andor Technologies, Ireland</td>
			<td>IXON DU-897E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser excitation source</td>
			<td>Vortran, USA</td>
			<td>Stradus 488-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical lysis laser source</td>
			<td>Continuum, USA</td>
			<td>Surelite SLI-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope filter cube for TIRF</td>
			<td>Chroma, USA</td>
			<td>z488bp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope filter cube for Optical Lysis</td>
			<td>Laser 2000, UK</td>
			<td>LPD01-532R-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>Open Source</td>
			<td></td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>version 7.14 or higher</td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

counting proteins in single cells with addressable droplet microarrays

Ofta cellulära beteende och cellulära svar analyseras på populationsnivå där svaren från många celler sammanförs tillsammans som ett Snittresultat maskering rik enskild cell beteendet inom en komplex befolkning. Enstaka cell protein detektering och kvantifiering tekniker har gjort en anmärkningsvärd effekt under de senaste åren. Här beskriver vi en praktisk och flexibel enda cell analysplattform baserad på adresserbara droplet microarrays. Denna studie beskriver hur absoluta kopia antalet målproteiner kan mätas med enstaka cell upplösning. Den tumör suppressor p53 är den vanligaste muterade genen i human cancer, med mer än 50% av totala cancerfall som uppvisar ett mönster med icke-friska p53 i uttryck. Protokollet beskrivs stegen för att skapa 10 nL droppar som enda mänskliga cancerceller är isolerade och kopia antalet p53 protein mäts med enda molekyl upplösning att exakt bestämma variabiliteten i uttryck. Metoden kan tillämpas på vilken celltyp inklusive primära material för att bestämma absoluta kopia antalet någon målproteiner sevärdheter.

Absoluta basala protein kopia antalet p53 bestämdes med enstaka cell upplösning i en mänsklig kolon cancer cellinje, BE celler. Vi visar hur p53 uttryck kan variera över flera tiopotenser och visar ett svagt positivt samband mellan cell storlek och protein kopienumret inom vilande BE cell befolkningen.
Adresserbara Droplet Microarrays bildas när vatten droppar är expedieras på antikropp spot platser och utjämnade med olj...

Watch this Scientific Journal Video about Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays at JoVE.com

Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

Här presenterar vi adresserbara droplet microarrays (ADMs), en droplet matris baserat metod kunna avgöra absoluta protein överflöd i enstaka celler. Vi visar ADMs förmåga att karakterisera heterogenitet i uttryck av den tumör suppressor proteinet p53 i en human cancer cellinje.

Räknar protein i enstaka celler med adresserbara Droplet Microarrays

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells

Tillämpning av Laser mikro-bestrålning för undersökning av singel och dubbel Strand paus reparation i däggdjursceller

Highly coordinated DNA repair pathways exist to detect, excise and replace damaged DNA bases, and coordinate repair of DNA strand breaks. While molecular ...

Desthiobiotin-Streptavidin-Affinity Mediated Purification of RNA-Interacting Proteins in Mesothelioma Cells

Desthiobiotin-streptividin-affinitet medierad rening av RNA-interagera proteiner i mesoteliom celler

The in vitro RNA-pulldown is still largely used in the first steps of protocols aimed at identifying RNA-binding proteins that recognize specific RNA ...

Phospho Flow Cytometry with Fluorescent Cell Barcoding for Single Cell Signaling Analysis and Biomarker Discovery

Phospho flödescytometri med fluorescerande Cell streckkodning för enstaka Cell signalering analys och biomarkör identifiering

Aberrant cell signaling plays a central role in cancer development and progression. Most novel targeted therapies are indeed directed at proteins and ...

Using Microarrays to Interrogate Microenvironmental Impact on Cellular Phenotypes in Cancer

Använda Microarrays att förhöra mikromiljö påverkan på cellulära fenotyper i cancer

Understanding the impact of the microenvironment on the phenotype of cells is a difficult problem due to the complex mixture of both soluble growth ...

An Orthotopic Endometrial Cancer Model with Retroperitoneal Lymphadenopathy Made From In Vivo Propagated and Cultured VX2 Cells

En ortotopisk endometriecancer modell med retroperitoneal lymfadenopati tillverkad av in vivo propagerade och odlade VX2 celler

Endometrial cancer is the most common gynecologic malignancy in North America and the incidence is rising worldwide. Treatment consists of surgery with or ...

Droplet Digital TRAP (ddTRAP): Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

Droplet Digital TRAP ddTRAP: Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

Droplet Digital TRAP (ddTRAP): anpassning av telomere upprepa amplifiering protokoll till droplet Digital polymerase kedje reaktion

The telomere repeat amplification protocol (TRAP) is the most widely used assay to detect telomerase activity within a given a sample. The polymerase ...

In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish

In Vivo Targeting av Xenografted Human Cancer Cells med functionalized Fluorescent Silica Nanopartiklar i Zebrafish

Developing nanoparticles capable of detecting, targeting, and destroying cancer cells is of great interest in the field of nanomedicine. In vivo animal ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

In Vitro Utvärdering av Oncogenic Transformation i mänskliga mammary Epitelial celler

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Multiparametric Tumor Organoid Drug Screening Using Widefield Live-Cell Imaging for Bulk and Single-Organoid Analysis

Multiparametrisk tumörorganoid läkemedelsscreening med hjälp av Widefield Live-Cell Imaging för bulk- och enorganoidanalys

Patient-derived tumor organoids (PDTOs) hold great promise for preclinical and translational research and predicting the patient therapy response from ex ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

Ortotopisk implantation av patienthärledda cancerceller hos möss rekapitulerar avancerad kolorektal cancer

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...