Name: correlative super-resolution and electron microscopy to resolve protein localization in zebrafish retina
Uploaded: 2017-11-10T12:30:00
Duration: 12 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina at JoVE.com

التمويل أيون و RGB: منح العلوم الوطنية السويسرية مؤسسة أمبيزيوني نقاط PZ00P3 142404/1 و PZ00P3 163979.

جميع التجارب التي أجريت وفقا "بيان آرفو" "استخدام الحيوانات" في أوفثالميك وأبحاث الرؤية ووافقت عليها السلطات المحلية-
 1. "إعداد المقاطع سامسونج" على "رقائق السليكون" تثبيت عينة <ol><li><ol><li>إعداد الحل مثبت يحتوي على 0.1% جلوتارالديهيدي، 4% فورمالدهايد في المخزن المؤقت كاكوديلاتي 0.1 م. 
		ملاحظة: تنبيه! توخي الحذر عند العمل مع المخزن المؤقت glutaraldehyde، والفورمالديهايد، وكاكوديلاتي، وارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة والعمل في غطاء دخان.</li>
		<li>Euthanize 5 أيام بعد الإخصاب اليرقات الزرد (5 إدارة الشرطة الاتحادية) مع تريكيني (إيثيل 3-أمينوبينزواتي ميثانيسولفوناتي، 0.4% w/v في برنامج تلفزيوني (الفوسفات المخزن المؤقت المالحة، pH 7)) كما هو موضح سابقا 15-</li>
		فيكس <li>اليرقات بالانغماس في الحل مثبت مسبقاً مبردة على الثلج. قم بإزالة الرأس واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع هزاز لطيف.</li>
		تشريح <li>العينين بقطع الأنسجة حول العين باستخدام الملقط غرامة ومشرط ميكروديسيكشن (تحت مجهر) في برود الحل مثبت على لوحة أسرة [اغروس] 1%. نقل العينين إلى أنبوب مع مثبت مسبقاً المبردة الطازجة.</li>
		<li>تغسل مرتين في برنامج تلفزيوني (الفوسفات المخزن المؤقت المالحة، درجة الحموضة 7.4) لمدة 5 دقائق كل يغسل في درجة حرارة الغرفة (RT).</li>
	</ol></li> <li>تسلل الجيلاتين وتصاعد <ol><li>الاحماء 15 مل الأغذية المحلية ماركة الجيلاتين 12% w/v في الجريدة الرسمية (العازلة الفوسفات، 0.1 M درجة الحموضة 7.4) في 40 ° C. إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة حل الجيلاتين بالأنابيب التي تحتوي على العيون. اضغط على أنبوب بلطف لضمان تتسرب الجيلاتين العينة واحتضان لمدة 10-30 دقيقة عند 40 درجة مئوية في ثيرموبلوك مع الهز لطيف أو في حمام مائي.</li>
		السليكون <li>ملء 12 مم × 5 مم × 3 مم أو البولي إثيلين شقة تضمين قوالب مع الجيلاتين الدافئ في حمام مائي 40 درجة مئوية. إضافة عيون اثنين كل قالب باستخدام ماصة محاذاتها بشكل صحيح تحت مجهر استخدام إبرة تشريح واسمحوا الجيلاتين يبرد في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة وتتصلب عند 4 درجة مئوية عن 20 دقيقة</li>
		<li>إعادة تقليم كتلة الجيلاتين تحت مجهر لتناسب عين واحدة كل كتلة باستخدام شفرة حلاقة.</li>
		نقل <li>عيون الجيلاتين مضمن إلى 2.3 متر السكروز في الجريدة الرسمية على الجليد. احتضان عند 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.</li>
		<li>تبادل جديد محلول السكروز 2.3 متر ومخزن في 4 درجات مئوية أو-20 درجة مئوية؛ وبعد هذه الخطوة، مستعدون لتقطيع عينات أو يمكن تخزينها في-20 درجة مئوية لعدة أسابيع إلى أشهر.</li>
		إعادة تقليم <li>كتلة الجيلاتين تقريبا حجم العين قبل نقل للبرد-pin. التجميد في النيتروجين السائل ونقل إلى cryo-أولتراميكروتومي-</li>
	</ol></li> <li>كريوسيكتيونينج <ol><li>110 قطع نانومتر سميكة-المقاطع في-120 درجة مئوية بسكين الماس في cryo-أولتراميكروتومي-</li>
		<li>اختيار الأقسام مع حلقة سلكية التي تتضمن معالجة تجميعية methylcellulose 2% (في المياه) ومحلول السكروز 2.3 متر (1:1). نقل المقاطع إلى رقاقة سيليكون 7 ملم × 7 ملم. تخزين المقاطع في 4 درجات مئوية حتى مزيد من المعالجة.</li>
	</ol></li></ol> 2. إيمونولابيلينج <ol><li>المياه والصرف الصحي ويفر مع برنامج تلفزيوني في 0 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة في أربع قطرات بوضع الرقائق رأسا على القطرات. أغسل في برنامج تلفزيوني 2 × 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة-</li>
	<li>احتضان 3 مرات في جليكاين 0.15% في برنامج تلفزيوني، لكل 1 دقيقة. أغسل x 3 ل 1 دقيقة/يغسل مع برنامج تلفزيوني. قبل إينكوباتي مع PBG (برنامج تلفزيوني مع جيش صرب البوسنة ألبومين المصل البقري 0.5% و 0.2 ٪ الجيلاتين نوع ب) للحد الأدنى 5</li>
	<li>إينكوباتي مع أرنب المضادة-Tom20 (انظر الجدول للمواد) في PBG (4 ميكروغرام/مل) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة-</li>
	أغسل <li>x 6 ل 1 دقيقة/يغسل في PBG. قبل إينكوباتي مع PBG لمدة 5 دقائق في الرايت إينكوباتي مع أرنب المضادة F(ab&#39;) 647 أليكسا 2 (انظر الجدول للمواد) في PBG (7.5 ميكروغرام/مل) للحد الأدنى 30</li>
	أغسل <li>x 6 ل 1 دقيقة/يغسل في PBG. أغسل 3 × 2 دقيقة في برنامج تلفزيوني. احتضان مع DAPI (4 ميكروغرام/مل) في برنامج تلفزيوني لمدة 10 س. يغسل 2 × 2 دقيقة في برنامج تلفزيوني.</li>
</ol> 3. مجهرية فائقة القرار <ol><li>إينكوباتي ويفر بإيجاز (10 ق) قبل وضعه على معالجة تجميعية لحل 1:1 من الجلسرين (80%)، والتصوير مخزن يحتوي على أكسجين مسح النظام (200 ملم الفوسفات مخزن يحتوي على الجلوكوز 10 ٪، 0.5 ملغ/مل جلوكوسيوكسيداسي، 40 ميكروغرام/مل الكاتالاز، 15 ملم بيتا-ميركابتوثيلاميني هيدروكلوريد (شركة طيران الشرق الأوسط HCL)، الرقم الهيدروجيني 8.0).</li>
	<li>نقل الرقائق (الباب إلى الأسفل) إلى طبق بتري (سمك 170 ± 5 ميكرومتر) أسفل زجاج على قطره جديدة من 1:1 خليط من الجلسرين (80 في المائة) والتصوير المخزن المؤقت (كما هو الحال في الخطوة 3، 1)-</li>
	إزالة <li>من جميع الأطراف، مع ماصة، معظم السائل تحت يفر. استخدم شرائط السيليكون لإصلاح يفر إلى الجزء السفلي من صحن بيتري. 
	ملاحظة: شرائط السيليكون مصنوعة من السيليكون المكون الثاني-الغراء (3 ملم × 12 ملم)-</li>
	أقسام <li>الصورة في مجهر مقلوب استخدام فتحه عددية عالية (مثلاً 160 X/1.43 غ؛ انظر الجدول للمواد) زيت الغمر القرار سوبر الهدف مكرسة. قبل التصوير، واسمحوا العينة حجته إلى درجة حرارة المجهر بغية التقليل إلى الحد الأدنى/الحد من الانجراف الأفقي والمحوري.</li>
	<li>مركز مجال الاهتمام والحصول على الصور مرجع ابيفلوريسسينسي ويديفيلد الأولى. تغيير وضع عملية القرار سوبر. ضبط وقت التعرض للكاميرا إلى 15 مللي ثانية وتعيين الإلكترون ضرب مكسب (م) إلى الحد أقصى 300-</li>
	<li>تضيء العينة مع 642 نانومتر الليزر موجات مستمرة في طاقة الليزر الحد الأقصى (يقابل ~2.8 كيلو واط/سم 2) في وضع ابيفلوريسسينسي. يتم فصل أقرب جزيء واحد يومض في كل إطار، جيدا حيث أن الاحتمال ضعيف أن الإشارات الفردية التداخل، تعيين قوة الليزر إلى ~0.7 كيلو واط/سم 2. سجل في الصورة الخام في وضع ابيفلوريسسينسي بالحصول على الحد ني إطارات 30,000. 
	ملاحظة: جميع هذه المعلمة يمكن أن تختلف تبعاً للعينات المختلفة وتصنيف الكثافات.</li>
	<li>من البيانات الخام، وإنشاء قائمة أحداث تعمير (تعريب كل غمضة جزيء واحد في الصورة الخام) باستخدام عتبة كشف من 30 الفوتونات (يحتاج تعديلها وفقا للعينة) بواسطة النقر فوق &#34; تقييم &#34; في &#39; تي سلسلة تحليل &#39; تحت &#39; أدوات &#39;-</li>
	<li>تصور صورة ذات دقة فائقة بتركيب غاوسي 16 تطبيق حجم بكسل تقديم من 4 شمال البحر الأبيض المتوسط عن طريق النقر فوق &#34; "إنشاء صورة" &#34; في &#39; الحدث قائمة تجهيز الفريق &#39; تحت &#39; أدوات. &#39; 
	ملاحظة: لتوليد صورة فائقة حل استخدمت أدوات البرمجيات المتكاملة للنظام المستخدم في هذه الدراسة. ومع ذلك، تصوير وصف القرار سوبر يمكن أداؤها في أي نظام آخر في الترجمة على أساس جزيء واحد، ويمكن معالجة البيانات باستخدام أدوات البرمجيات المفتوحة المصدر كعاصفة رعدية 17-</li>
</ol> 4. Shadowing البلاتين <ol><li>إزالة السليكون المشارب وإضافة قطره من برنامج تلفزيوني قريبة من حواف يفر أرفع من طبق بيتري. أغسل يفر 2 × 2 دقيقة في برنامج تلفزيوني، ثم بعد إصلاحه مع جلوتارالديهيدي 0.1% في برنامج تلفزيوني للحد الأدنى 5 يغسل x 2 ل 2 دقيقة/يغسل في برنامج تلفزيوني.</li>
	<li>احتضان يفر مرتين ل 5 دقيقة/حضانة في قطره 1 ميثيلسيلولوسي 2% في المياه على الجليد. إدراج يفر في أنبوب الطرد والطرد المركزي في 14,100 س ز 90 جبل س. في كعب روتين ألومنيوم SEM مع إجراء الأسمنت الكربون.</li>
	<li>إضافة طبقة من 2 إلى 10 نانومتر من البلاتين/الكربون في العينة بالتظليل الروتاري في 8° استخدام إلكترون شعاع إعدادات الجهاز التبخر: 1.55 كيلوفولت، 55 mA، 0.3 نانومتر/s، وزاوية مقدارها 8 درجة، تناوب المستوى 4.</li>
</ol> 5. المسح الضوئي المجهر الإلكتروني <ol><li>أقسام الصورة مع المسح الإلكترون mإيكروسكوبي 1.5 كيلو فولت، 2 مم تعمل عن بعد ومع In عدسة كاشف الإلكترونات الثانوية-</li>
</ol> 6. المحاذاة من الضوء وصور المجهر الإلكتروني <ol><li>فتح كل أنواع الصور مع فيجي 18 بواسطة النقر فوق &#34; الملف | فتح &#34;. ضبط حجم قماش بواسطة النقر فوق &#34; صورة | ضبط | قماش حجم &#34; وجلب كل الصور إلى كدسة بالنقر فوق &#34; صورة | مكدسات | الصور إلى كومة &#34;. حفظ المكدس كنوع ملف tiff.</li>
	افتح <li>"في فيجي"، واجهة 19 TrackEM2 جديدة بواسطة النقر فوق &#34; الملف | جديد | TrackEM2 (جديد) &#34;. استيراد المكدس مع كل الصور بالنقر على الحق في النافذة السوداء وتحديد &#34; المكدس استيراد &#34;-</li>
	صورة مجهرية <li>الضوء محاذاة صورة الميكروسكوب الإلكتروني يدوياً مع المعالم باستخدام نقر بماوس الأيمن على الصورة واختيار &#34; محاذاة | قم بمحاذاة طبقة يدوياً مع المعالم &#34;.
	أداة <ol><li>بيك حدد (السهم الأسود) لإضافة المعالم. استخدم شكل نويات كمرجع لتحديد حواف نفسها في كلا الصورتين (تكميلية الشكل 1). إضافة عدة نقاط (الحد الأدنى ثلاث نقاط بحاجة إلى تحديد). تطبيق المحاذاة مع طراز أفيني بالماوس الأيمن النقر، وتحديد &#34; تطبيق تحويل | نموذج أفيني &#34;.</li>
	</ol></li> <li>تغيير طبقة الشفافية (انظر التكميلية الرقم 1) لتقييم نوعية المحاذاة.</li></ol>

<ol>
	<li>Hauser, M., Wojcik, M., Kim, D., Mahmoudi, M., Li, W., Xu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+Super-Resolution+Microscopy:+New+Dimensions+and+New+Opportunities.">Correlative Super-Resolution Microscopy: New Dimensions and New Opportunities.</a> Chem Rev. , (2017).</li><li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging.">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).</li><li>F&#246;lling, J., Bossi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+nanoscopy+by+ground-state+depletion+and+single-molecule+return.">Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return.</a> Nat Methods. 5 (11), 943-945 (2008).</li><li>Betzig, E., Patterson, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science (New York, N.Y.). 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Kopek, B. G., Shtengel, G., Grimm, J. B., Clayton, D. A., Hess, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+photoactivated+localization+and+scanning+electron+microscopy.">Correlative photoactivated localization and scanning electron microscopy.</a> PLOS one. 8 (10), e77209 (2013).</li><li>Paez-Segala, M. G., Sun, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation-resistant+photoactivatable+fluorescent+proteins+for+CLEM.">Fixation-resistant photoactivatable fluorescent proteins for CLEM.</a> Nat Methods. 12 (3), 215-218 (2015).</li><li>Narayan, K., Subramaniam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ion+beams+in+biology.">Focused ion beams in biology.</a> Nat Methods. 12 (11), 1021-1031 (2015).</li><li>Tokuyasu, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunochemistry+on+ultrathin+frozen+sections.">Immunochemistry on ultrathin frozen sections.</a> Histochem J. 12 (4), 381-403 (1980).</li><li>Suleiman, H., Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+protein+architecture+of+the+kidney+glomerular+basement+membrane.">Nanoscale protein architecture of the kidney glomerular basement membrane.</a> eLife. 2, e01149 (2013).</li><li>Kopek, B. G., Shtengel, G., Xu, C. S., Clayton, D. A., Hess, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+3D+superresolution+fluorescence+and+electron+microscopy+reveal+the+relationship+of+mitochondrial+nucleoids+to+membranes.">Correlative 3D superresolution fluorescence and electron microscopy reveal the relationship of mitochondrial nucleoids to membranes.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 109 (16), 6136-6141 (2012).</li><li>Avanesov, A., Malicki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+retina+in+the+zebrafish+model.">Analysis of the retina in the zebrafish model.</a> Methods Cell Biol. 100, 153-204 (2010).</li><li>Bachmann-Gagescu, R., Phelps, I. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ciliopathy+gene+cc2d2a+controls+zebrafish+photoreceptor+outer+segment+development+through+a+role+in+Rab8-dependent+vesicle+trafficking.">The ciliopathy gene cc2d2a controls zebrafish photoreceptor outer segment development through a role in Rab8-dependent vesicle trafficking.</a> Hum Mol Gen. 20 (20), 4041-4055 (2011).</li><li>Bachmann-Gagescu, R., Dona, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ciliopathy+Protein+CC2D2A+Associates+with+NINL+and+Functions+in+RAB8-MICAL3-Regulated+Vesicle+Trafficking.">The Ciliopathy Protein CC2D2A Associates with NINL and Functions in RAB8-MICAL3-Regulated Vesicle Trafficking.</a> PLOS Gen. 11 (10), e1005575 (2015).</li><li>Mateos, J. M., Guhl, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographic+contrast+of+ultrathin+cryo-sections+for+correlative+super-resolution+light+and+electron+microscopy.">Topographic contrast of ultrathin cryo-sections for correlative super-resolution light and electron microscopy.</a> Sci Rep. 6, 34062 (2016).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+nanometer+localization+analysis+for+individual+fluorescent+probes.">Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes.</a> Biophys J. 82 (5), 2775-2783 (2002).</li><li>Ovesn&#253;, M., K&#345;&#237;&#382;ek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ThunderSTORM:+a+comprehensive+ImageJ+plug-in+for+PALM+and+STORM+data+analysis+and+super-resolution+imaging.">ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging.</a> Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).</li><li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Cardona, A., Saalfeld, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrakEM2+software+for+neural+circuit+reconstruction.">TrakEM2 software for neural circuit reconstruction.</a> PLOS one. 7 (6), e38011 (2012).</li><li>Wurm, C. A., Neumann, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+distribution+of+mitochondrial+import+receptor+Tom20+is+adjusted+to+cellular+conditions+and+exhibits+an+inner-cellular+gradient.">Nanoscale distribution of mitochondrial import receptor Tom20 is adjusted to cellular conditions and exhibits an inner-cellular gradient.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 108 (33), 13546-13551 (2011).</li><li>Slot, J. W., Geuze, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryosectioning+and+immunolabeling.">Cryosectioning and immunolabeling.</a> Nat Prot. 2 (10), 2480-2491 (2007).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

يجمع هذا الأسلوب التعريب البروتين تحل فائقة مع معلومات سياق لتحديد الموضع الدقيق من البروتينات في عضية. علينا أن نظهر هنا انتهاء التجربة إلى تصور التعبير عن Tom20 في الغشاء الخارجي من الميتوكوندريا، وعلاقتها بغيرها العضيات مثل نوى أو شرائح الخارجي لمستقبله في الشبكية الزرد اليرقات.
توكوياسو البرد تمزيقها يتطلب بعض التدريب اكتساب المقاطع يتم الحفاظ عليها جيدا. ومع ذلك، هذا أسلوب المستخدمة في العديد من المختبرات مع إثبات النجاح21. نقل المقاطع إلى رقاقة السيليكون بسيط جداً وهناك حاجة إلى لا اعتبارات خاصة. استخدام الجلسرين في المخزن المؤقت للتصوير خطوة حاسمة جداً لتجنب تجفيف الأقسام. لتصوير فائقة القرار يتم الحصول على أفضل النتائج عند الرقاقة قريبة جداً من أسفل الزجاج طبق بيتري. المشارب سيليكون تساعد على الحفاظ على يفر في هذا الموقف. الرعاية الخاصة التي يجب اتخاذها أثناء إزالة المشارب تفاديا لإلحاق أضرار في بعض المقاطع.
سمك cryo-الفروع، حوالي 100 نانومتر، أرق من الدقة البصرية في Z-البعد، بالإضافة إلى ذلك يسهل دقة هذا الأسلوب ستتحقق كما إشارة مجهرية فائقة القرار قادم من هذا طبقة رقيقة فقط يتم عرض إشارة المسح الإلكتروني المجهري طبوغرافية العينة. يمكن أيضا الجمع بين هذه الطريقة تصوير متعدد الألوان. ومع ذلك، يجب إيلاء عناية خاصة أن العينة يمكن تصويرها تحت نفس الظروف (مثلاً التصوير العازلة) وينبغي منع التحدث عبر.
واحد الحد من الأسلوب هو اثنين الأبعاد النهج، حيث يمكن جمعها بعدد محدود فقط من مقاطع المسلسل (حوالي 3 إلى 7 كل رقاقة). وهكذا، مشاريع تتناول تحليل وحدة التخزين لن يكون مثاليا. ومع ذلك، هو أسلوب التي يمكن تطبيقها على الكشف عن البروتين التعبير في أي نوع من الأنسجة بتقطيع بسيط للعينة. نحن نقدم طريقة دون استخدام عوامل التباين الكلاسيكية مثل سترات الرصاص أو خلات اليورانيل. على النقيض من التظليل البلاتين يوفر التباين الطبوغرافية مفيدة للغاية، ولكن في بعض الحالات يصعب أغشية من حلها. وهذا قد يثير مشاكل للمشاريع التي تحتاج، على سبيل المثال، لتحديد التعبير عن البروتينات في حويصلات صغيرة.
لدينا البروتوكول، على أساس cryo توكوياسو-أقسام، يستخدم المعدات القياسية للحصول على النتائج ستتحقق من القرار فائقة ومجاهر المسح الإلكترون. مجموعة المقاطع على رقائق السيليكون واستخدام البلاتين للتباين خطوات بسيطة لتوفير الاستقرار وإمكانية تكرار نتائج لإعداد نموذج.

أساليب لتحديد الترجمة سوبسيلولار للبروتينات وعلاقتها بالأقسام المختلفة للخلية أدوات أساسية لفهم الوظائف والتفاعلات المحتملة. مجهرية فائقة القرار في تركيبة مع الميكروسكوب الإلكتروني يوفر هذه المعلومات1. أرض الدولة نضوب مجهرية تليها عودة جزيء فردية (جسديم) هو تقنية مجهرية فائقة قرار متوافقة مع مجموعة واسعة من فلوروفوريس العضوية ومُرمّز وراثيا2 ويحقق قرارا أفقي بما يصل إلى 20 nm 3-إدماج أساليب مع دقة أعلى من معيار حيود محدودة مجهرية يحسن دقة5،،من4الارتباط6. ينصح من أجل تحقيق ترابط أفضل من تعبير البروتين مع حجرة سوبسيلولار محددة وتقليص حجم عدم اليقين7 استخدام نفس المقطع سامسونج للضوء والمجهر الإلكتروني. بين أساليب تقطيع مختلفة، توكوياسو البرد-قسم البروتوكول لا يتطلب الجفاف أو الراتنج التضمين، بالإضافة إلى ذلك، يحافظ على أنتيجينيسيتي من كثير من [ابيتوبس] ويوفر الأنسجة جيدة أولتراستروكتوري8. وقد أثبتت عدة طرق انطباق هذه الأقسام في ضوء الارتباطية والمجهر الإلكتروني (كليم)4،5،،من910.
الشبكية الزرد نموذجا قيماً لدراسة التنمية البصرية وآليات المرض البشري نظراً لهيكلها عاليا المصانة ووظيفة عبر الفقاريات. في عرض فوتوريسيبتورس الشبكية وخاصة نفس بنية ك photoreceptors الثدييات، مع المشبك القاعدية، نواة أبيكو بأسالي ممدود، تجميع الميتوكوندريا في الجزء الداخلي قمي أكثر وجزء خارجي يتكون من الغشاء الأقراص في موقف آخر قمي11. الترجمة البروتين إلى المقصورات الخلوية المتنوعة المصانة بين الزرد والبشرية، مما يتيح تحقيق الوظيفة البيولوجية للبروتينات ذات الصلة بالمرض البشري12،13.
نقدم هنا بروتوكولا لإعداد اليرقات الزرد عينات الشبكية لحل تعريب البروتين المتقدرية الغشاء الخارجي Tom20 بالقرار فائقة الارتباطية الضوء والمجهر الإلكتروني. الأسلوب الذي يستند إلى جمع المقاطع البرد على رقائق السيليكون والحصول على تباين المعلومات الطوبوغرافية التي أنتجت بعد تطبيق طبقة رقيقة من البلاتين. هذه الخطوات تحسينات فنية واضحة من حيث سهولة الاستخدام وإمكانية تكرار نتائج، والوقت لإكمال التجارب. قد أظهرنا مؤخرا إمكانية تطبيق أسلوب للكشف عن المسام النووية والبروتينات المتقدرية في الماوس الأنسجة14.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde EM Grade</td>
			<td>EMS, USA</td>
			<td>#16220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cacodylate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#8.20670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#886-86-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose, peqGOLD Universal</td>
			<td>VWR International GmbH</td>
			<td>35-1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat embedding molds</td>
			<td>BEEM Flat</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Local food brand gelatin</td>
			<td>Dr.Oetker</td>
			<td>Extra Gold</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#1.07687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#M-6385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#G-7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin type B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#G-6650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>#A6588.0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Si-Mat Silicon Materials</td>
			<td></td>
			<td>Type: P/Boron; Orientation &#60;111&#62; ON; Growth method: CZ; Resistivity:1-30 ohm/cm; Surface: polished; Laser cut at 7 x7 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-pin</td>
			<td>Baltic Preparation</td>
			<td>#16701950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wired loop &#34;Perfect loop&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone stripes</td>
			<td>Picodent</td>
			<td>Twinsil 22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucoseoxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#G7141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>catalase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#C40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beta-Mercaptoethylamine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#M6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Tom20</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>#sc - 11415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 647 AffiniPure F(ab&#39;)2 fragment donkey anti rabbit IgG</td>
			<td>Jackson Immuno-Research</td>
			<td>#711-606-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ROCHE, Switzerland</td>
			<td>#10236276001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#49782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom petri dish</td>
			<td>Ibidi, Germany</td>
			<td>u-Dish 35mm, high glass bottom, #81158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEM aluminium stub</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>#G301F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conducting carbon cement Leit-C</td>
			<td>Plano, Germany</td>
			<td>AG3300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond Knife (Cryo Immuno)</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>DCIMM3520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-ultramicrotome</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Leica EM FCS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield-TIRF microscope GSD Leica SR GSD 3D</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>160x 1.43 TIRF objective</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>11523048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEM - Zeiss Supra 50 VP</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Supra 50 VP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIB-SEM - Zeiss Auriga 40</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Auriga 40</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

correlative super-resolution and electron microscopy to resolve protein localization in zebrafish retina

نحن نقدم طريقة للتحقيق التعريب سوبسيلولار البروتين في الشبكية الزرد اليرقات بالجمع بين القرار سوبر الخفيفة الميكروسكوب وفحص المجهر الإلكتروني. قدرات القرار الحد حيود الفرعية مجاهر الخفيفة فائقة القرار السماح بتحسين دقة البيانات المرتبطة. بإيجاز، 110 نانومتر سميكة البرد، أقسام يتم نقلها إلى رقاقة سيليكون، وبعد الفلورة تلطيخ، يتم تصويرها بالقرار سوبر الخفيفة الميكروسكوب. وفي وقت لاحق، يتم الحفاظ على المقاطع في ميثيلسيلولوسي والبلاتين مظلل قبل التصوير في المسح الإلكتروني المجهري (SEM). يتم دمج الصور من هذه الطرائق مجهرية اثنين بسهولة باستخدام معالم النسيج مع برمجيات المصدر المفتوح. هنا يصف لنا طريقة تكيف الشبكية الزرد اليرقات. ومع ذلك، هذا الأسلوب ينطبق أيضا على أنواع أخرى من الأنسجة والكائنات الحية. ونحن تبين أن المعلومات التكميلية التي حصلت عليها هذه العلاقة قادراً على حل تعبير البروتينات المتقدرية في علاقة مع الأغشية وكريستاي الميتوكوندريا، وكذلك فيما يتعلق بالأقسام الأخرى من الخلية.

التعبير عن البروتين Tom20، وحدة فرعية من ترانسلوكاسي الغشاء الخارجي المتقدرية معقدة من20، مصممة، في أقسام رقيقة من الزرد اليرقات الشبكية، بقرار سوبر الخفيفة الميكروسكوب (الشكل 1)، وهذه المعلومات كان ويكمل مع الإشارات الطوبوغرافية التي تم الحصول عليها عن طريق مسح المجهر الإلكتروني بعد التظليل البلاتين من نفس المقاطع. هذه البيانات الارتباطية تأكيد التعريب من البروتين في الرابطة مع حجرة خاصة، الغشاء الخارجي المتقدرية، وعلاوة على ذلك توفر معلومات حول العلاقة بين البروتين مع العضيات الأخرى للخلية.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56113/56113fig1.jpg"> 
رقم 1: كليم في الشبكية الزرد. ألف صورة ويديفيلد التكبير المنخفض قسم الشبكية الزرد 5 إدارة الشرطة الاتحادية، نوى ملطخة DAPI (السماوي). ب فحص المجهر الإلكتروني من نفس المنطقة. جيم أعلى الصورة ويديفيلد التكبير للإطار في "نويات باء" ملطخة DAPI (سماوي) وتلطيخ المتقدرية Tom20 يظهر باللون الأحمر. دال صورة ويديفيلد من نفس الفرع في أعلى التكبير. النمط التعبير Tom20 في مجموعات الميتوكوندريا. هاء التعبير من Tom20 (نقاط حمراء) الكشف عنها بواسطة الفحص المجهري جسديم. الملون الأنوية مع DAPI (السماوي). واو نفس القسم هاء الجمع بين قرار فائقة الارتباطية والمسح الضوئي المجهر الإلكتروني. تلوين Tom20 (نقاط حمراء) يظهر في الكتلة المتقدرية (M) في أغشية الميتوكوندريا الخارجي. إشارة DAPI الأسفار في النوى (ن) يتوافق مع طبوغرافية الصورة SEM. ز-صورة عالية التكبير من الإطار في واو. مسح الصورة الميكروسكوب الإلكتروني يوفر سياقا للصورة جسديم (نقاط حمراء). Mitochondrial cristae واضحة للعيان وتلطيخ Tom20 مترجمة إلى أغشية الميتوكوندريا الخارجي. الأغشية للجزء الخارجي فوتوريسيبتورس (OS) مصممون الواضح. الصورة بكسل حجم 5 نانومتر. تغيير حجم أشرطة: ألف وباء، وجيم: 10 ميكرومتر؛ D: 2 ميكرومتر؛ هاء وواو: 1 ميكرومتر وزاي: 0.2 ميكرون. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56113/56113fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
التكميلية الرقم 1: محاذاة الصور الضوء والمجهر الإلكتروني. أ. لقطة من واجهة TrackEM2 مع الصورة ووزارة شؤون المرأة ومعالم مرقمة (أصفر) على طول نوى مختلفة. ب-الصورة من واجهة TrackEM2 مع الصورة الفلورية ومعالم مرقمة (أصفر) على طول DAPI مختلفة الملون الأنوية. لتغيير شفافية طبقة يمكن استخدام مربعات التمرير في الجزء العلوي الأيسر من القائمة. شريط مقياس: 1 ميكرومتر. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56113/Supplementary_Figure_1.tif">اضغط هنا لتحميل هذا الملف.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina at JoVE.com

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

ويصف هذا البروتوكول الخطوات اللازمة للحصول على نتائج التعريب سوبسيلولار البروتين في الشبكية الزرد بربط القرار سوبر الخفيفة الميكروسكوب ومسح صور المجهر الإلكتروني.

القرار فائقة الارتباطية والميكروسكوب الإلكتروني لحل التعريب البروتين في الشبكية الزرد

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

قياس الاستقرار البروتين المتواجد في الحي اسماك الزرد الأجنة عن طريق الإسفار تسوس بعد Photoconversion (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

تحليل الزرد اليرقات الهيكل العظمي النزاهة العضلات مع ايفانز الأزرق صبغ

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Large-scale Scanning Transmission Electron Microscopy (Nanotomy) of Healthy and Injured Zebrafish Brain

Large-scale Scanning Transmission Electron Microscopy Nanotomy of Healthy and Injured Zebrafish Brain

على نطاق واسع الضوئي نقل المجهر (Nanotomy) من صحي والمصاب الزرد الدماغ

Large-scale 2D electron microscopy (EM), or nanotomy, is the tissue-wide application of nanoscale resolution electron microscopy. Others and we previously ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

تحليل التنمية الكلى الزرد مع الوقت الفاصل بين التصوير باستخدام مجهر تشريح مجهزة لباجتزاء البصري

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

باستخدام ورقة ضوء مضان المجهري لصورة التنمية الزرد العين

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Analysis of Protein-protein Interactions and Co-localization Between Components of Gap, Tight, and Adherens Junctions in Murine Mammary Glands

تحليل التفاعلات البروتين البروتين والمشاركة في توطين بين مكونات الفجوة، ضيق، والمالطيون تقاطعات في الغدد الثديية الفئران

Cell-cell interactions play a pivotal role in preserving tissue integrity and the barrier between the different compartments of the mammary gland. These ...

Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

تصوير هرمي متعدد الوسائط من مقاطع المسلسل للعثور على أهداف محددة الخلوية داخل كميات كبيرة

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a ...

Immunohistochemical Detection of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine in Developing and Postmitotic Mouse Retina

الكشف المناعي 5-ميثيلسيتوسيني وهيدروكسيميثيلسيتوسيني 5 في تطوير والشبكية الماوس بوستميتوتيك

The epigenetics of retinal development is a well-studied research field, which promises to bring a new level of understanding about the mechanisms of a ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

تصور بالعقدة ولوحة نوتوتشوردال في جاسترولاتينج الأجنة الماوس باستخدام الميكروسكوب الإلكتروني المسح وكله جبل الفلورة

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

طريقه تركيب طبقات لتمديد المجهر البؤري المجهري لأجنه الزبرافيش الكاملة بفواصل زمنيه طويلة

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...