Name: correlative super-resolution and electron microscopy to resolve protein localization in zebrafish retina
Uploaded: 2017-11-10T12:30:00
Duration: 12 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina at JoVE.com

Finansiering ION og RGB: Swiss National Science Foundation Ambizione-SCORE give PZ00P3 142404/1 og PZ00P3 163979.

alle eksperimenter blev udført i overensstemmelse med sætningen ARVO for brug af dyr i Ophthalmic og Vision forskning og blev godkendt af de lokale myndigheder.
 1. forberedelse af ultratynde sektioner på silicium Wafers <ol><li>prøve fiksering <ol><li>forberede Fikseringsvæske løsningen der indeholder 0,1% glutaraldehyd, 4% formaldehyd i 0,1 M cacodylate buffer. 
		Bemærk: forsigtighed! Vær forsigtig, når du arbejder med glutaraldehyd, formaldehyd og cacodylate buffer, bære passende personlige værnemidler og arbejde i et stinkskab.</li>
		<li>Aflive 5 dage efter befrugtningen (5 dpf) zebrafisk larver med tricaine (ethyl 3-aminobenzoat methanesulfonate, 0,4% w/v i PBS (fosfat buffer saltvand, pH 7)) som tidligere beskrevet 15.</li>
		<li>Fix larverne ved nedsænkning i pre kølet Fikseringsvæske løsning på is. Fjerne hovedet og der inkuberes natten over ved 4 ° C med blid vuggende.</li>
		<li>Dissekere øjnene ved at trimme i vævet omkring øjet ved hjælp af fine pincet og en microdissection skalpel (under en kikkert) i kølet Fikseringsvæske løsning på en 1% Agarosen-sengs plade. Overføre øjne til en tube med friske pre kølet fiksativ.</li>
		<li>Vaskes to gange i PBS (fosfat buffer saltvand, pH 7,4) for 5 min hver vask ved stuetemperatur (RT).</li>
	</ol></li> <li>Gelatine infiltration og montering <ol><li>varme op 15 mL lokal mad mærke gelatine 12% w/v i PB (fosfat buffer, 0,1 M pH 7,4) på 40 ° C. Fjern PBS og tilsæt gelatine løsning til rør indeholdende øjne. Tryk røret forsigtigt for at sikre gelatine infiltrater prøven og inkuberes i 10-30 min ved 40 ° C i en thermoblock med blid ryster eller i et vandbad.</li>
		<li>Fylder 12 mm x 5 mm x 3 mm silicium eller polyethylen flad indlejring forme med varm gelatine i en 40 ° C vandbad. Tilsæt to øjne pr. skimmel ved hjælp af en pipette, justere dem ordentligt under en kikkert, ved hjælp af en dissektion nål og lad gelatine køle af ved stuetemperatur i 1 minut og hærde ved 4 ° C i 20 min.</li>
		<li>Re trim gelatine blok under kikkerten til at passe det ene øje pr. blok ved hjælp af et barberblad.</li>
		<li>Overføre gelatine indlejret øjne til 2,3 M saccharose i PB på is. Der inkuberes ved 4 ° C natten.</li>
		<li>Exchange til nye 2,3 M rørsukkeropløsning og opbevares ved 4 ° C eller -20 ° C efter dette trin, prøver er klar til skæring eller kan opbevares ved-20 ° C i flere uger til måneder.</li>
		<li>Re trim gelatine blok til næsten størrelse i øjet inden flytningen til en cryo-pin. Fryse i flydende nitrogen og overførsel til en cryo-ultramicrotome.</li>
	</ol></li> <li>Cryosectioning <ol><li>Cut 110 nm tykke-sektioner på-120 ° C med en diamant kniv i cryo-ultramicrotome.</li>
		<li>Vælge afsnittene med en kabelforbundet løkke indeholdende en dråbe af 2% methylcellulose (i vand) og 2,3 M rørsukkeropløsning (1:1). Overføre sektioner til en 7 mm x 7 mm silicium wafer. Gemme sektioner ved 4 ° C indtil videreforarbejdning.</li>
	</ol></li></ol> 2. Immunolabelling <ol><li>vask vafler med PBS ved 0 ° C i 20 min. på fire dråber ved at placere vafler hovedet på dråberne. Vask i PBS 2 x 2 min. ved stuetemperatur.</li>
	<li>Ruger 3 gange i 0,15% glycin i PBS, for 1 min. Vask 3 x til 1 min/vask med PBS. Pre incubate med PBG (PBS med 0,5% bovint serumalbumin BSA og 0,2% gelatine type B) i 5 min.</li>
	<li>Incubate med kanin anti-Tom20 (Se Tabel af materialer) i PBG (4 µg/mL) i 30 min ved stuetemperatur.</li>
	<li>Vaske 6 x 1 min./vask i PBG. Pre incubate med PBG i 5 min på RT. Incubate med anti-kanin Alexa 647 F(ab&#39;) 2 (Se Tabel af materialer) i PBG (7,5 µg/mL) for 30 min.</li>
	<li>Vaske 6 x 1 min./vask i PBG. Vask 3 x 2 min. i PBS. Der inkuberes med DAPI (4 µg/mL) i PBS for 10 s. vask 2 x 2 min. i PBS.</li>
</ol> 3. Super-resolution mikroskopi <ol><li>Incubate wafer kortvarigt (10 s) ved at placere det på en dråbe af en 1:1 løsning af glycerol (80%) og imaging buffer indeholdende en ilt scavenging system (200 mM fosfat buffer som indeholder 10% glukose, 0,5 mg/mL glucoseoxidase, 40 µg/mL katalase, 15 mM beta-mercaptoethylamine hydrochlorid (MEA HCL), pH 8,0).</li>
	<li>Overføre vafler (afsnit vender nedad) til et glas bund (tykkelse 170 ± 5 µm) petriskål op på en frisk drop af 1:1 blanding af glycerol (80%) og imaging buffer (som i trin 3.1).</li>
	<li>Fjernes fra alle sider, med en pipette, de fleste af flydende nedenunder wafer. Brug silikone striber til at fastsætte wafer til bunden af petriskålen. 
	Bemærk: Silikone striber er lavet af to-komponent silikone-lim (3 mm x 12 mm).</li>
	<li>Billede sektioner på en inverteret mikroskop ved hjælp af en høj numerisk blænde (f.eks. 160 X / NA 1.43; Se Tabel af materialer) super opløsning dedikeret oliebestandighedsobjektet. Før imaging, lad sample reagensglasset mikroskop temperatur for at minimere/reducere lateral og aksial afdrift.</li>
	<li>Center område af interesse og erhverve første widefield epifluorescensmikroskop reference billeder. Skift til super opløsning driftstilstand. Justere eksponeringstiden af kameraet til 15 ms og indstille elektronen multiplikation (EM) gevinst til maksimum 300.</li>
	<li>Belyse prøve med 642 nm kontinuert bølge laser på maksimal laser power (svarende til ~2.8 kW/cm 2) i epifluorescensmikroskop tilstand. Så snart den enkelt molekyle blinker er godt adskilt i hver ramme, således at sandsynligheden er lav, at individuelle signaler overlapper, indstille laser magt til ~0.7 kW/cm 2. Optage raw-billede i epifluorescensmikroskop tilstand ved at erhverve et minimum af 30.000 frames. 
	Bemærk: Alle disse parameter kan variere afhængigt af forskellige prøver og mærkning tætheder.</li>
	<li>Fra de rå data, generere en genopbygning begivenhedsliste (lokaliseringer af hver enkelt molekyle blink i raw-billedet) ved hjælp af en påvisningsgrænse 30 fotoner (skal reguleres efter prøven) ved at klikke på &#34; Evaluer &#34; i det &#39; t-serien analyse &#39; under &#39; værktøjer &#39;.</li>
	<li>Visualisere super opløsning billede af Gaussisk montering 16 anvender en rendering pixelstørrelse af 4 nm ved at klikke på &#34; skabe billed &#34; i den &#39; begivenhed liste forarbejdning panel &#39; under &#39; værktøjer. &#39; 
	Bemærk: For at generere den super løst billede integreret softwareværktøjer af det system, der anvendes i denne undersøgelse var ansat. Dog beskrevet super opløsning imaging kunne udføres på et andet enkelt molekyle lokalisering baseret system, og data kan behandles med open source softwareværktøjer som tordenvejr 17.</li>
</ol> 4. Platin Shadowing <ol><li>fjerne silicium striber og tilføje en dråbe af PBS tæt på kanterne af wafer at løfte det fra petriskålen. Vask wafer 2 x 2 min. i PBS, så post løse det med 0,1% glutaraldehyd i PBS for 5 min. vask 2 x til 2 min./vaske i PBS.</li>
	<li>Ruger wafer to gange for 5 min/inkubation i 1 dråbe af methylcellulose 2% i vand på is. Indsæt wafer i et centrifugeglas og centrifugeres ved 14,100 x g i 90 s. montere det på påbegyndt SEM aluminium med udførelse carbon cement.</li>
	<li>Tilføjer et lag på 2 til 10 nm af platin/carbon på prøve af roterende skygger på 8° ved hjælp af en elektron stråle fordampning Enhedsindstillinger: 1,55 kV, 55 mA, på 0,3 nm/s og en vinkel på 8°, rotation niveau 4.</li>
</ol> 5. Scanning Elektron Mikroskopi <ol><li>billedet sektioner med en scanning elektron microscope på 1,5 kV, 2 mm arbejde afstand og med en i linse sekundære elektron detektor.</li>
</ol> 6. Justering af lys og elektronmikroskopi billeder <ol><li>åben begge typer af billeder med Fiji 18 ved at klikke på &#34; fil | Åben &#34;. Justere lærredsstørrelse ved at klikke på &#34; billede | Justere | Lærred størrelse &#34; og give en stak begge billeder ved at klikke på &#34; billede | Stakke | Billeder at stable &#34;. Gem stakken som tiff filtype.</li>
	<li>I Fiji, åbne en ny TrackEM2 19 interface ved at klikke på &#34; fil | nye | TrackEM2 (ny) &#34;. Importere stak med både billeder ved at højreklikke på det sorte vindue og vælge &#34; Import stak &#34;.</li>
	<li>Juster lys mikroskopi billede til Elektron Mikroskopi billede manuelt med vartegn ved hjælp af en klik med højre museknap på billedet og vælge &#34; Juster | Justere lag manuelt med lokaliteter &#34;.
	<ol><li>Pick Vælg værktøj (den sorte pil) til at tilføje landemærker. Bruge figuren af kerner som reference til at vælge de samme kanter i begge billeder (tillægs figur 1). Tilføje flere point (minimum tre punkter skal være markeret). Anvende justering med en affine model af højre mus klikke på og vælge &#34; anvende transformeringen | Affine model &#34;.</li>
	</ol></li> <li>Ændre laggennemsigtighed (Se tillægs figur 1) for at vurdere kvaliteten af justeringen.</li></ol>

<ol>
	<li>Hauser, M., Wojcik, M., Kim, D., Mahmoudi, M., Li, W., Xu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+Super-Resolution+Microscopy:+New+Dimensions+and+New+Opportunities.">Correlative Super-Resolution Microscopy: New Dimensions and New Opportunities.</a> Chem Rev. , (2017).</li><li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging.">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).</li><li>F&#246;lling, J., Bossi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+nanoscopy+by+ground-state+depletion+and+single-molecule+return.">Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return.</a> Nat Methods. 5 (11), 943-945 (2008).</li><li>Betzig, E., Patterson, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science (New York, N.Y.). 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Kopek, B. G., Shtengel, G., Grimm, J. B., Clayton, D. A., Hess, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+photoactivated+localization+and+scanning+electron+microscopy.">Correlative photoactivated localization and scanning electron microscopy.</a> PLOS one. 8 (10), e77209 (2013).</li><li>Paez-Segala, M. G., Sun, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation-resistant+photoactivatable+fluorescent+proteins+for+CLEM.">Fixation-resistant photoactivatable fluorescent proteins for CLEM.</a> Nat Methods. 12 (3), 215-218 (2015).</li><li>Narayan, K., Subramaniam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ion+beams+in+biology.">Focused ion beams in biology.</a> Nat Methods. 12 (11), 1021-1031 (2015).</li><li>Tokuyasu, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunochemistry+on+ultrathin+frozen+sections.">Immunochemistry on ultrathin frozen sections.</a> Histochem J. 12 (4), 381-403 (1980).</li><li>Suleiman, H., Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+protein+architecture+of+the+kidney+glomerular+basement+membrane.">Nanoscale protein architecture of the kidney glomerular basement membrane.</a> eLife. 2, e01149 (2013).</li><li>Kopek, B. G., Shtengel, G., Xu, C. S., Clayton, D. A., Hess, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+3D+superresolution+fluorescence+and+electron+microscopy+reveal+the+relationship+of+mitochondrial+nucleoids+to+membranes.">Correlative 3D superresolution fluorescence and electron microscopy reveal the relationship of mitochondrial nucleoids to membranes.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 109 (16), 6136-6141 (2012).</li><li>Avanesov, A., Malicki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+retina+in+the+zebrafish+model.">Analysis of the retina in the zebrafish model.</a> Methods Cell Biol. 100, 153-204 (2010).</li><li>Bachmann-Gagescu, R., Phelps, I. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ciliopathy+gene+cc2d2a+controls+zebrafish+photoreceptor+outer+segment+development+through+a+role+in+Rab8-dependent+vesicle+trafficking.">The ciliopathy gene cc2d2a controls zebrafish photoreceptor outer segment development through a role in Rab8-dependent vesicle trafficking.</a> Hum Mol Gen. 20 (20), 4041-4055 (2011).</li><li>Bachmann-Gagescu, R., Dona, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ciliopathy+Protein+CC2D2A+Associates+with+NINL+and+Functions+in+RAB8-MICAL3-Regulated+Vesicle+Trafficking.">The Ciliopathy Protein CC2D2A Associates with NINL and Functions in RAB8-MICAL3-Regulated Vesicle Trafficking.</a> PLOS Gen. 11 (10), e1005575 (2015).</li><li>Mateos, J. M., Guhl, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographic+contrast+of+ultrathin+cryo-sections+for+correlative+super-resolution+light+and+electron+microscopy.">Topographic contrast of ultrathin cryo-sections for correlative super-resolution light and electron microscopy.</a> Sci Rep. 6, 34062 (2016).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+nanometer+localization+analysis+for+individual+fluorescent+probes.">Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes.</a> Biophys J. 82 (5), 2775-2783 (2002).</li><li>Ovesn&#253;, M., K&#345;&#237;&#382;ek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ThunderSTORM:+a+comprehensive+ImageJ+plug-in+for+PALM+and+STORM+data+analysis+and+super-resolution+imaging.">ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging.</a> Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).</li><li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Cardona, A., Saalfeld, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrakEM2+software+for+neural+circuit+reconstruction.">TrakEM2 software for neural circuit reconstruction.</a> PLOS one. 7 (6), e38011 (2012).</li><li>Wurm, C. A., Neumann, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+distribution+of+mitochondrial+import+receptor+Tom20+is+adjusted+to+cellular+conditions+and+exhibits+an+inner-cellular+gradient.">Nanoscale distribution of mitochondrial import receptor Tom20 is adjusted to cellular conditions and exhibits an inner-cellular gradient.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 108 (33), 13546-13551 (2011).</li><li>Slot, J. W., Geuze, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryosectioning+and+immunolabeling.">Cryosectioning and immunolabeling.</a> Nat Prot. 2 (10), 2480-2491 (2007).</li></ol>

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Denne metode kombinerer Super-løst protein lokalisering med kontekstafhængige oplysninger til at bestemme den nøjagtige position af proteiner i en organelle. Vi viser her afslutningen af forsøget at visualisere udtryk for Tom20 i den ydre membran af mitokondrier, og dets relation til andre organeller som kerner eller ydre segmenter af fotoreceptor i larve zebrafisk nethinden.
Tokuyasu cryo-skæring kræver nogle uddannelse at erhverve velbevarede sektioner. Dette er dog en metode, der er ansat i mange laboratorier med dokumenteret succes21. Overførsel af sektionerne til silicium wafer er meget enkel og ingen særlige overvejelser er nødvendige. Brugen af glycerol i imaging bufferen er et meget afgørende skridt til at undgå udtørring af sektionerne. For super-opløsning imaging opnås de bedste resultater når wafer er meget tæt på glas bund af petriskålen. Silikone striber hjælpe bevare wafer i denne position. Særlig forsigtig skal der tages samtidig med at fjerne striberne for at undgå at beskadige sektionerne.
Tykkelsen af cryo-sektioner, omkring 100 nm, tyndere end den optisk opløsning i Z-dimension, derudover letter rigtigheden af denne korrelationsmaalinger metode som Super-resolution mikroskopi signal kommer kun fra denne tynde lag og den scanning elektron mikroskop signal viser topografi af prøven. Denne metode kan også kombineres med flerfarvet billeddannelse. Dog skal særlig forsigtig træffes at prøven kan være afbildet under samme betingelser (fx imaging buffer) og krydstale, bør forebygges.
En begrænsning af metoden er dens to dimensionel tilgang, eftersom kun et begrænset antal serielle sektioner (omkring 3-7 per wafer) kan afhentes. Projekter beskæftiger sig med volumen analyse ville således ikke være ideel. Men det er en metode, der kan anvendes til at påvise protein udtryk i enhver type af væv ved enkle skæring af prøven. Vi leverer en metode uden brug af klassisk kontrastmidler som uranyl acetat eller bly citrat. Kontrast af platin shadowing giver meget informative topografiske kontrast, men i nogle tilfælde membraner er vanskelige at løse. Dette kan skabe problemer for projekter, der har brug for for eksempel at fastsætte udtrykket af proteiner i små blærer.
Vores protokol, baseret på Tokuyasu cryo-sektioner, bruger standard udstyr for at opnå korrelationsmaalinger resultater fra super-opløsning og scanning elektron mikroskoper. Samling af sektioner på silicium wafers og brugen af platinum til kontrast er enkle trin til at give stabilitet og reproducerbarhed til prøveforberedelsen.

Metoder til at bestemme den subcellulært lokalisering af proteiner og deres forhold til forskellige segmenter af cellen er væsentlige værktøjer til at forstå deres funktioner og mulige interaktioner. Super-resolution mikroskopi i kombination med elektronmikroskopi giver sådanne oplysninger1. Grundtilstand udtynding mikroskopi efterfulgt af enkelte molekyle afkast (GSDIM) er en super-resolution mikroskopi teknologi, kompatibel med en bred vifte af økologiske og genetisk kodet fluorophores2 og opnår en lateral opløsning på op til 20 nm 3. inddragelse af metoder med højere opløsning end standard diffraktion-begrænset mikroskopi forbedrer nøjagtigheden af korrelation4,5,6. For at opnå den bedste korrelation af protein udtryk med en specifik subcellulært rum og reducere mængden af usikkerhed7 anvendelse af den samme ultratynde sektion til lys og elektronmikroskopi anbefales. Blandt de forskellige skære metoder, Tokuyasu cryo-sektion protokollen kræver ikke dehydrering eller harpiks indlejring, og derudover bevarer antigenicity af mange epitoper og giver god væv ultrastruktur8. Flere metoder har vist anvendeligheden af disse sektioner i korrelationsmaalinger lys og elektronmikroskopi (CLEM)4,5,9,10.
Zebrafisk nethinden er en værdifuld model til at studere visuelle udvikling og menneskelige sygdomsmekanismer givet sin yderst velbevarede struktur og funktion på tværs af hvirveldyr. I særlige, retinal fotoreceptorer display den samme arkitektur som pattedyr fotoreceptorer, med en basal synapse, en apico-basen aflang kerne, klynger af mitochondrier i af mere apikale indre og en ydre segment består af membran diske i den mest apikale holdning11. Protein lokalisering til de forskellige cellulære rum er bevaret mellem zebrafisk og menneskelige, giver mulighed for undersøgelse af den biologiske funktion af menneskelig sygdom-relevante proteiner12,13.
Her præsenterer vi en protokol for at forberede larve zebrafisk nethinden prøver at løse lokalisering af den ydre membran protein Tom20 ved korrelationsmaalinger super-resolution lys og elektronmikroskopi. Metoden er baseret på indsamling af cryo-sektioner på silicium wafers og at opnå kontrast ved topografiske oplysninger produceret efter anvendelse af et tyndt lag af platin. Disse trin er klart tekniske forbedringer for lethed af brug, reproducerbarhed og tid til at fuldføre eksperimenter. Vi har for nylig vist anvendeligheden af metoden til at registrere nukleare porer og mitokondrielle proteiner i mus væv14.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde EM Grade</td>
			<td>EMS, USA</td>
			<td>#16220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cacodylate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#8.20670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#886-86-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose, peqGOLD Universal</td>
			<td>VWR International GmbH</td>
			<td>35-1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat embedding molds</td>
			<td>BEEM Flat</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Local food brand gelatin</td>
			<td>Dr.Oetker</td>
			<td>Extra Gold</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#1.07687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#M-6385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#G-7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin type B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#G-6650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>#A6588.0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Si-Mat Silicon Materials</td>
			<td></td>
			<td>Type: P/Boron; Orientation &#60;111&#62; ON; Growth method: CZ; Resistivity:1-30 ohm/cm; Surface: polished; Laser cut at 7 x7 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-pin</td>
			<td>Baltic Preparation</td>
			<td>#16701950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wired loop &#34;Perfect loop&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone stripes</td>
			<td>Picodent</td>
			<td>Twinsil 22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucoseoxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#G7141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>catalase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#C40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beta-Mercaptoethylamine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#M6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Tom20</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>#sc - 11415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 647 AffiniPure F(ab&#39;)2 fragment donkey anti rabbit IgG</td>
			<td>Jackson Immuno-Research</td>
			<td>#711-606-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ROCHE, Switzerland</td>
			<td>#10236276001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#49782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom petri dish</td>
			<td>Ibidi, Germany</td>
			<td>u-Dish 35mm, high glass bottom, #81158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEM aluminium stub</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>#G301F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conducting carbon cement Leit-C</td>
			<td>Plano, Germany</td>
			<td>AG3300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond Knife (Cryo Immuno)</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>DCIMM3520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-ultramicrotome</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Leica EM FCS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield-TIRF microscope GSD Leica SR GSD 3D</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>160x 1.43 TIRF objective</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>11523048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEM - Zeiss Supra 50 VP</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Supra 50 VP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIB-SEM - Zeiss Auriga 40</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Auriga 40</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

correlative super-resolution and electron microscopy to resolve protein localization in zebrafish retina

Vi præsenterer en metode til at undersøge subcellulært protein lokaliseringen i larve zebrafisk nethinden ved at kombinere super-resolution lysmikroskopi og scanning Elektron Mikroskopi. Sub diffraktion grænse opløsning kapaciteter af super-resolution lys mikroskoper tillade, forbedre nøjagtigheden af korrelerede data. Kort, 110 nanometer tyk cryo-sektioner er overført til en silicium wafer, og efter immunofluorescens farvning, er afbildet af super-resolution lysmikroskopi. Efterfølgende, er sektionerne bevaret i methylcellulose og platinum skygget før imaging i en scanning elektron mikroskop (SEM). Billeder fra disse to mikroskopi modaliteter flettes nemt ved hjælp af væv vartegn med open source software. Her beskriver vi tilpasset metoden til larve zebrafisk nethinden. Men denne metode er også gælder for andre typer af væv og organismer. Vi demonstrere, at de supplerende oplysninger, som denne korrelation er købedygtig løse udtryk af mitokondrielle proteiner i forbindelse med membraner og cristae af mitochondrier samt andre rum af cellen.

Udtryk af protein Tom20, en underenhed af de translocase ydre membran komplekse20, blev fastlagt i tynde sektioner af larve zebrafisk nethinden, af super-opløsning lysmikroskopi (figur 1) og oplysningerne blev suppleret med de topografiske signal fremkommer ved scanning elektronmikroskopi efter platin afskygning af de samme sektioner. Disse korrelationsmaalinger data bekræfter lokalisering af et protein i forening med et bestemt rum, den ydre membran, og desuden giver oplysninger om forholdet mellem protein med andre organeller af cellen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56113/56113fig1.jpg"> 
Figur 1: CLEM på zebrafisk nethinden. A. lav forstørrelse widefield billede af en 5 dpf zebrafisk retinal sektion, cellekerner farves med DAPI (cyan). B. Scanning Elektron Mikroskopi af det samme område. C. højere forstørrelse widefield billede af rammen i B. cellekerner farves med DAPI (cyan) og Tom20 mitokondrie farvning vises med rødt. D. Widefield billede af samme sektion på højere forstørrelse. Mønster af Tom20 udtryk er på klynger af mitokondrier. E. udtryk af Tom20 (røde prikker) opdaget af GSDIM mikroskopi. Cellekerner farves med DAPI (cyan). F. samme afsnit som E kombinerer korrelationsmaalinger super-opløsning og scanning Elektron Mikroskopi. Tom20 farvning (røde prikker) vises på den mitokondrielle klynge (M) på de ydre membraner af mitokondrier. Fluorescens DAPI signal i kerner (N) svarer med SEM billede topografi. G. høj forstørrelse billede i ramme i F. Scanning Elektron Mikroskopi billede giver forbindelse til GSDIM billede (røde prikker). Mitokondrie cristae er klart synlige og Tom20 farvning er lokaliseret til de ydre membraner af mitokondrier. Membraner i det ydre segment fotoreceptorer (OS) er klart løst. Billede pixel størrelse 5 nm. Skalere barer: A, B og C: 10 µm; D: 2 µm; E og F: 1 µm og G: 0,2 µm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56113/56113fig1large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Tillægs figur 1: justering af lys og elektronmikroskopi billeder. A. Screenshot fra TrackEM2 interface med SEM billede og nummererede vartegn (gule) langs forskellige kerner. B. Screenshot fra TrackEM2 interface med fluorescens billede og nummererede vartegn (gul) langs forskellige DAPI farves kerner. Ændre laggennemsigtighed skydere på venstre øverste del af menuen kan bruges. Skalalinjen: 1 µm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56113/Supplementary_Figure_1.tif">venligst klik her for at downloade denne fil.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina at JoVE.com

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

Denne protokol beskriver de nødvendige skridt for at opnå subcellulært protein lokalisering resultater på zebrafisk nethinden af korrelerede super-resolution lysmikroskopi og scanning elektronmikroskopi billeder.

Korrelationsmaalinger super-opløsning og elektronmikroskopi at løse Protein lokalisering i zebrafisk nethinden

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Måling Protein Stabilitet i Living zebrafisk embryoner anvendelse af fluorescens Decay Efter fotoomdannelse (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse af zebrafisk Larver Skeletmuskel Integritet med Evans blå farvestof

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Large-scale Scanning Transmission Electron Microscopy (Nanotomy) of Healthy and Injured Zebrafish Brain

Large-scale Scanning Transmission Electron Microscopy Nanotomy of Healthy and Injured Zebrafish Brain

Storstilet Scanning Transmission Electron Microscopy (Nanotomy) af Sund og Tilskadekomne Zebrafisk Brain

Large-scale 2D electron microscopy (EM), or nanotomy, is the tissue-wide application of nanoscale resolution electron microscopy. Others and we previously ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

Analyse af zebrafisk Kidney Udvikling med Time-lapse Imaging Ved hjælp af en dissektionsmikroskop Udstyret til Optical Sektionsinddeling

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Brug Light Sheet Fluorescens mikroskopi til billede zebrafisk Eye Development

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Analysis of Protein-protein Interactions and Co-localization Between Components of Gap, Tight, and Adherens Junctions in Murine Mammary Glands

Analyse af protein-proteininteraktioner og co-lokalisering mellem komponenter af gap-, stram- og adherensforbindelser i murine mammakirtler

Cell-cell interactions play a pivotal role in preserving tissue integrity and the barrier between the different compartments of the mammary gland. These ...

Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

Multimodal hierarkisk billeddannelse af serielle sektioner for at finde specifikke cellulære mål inden for store mængder

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a ...

Immunohistochemical Detection of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine in Developing and Postmitotic Mouse Retina

Immunhistokemisk påvisning af 5-Methylcytosine og 5-Hydroxymethylcytosine i at udvikle og Postmitotic mus nethinden

The epigenetics of retinal development is a well-studied research field, which promises to bring a new level of understanding about the mechanisms of a ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisere Node og Notochordal plade i Gastrulating mus embryoner ved hjælp af Scanning elektronmikroskopi og hele Mount immunfluorescens

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

En lagdelt monteringsmetode til forlænget tidsforskudt Konfokal mikroskopi af hele Zebrafish-embryoner

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...