Name: correlative super-resolution and electron microscopy to resolve protein localization in zebrafish retina
Uploaded: 2017-11-10T12:30:00
Duration: 12 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina at JoVE.com

Financiering van ION en RGB: Swiss National Science Foundation Ambizione-SCORE verlenen PZ00P3 142404/1 en PZ00P3 163979.

alle experimenten werden uitgevoerd overeenkomstig de verklaring van de ARVO voor het gebruik van dieren in Ophthalmic en visie onderzoek en zijn goedgekeurd door de lokale autoriteiten.
 1. voorbereiding van de uiterst dunne secties op silicium-wafels <ol><li>monster fixatie <ol><li>bereid de kleefpoeders oplossing met 0,1% Glutaaraldehyde, 4% formaldehyde in 0,1 M cacodylate buffer. 
		Opmerking: Let op! Wees voorzichtig bij het werken met formaldehyde, Glutaaraldehyde en cacodylate buffer, passende persoonlijke beschermingsmiddelen te dragen en werken in een zuurkast.</li>
		<li>Euthanaseren 5 dagen post bevruchting (5 dpf) zebrafish larven met tricaïne (ethyl 3-aminobenzoaat methanesulfonate, 0,4% w/v in PBS (phosphate buffer zoutoplossing, pH 7)) als eerder beschreven 15.</li>
		<li>Bevestigen de larven door onderdompeling in vooraf gekoeld kleefpoeders oplossing op ijs. Verwijderen van het hoofd en na een nacht bebroeden bij 4 ° C met zachte rockende.</li>
		<li>Ontleden de ogen door te korten van het weefsel rond het oog met fijne pincet en een microdissection scalpel (onder een verrekijker) in gekoeld kleefpoeders oplossing op een plaat 1% agarose-bedden. De ogen overbrengen in een buis met verse vooraf gekoeld fixeerspray.</li>
		<li>Wassen tweemaal in PBS (phosphate buffer zoutoplossing, pH 7.4) gedurende 5 minuten elk wassen bij kamertemperatuur (RT).</li>
	</ol></li> <li>Gelatine infiltratie en montage <ol><li>opwarmen 15 mL lokaal voedsel merk gelatine 12% w/v in PB (fosfaatbuffer, pH van de 0,1 M 7.4) bij 40 ° C. de PBS verwijderen en toevoegen van gelatine oplossing aan de buizen met de ogen. Tik op de tube zachtjes om te zorgen voor de gelatine infiltreert het monster en incubeer gedurende 10-30 min bij 40 ° C in een thermoblock met zacht schudden of in een waterbad.</li>
		<li>Vul 12 x 5 x 3 mm silicium of polyethyleen platte mallen te embedding met warme gelatine in een waterbad van 40 ° C. Toevoegen van twee ogen per schimmel met behulp van een precisiepipet, ze uitlijnen onder een verrekijker met behulp van een naald dissectie en laat de gelatine afkoelen bij kamertemperatuur voor 1 min en harden bij 4 ° C gedurende 20 min.</li>
		<li>Opnieuw trim de gelatine blok onder de binoculair aan één oog per blok met behulp van een scheermesje.</li>
		<li>Overbrengen in de ogen van de gelatine ingesloten 2,3 M sacharose in PB op ijs. Na een nacht bebroeden bij 4 ° C.</li>
		<li>Exchange om nieuwe 2,3 M sacharoseoplossing en sla bij 4 ° C of -20 ° C; na deze stap, monsters zijn klaar voor het segmenteren of kan worden achtergelaten bij-20 ° C voor enkele weken tot maanden.</li>
		<li>Trim opnieuw de gelatine blok bijna de grootte van het oog vóór de overbrenging naar een cryo-pin. Freeze in vloeibare stikstof en overdracht aan een cryo-ultramicrotome.</li>
	</ol></li> <li>Cryosectioning <ol><li>gesneden 110 nm dik-sections bij-120 ° C met een mes van de diamant in de cryo-ultramicrotome.</li>
		<li>Halen de secties met een vast lus met een druppel van 2% methylcellulose (in water) en een sacharoseoplossing 2,3 M (1:1). Secties overbrengen in een 7 x 7 mm silicium wafer. Secties bij 4 ° C worden opgeslagen totdat zij worden verwerkt.</li>
	</ol></li></ol> 2. Immunolabelling <ol><li>Wash wafels met PBS bij 0 ° C gedurende 20 minuten op vier druppels door het plaatsen van de wafeltjes ondersteboven op de druppels. Wassen in PBS 2 x 2 min bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Incubate 3 keer in 0,15% glycine in PBS, voor elke 1 min. 3 x voor 1 min wassen/wassen met PBS. Vooraf incubate met PBG (PBS met 0,5% bovien serumalbumine BSA en 0,2% gelatine type B) voor 5 min.</li>
	<li>Incubate met konijn anti-Tom20 (Zie de Tabel van materialen) in PBG (4 µg/mL) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Wassen 6 x voor 1 min/afwas in PBG. Vooraf incubate met PBG voor 5 min op RT. Incubate met anti-konijn Alexa 647 F(ab&#39;) 2 (Zie de Tabel van materialen) in PBG (7,5 µg/mL) voor 30 min.</li>
	<li>Wassen 6 x voor 1 min/afwas in PBG. 3 x 2 min in PBS wassen. Incubeer met DAPI (4 µg/mL) in PBS voor 10 s. wassen 2 x 2 min in PBS.</li>
</ol> 3. Super resolutie microscopie <ol><li>Incubate de wafer kort (10 s) door de plaatsing ervan op een druppel van een 1:1 oplossing van glycerol (80%) en imaging buffer met een zuurstof opruiming systeem (200 mM fosfaatbuffer met 10% glucose, 0,5 mg/mL glucoseoxidase, 40 µg/mL katalase, 15 mM bèta-mercaptoethylamine hydrochloride (HCL MEA), pH 8,0).</li>
	<li>De wafeltjes (sectie naar beneden) overbrengen in een petrischaal voor glazen bodem (dikte 170 ± 5 µm) op een nieuwe daling van het 1:1 mengsel van glycerol (80%) en imaging buffer (zoals in stap 3.1).</li>
	<li>Verwijderen van alle kanten, met een pipet, allermeest naar de vloeistof onder de wafer. Gebruik van silicone strepen om te repareren het zegel aan de onderkant van de petrischaal. 
	Opmerking: Silicone strepen worden gemaakt uit twee componenten siliconen-lijm (3 x 12 mm).</li>
	<li>Afbeelding secties op een omgekeerde Microscoop met een hoge numerieke diafragma (bijvoorbeeld 160 X / nb 1,43; Zie de Tabel van materialen) olie onderdompeling super resolutie speciale doelstelling. Voorafgaand aan de beeldvorming, laat het monster equilibreer tot Microscoop temperatuur teneinde minimaliseren/laterale en axiale drift.</li>
	<li>Center van het interessegebied en eerste widefield epifluorescence referentie beelden te verwerven. Wijzig in de bewerkingsmodus super resolutie. De blootstellingstijd van de camera naar 15 ms aanpassen en instellen van het elektron te vermenigvuldigen (EM) winst tot het maximum van 300.</li>
	<li>Verlichten monster met de 642 nm continuous wave laser op maximale laser kracht (overeenkomend met ~2.8 kW/cm 2) in de epifluorescence modus. Zodra het enkel molecuul knippert zijn goed gescheiden in elk frame, zodat de kans op lage dat individuele signalen overlappen, stel de macht van de laser om ~0.7 kW/cm 2. Opnemen van de onbewerkte afbeelding in epifluorescence modus door het verwerven van een minimum van 30.000 frames. 
	Opmerking: Deze parameter All kan variëren afhankelijk van de verschillende exemplaren en labelen van dichtheden.</li>
	<li>Van de ruwe gegevens, het genereren van een gebeurtenissenlijst wederopbouw (lokalisaties van elke één molecuul knipperen in het ruwe beeld) met behulp van een drempel van de detectie van 30 fotonen (dient te worden aangepast volgens het monster) door te klikken op &#34; evalueren &#34; in de &#39; t-serie analyse &#39; onder &#39; Tools &#39;.</li>
	<li>Het super resolutiebeeld visualiseren door Gauss montage 16 toe te passen van een pixelgrootte van de rendering van 4 nm door te klikken op &#34; Create Image &#34; in de &#39; gebeurtenis lijst verwerking paneel &#39; onder &#39; Tools. &#39; 
	Opmerking: Voor het genereren van de super opgelost afbeelding de geïntegreerde software-tools van het systeem gebruikt in deze studie werden ingezet. Echter de beeldvorming beschreven super resolutie kan worden uitgevoerd op een ander enkel molecuul lokalisatie gebaseerd systeem en de gegevens kan worden verwerkt met opensource software gereedschappen als onweer 17.</li>
</ol> 4. Platina Shadowing <ol><li>verwijderen van silicium strepen en voeg een druppel PBS dicht bij de randen van het zegel aan het verheffen van de petrischaal. Wassen van de wafer 2 x 2 min in PBS, dan post repareren met 0,1% Glutaaraldehyde in PBS voor 5 min. 2 x gedurende 2 minuten wassen/wassen in PBS.</li>
	<li>Broeden de wafer tweemaal voor 5 min/incubatie in 1 druppel methylcellulose 2% in water op het ijs. De wafer invoegen in een centrifugebuis samen en centrifugeer bij 14,100 x g voor 90 s. Mount het op een SEM aluminium beginnetje met het uitvoeren van koolstof cement.</li>
	<li>Toevoegen van een laag van 2 tot en met 10 nm van platina/carbon op de steekproef door het roterende shadowing bij 8° met behulp van een elektron beam verdamping Apparaatinstellingen: 1.55 kV, 55 mA, 0.3 nm/s, en een hoek van 8°, rotatie niveau 4.</li>
</ol> 5. Scanning elektronen microscopie <ol><li>afbeelding secties met een scanning electron microscope op 1,5 kV, 2 mm werken afstand en lens met een In secundaire electron detector.</li>
</ol> 6. Uitlijning van licht- en elektronenmicroscopie beelden <ol><li>Open beide typen afbeeldingen met Fiji 18 door te klikken op &#34; bestand | Open &#34;. De canvasgrootte van het aanpassen door te klikken op &#34; afbeelding | Aanpassen | Canvasgrootte &#34; en beide beelden brengen in een stapel door te klikken op &#34; afbeelding | Stapels | Afbeeldingen stapelen &#34;. De stack opslaan als TIFF-bestandstype.</li>
	<li>In Fiji, een nieuwe TrackEM2 19-interface openen door te klikken op &#34; bestand | nieuw | TrackEM2 (nieuw) &#34;. De stapel met beide afbeeldingen importeren door rechts te klikken op het zwarte venster en selecteren &#34; Import stapel &#34;.</li>
	<li>Uitlijnen licht microscopie afbeelding naar elektronenmicroscopie afbeelding handmatig met bezienswaardigheden met behulp van een rechter muisklik op de afbeelding en selecteren &#34; uitlijnen | Uitlijnen van laag handmatig met bezienswaardigheden &#34;.
	<ol><li>Pick de Selecteer gereedschap (zwarte pijl) om toe te voegen van monumenten. De vorm van kernen gebruiken als referentie om te selecteren van de dezelfde randen in beide afbeeldingen (aanvullende figuur 1). Voeg meerdere punten (minimum drie punten moeten worden geselecteerd). Uitlijning met een affiene model toepassen door rechtermuisknop op te klikken en te selecteren &#34; transformatie toepassen | Affiene model &#34;.</li>
	</ol></li> <li>Laag transparantie wijzigen (Zie aanvullende figuur 1) te beoordelen van de kwaliteit van de uitlijning.</li></ol>

<ol>
	<li>Hauser, M., Wojcik, M., Kim, D., Mahmoudi, M., Li, W., Xu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+Super-Resolution+Microscopy:+New+Dimensions+and+New+Opportunities.">Correlative Super-Resolution Microscopy: New Dimensions and New Opportunities.</a> Chem Rev. , (2017).</li><li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging.">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).</li><li>F&#246;lling, J., Bossi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+nanoscopy+by+ground-state+depletion+and+single-molecule+return.">Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return.</a> Nat Methods. 5 (11), 943-945 (2008).</li><li>Betzig, E., Patterson, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science (New York, N.Y.). 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Kopek, B. G., Shtengel, G., Grimm, J. B., Clayton, D. A., Hess, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+photoactivated+localization+and+scanning+electron+microscopy.">Correlative photoactivated localization and scanning electron microscopy.</a> PLOS one. 8 (10), e77209 (2013).</li><li>Paez-Segala, M. G., Sun, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation-resistant+photoactivatable+fluorescent+proteins+for+CLEM.">Fixation-resistant photoactivatable fluorescent proteins for CLEM.</a> Nat Methods. 12 (3), 215-218 (2015).</li><li>Narayan, K., Subramaniam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ion+beams+in+biology.">Focused ion beams in biology.</a> Nat Methods. 12 (11), 1021-1031 (2015).</li><li>Tokuyasu, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunochemistry+on+ultrathin+frozen+sections.">Immunochemistry on ultrathin frozen sections.</a> Histochem J. 12 (4), 381-403 (1980).</li><li>Suleiman, H., Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+protein+architecture+of+the+kidney+glomerular+basement+membrane.">Nanoscale protein architecture of the kidney glomerular basement membrane.</a> eLife. 2, e01149 (2013).</li><li>Kopek, B. G., Shtengel, G., Xu, C. S., Clayton, D. A., Hess, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+3D+superresolution+fluorescence+and+electron+microscopy+reveal+the+relationship+of+mitochondrial+nucleoids+to+membranes.">Correlative 3D superresolution fluorescence and electron microscopy reveal the relationship of mitochondrial nucleoids to membranes.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 109 (16), 6136-6141 (2012).</li><li>Avanesov, A., Malicki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+retina+in+the+zebrafish+model.">Analysis of the retina in the zebrafish model.</a> Methods Cell Biol. 100, 153-204 (2010).</li><li>Bachmann-Gagescu, R., Phelps, I. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ciliopathy+gene+cc2d2a+controls+zebrafish+photoreceptor+outer+segment+development+through+a+role+in+Rab8-dependent+vesicle+trafficking.">The ciliopathy gene cc2d2a controls zebrafish photoreceptor outer segment development through a role in Rab8-dependent vesicle trafficking.</a> Hum Mol Gen. 20 (20), 4041-4055 (2011).</li><li>Bachmann-Gagescu, R., Dona, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ciliopathy+Protein+CC2D2A+Associates+with+NINL+and+Functions+in+RAB8-MICAL3-Regulated+Vesicle+Trafficking.">The Ciliopathy Protein CC2D2A Associates with NINL and Functions in RAB8-MICAL3-Regulated Vesicle Trafficking.</a> PLOS Gen. 11 (10), e1005575 (2015).</li><li>Mateos, J. M., Guhl, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographic+contrast+of+ultrathin+cryo-sections+for+correlative+super-resolution+light+and+electron+microscopy.">Topographic contrast of ultrathin cryo-sections for correlative super-resolution light and electron microscopy.</a> Sci Rep. 6, 34062 (2016).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+nanometer+localization+analysis+for+individual+fluorescent+probes.">Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes.</a> Biophys J. 82 (5), 2775-2783 (2002).</li><li>Ovesn&#253;, M., K&#345;&#237;&#382;ek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ThunderSTORM:+a+comprehensive+ImageJ+plug-in+for+PALM+and+STORM+data+analysis+and+super-resolution+imaging.">ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging.</a> Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).</li><li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Cardona, A., Saalfeld, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrakEM2+software+for+neural+circuit+reconstruction.">TrakEM2 software for neural circuit reconstruction.</a> PLOS one. 7 (6), e38011 (2012).</li><li>Wurm, C. A., Neumann, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+distribution+of+mitochondrial+import+receptor+Tom20+is+adjusted+to+cellular+conditions+and+exhibits+an+inner-cellular+gradient.">Nanoscale distribution of mitochondrial import receptor Tom20 is adjusted to cellular conditions and exhibits an inner-cellular gradient.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 108 (33), 13546-13551 (2011).</li><li>Slot, J. W., Geuze, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryosectioning+and+immunolabeling.">Cryosectioning and immunolabeling.</a> Nat Prot. 2 (10), 2480-2491 (2007).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Deze methode combineert Super opgelost eiwit lokalisatie met context informatie om te bepalen van de precieze positie van eiwitten in een organel. Wij tonen hier de voltooiing van het experiment te visualiseren van de expressie van Tom20 in de buitenmembraan van het mitochondrium, en haar relatie tot andere organellen zoals kernen of buitenste segmenten van de fotoreceptor in het larvale zebrafish netvlies.
Tokuyasu cryo-segmentering vereist sommige opleiding aan het verwerven van goed bewaarde secties. Dit is echter een waarderingsgrondslag die werd toegepast in veel laboratoria met bewezen succes21. Overdracht van de secties aan de silicium wafer is zeer eenvoudig, en geen speciale overwegingen nodig zijn. Het gebruik van glycerol in de beeldvorming buffer is een zeer belangrijke stap om te voorkomen dat het drogen van de afdelingen. Voor super-resolutie beeldvorming worden de beste resultaten verkregen wanneer de wafer zeer dicht bij de bodem van het glas van de petrischaal is. De siliconen strepen helpen handhaven van de wafer in deze positie. Speciale zorg moet worden genomen tijdens het verwijderen van de strepen om te voorkomen beschadiging van de secties.
De dikte van de cryo-delen, ongeveer 100 nm, dunner dan de optische resolutie in de Z-dimensie, vergemakkelijkt bovendien de nauwkeurigheid van deze oereenstemming methode als het signaal van de microscopie super resolutie alleen uit deze dunne laag komt en de Scannende Elektronen Microscoop signaal is het weergeven van de topografie van het monster. Deze methode kan ook worden gecombineerd met multicolor beeldvorming. Echter, speciale moet worden gezorgd dat de steekproef kan worden beeld onder dezelfde omstandigheden (bijvoorbeeld imaging buffer) en cross talk voorkomen moeten worden.
Een beperking van de methode is de twee-dimensionale benadering, aangezien slechts een beperkt aantal seriële secties (ongeveer 3 tot 7 per wafel) kan worden verzameld. Dus, projecten in verband met volume analyse zou niet ideaal. Het is echter een methode die kan worden toegepast om te detecteren eiwituitdrukking in elk type weefsel door eenvoudige afdelen van het monster. Wij bieden een methode zonder gebruik van klassieke contrastmiddelen zoals uranyl-acetaat of lood citraat. Het contrast door platina shadowing zeer informatief topografische contrast biedt, maar in sommige gevallen membranen zijn moeilijk op te lossen. Dit kan problemen opleveren voor projecten die nodig hebt, bijvoorbeeld om te bepalen van de uitdrukking van de eiwitten in kleine blaasjes.
Ons protocol, gebaseerd op Tokuyasu cryo-secties, maakt gebruik van standaard uitrusting nodig om resultaten te verkrijgen van super resolutie en scanning electron microscopes. De collectie van secties (wafers) van silicium en het gebruik van platina voor contrast zijn de eenvoudige stappen om te zorgen voor stabiliteit en reproduceerbaarheid aan de bereiding van de monsters.

Methoden ter bepaling van de subcellular localisatie van eiwitten en hun relatie tot de verschillende compartimenten van de cel zijn essentiële instrumenten om hun functies en de mogelijke interacties te begrijpen. Super resolutie microscopie in combinatie met elektronenmicroscopie biedt dergelijke informatie1. Grondtoestand uitputting microscopie gevolgd door individuele molecuul terugkeer (GSDIM) is een super resolutie microscopie technologie compatibel met een breed scala van biologisch en genetisch gecodeerde fluorophores2 en behaalt een laterale resolutie tot 20 nm 3. de opneming van methoden met een hogere resolutie dan standaard diffractie-limited microscopie verbetert de nauwkeurigheid van de correlatie4,5,6. Met het oog op de beste correlatie van eiwit expressie met een specifieke subcellular compartiment en aan het verminderen van de hoeveelheid onzekerheid7 het gebruik van dezelfde uiterst dunne sectie voor licht- en elektronenmicroscopie wordt aanbevolen. Onder de verschillende vectorafbeeldingsbestanden methoden, Tokuyasu cryo-sectie protocol vereist geen uitdroging of hars inbedding en, bovendien, behoudt de antigenicity van veel epitopes en biedt goede weefsel ultrastructuur8. Verschillende methoden hebben aangetoond dat de toepasbaarheid van deze secties in oereenstemming licht- en elektronenmicroscopie (CLEM)4,,5,,9,10.
De zebravis netvlies is een waardevol model om te studeren ziekten bij de mens mechanismen gezien haar zeer geconserveerde structuur en functie in de gewervelde dieren en visuele ontwikkeling. In bepaalde, retinale researchdieren display dezelfde architectuur als de zoogdieren researchdieren, met een basale SYNAPS, een apico-basally langwerpige kern, clustering van de mitochondriën in de meer apicale innerlijke segment en een buitenste segment bestaat uit membraan schijven in de meest apicale positie11. Eiwit localization voor de diverse cellulaire compartimenten is geconserveerde tussen zebravis en menselijke, waardoor onderzoek naar de biologische functie van menselijke ziekte-relevante eiwitten12,13.
Hier presenteren we een protocol ter voorbereiding van larvale zebrafish netvlies monsters voor het oplossen van de lokalisatie van de eiwitten mitochondriaal buitenmembraan Tom20 door oereenstemming super resolutie licht- en elektronenmicroscopie. De methode is gebaseerd op het verzamelen van cryo-secties (wafers) van silicium en verkrijgen van contrast door topografische informatie geproduceerd na toepassing van een dunne laag platina. Deze stappen zijn duidelijke technische verbeteringen in termen van gemak van gebruik, reproduceerbaarheid, en tijd om uit te voeren van de experimenten. We hebben onlangs aangetoond dat de toepasbaarheid van de methode voor het opsporen van nucleaire poriën en eiwitten mitochondriaal in muis weefsel14.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde EM Grade</td>
			<td>EMS, USA</td>
			<td>#16220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cacodylate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#8.20670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#886-86-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose, peqGOLD Universal</td>
			<td>VWR International GmbH</td>
			<td>35-1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat embedding molds</td>
			<td>BEEM Flat</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Local food brand gelatin</td>
			<td>Dr.Oetker</td>
			<td>Extra Gold</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#1.07687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#M-6385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#G-7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin type B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#G-6650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>#A6588.0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Si-Mat Silicon Materials</td>
			<td></td>
			<td>Type: P/Boron; Orientation &#60;111&#62; ON; Growth method: CZ; Resistivity:1-30 ohm/cm; Surface: polished; Laser cut at 7 x7 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-pin</td>
			<td>Baltic Preparation</td>
			<td>#16701950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wired loop &#34;Perfect loop&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone stripes</td>
			<td>Picodent</td>
			<td>Twinsil 22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucoseoxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#G7141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>catalase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#C40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beta-Mercaptoethylamine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#M6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Tom20</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>#sc - 11415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 647 AffiniPure F(ab&#39;)2 fragment donkey anti rabbit IgG</td>
			<td>Jackson Immuno-Research</td>
			<td>#711-606-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ROCHE, Switzerland</td>
			<td>#10236276001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#49782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom petri dish</td>
			<td>Ibidi, Germany</td>
			<td>u-Dish 35mm, high glass bottom, #81158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEM aluminium stub</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>#G301F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conducting carbon cement Leit-C</td>
			<td>Plano, Germany</td>
			<td>AG3300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond Knife (Cryo Immuno)</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>DCIMM3520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-ultramicrotome</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Leica EM FCS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield-TIRF microscope GSD Leica SR GSD 3D</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>160x 1.43 TIRF objective</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>11523048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEM - Zeiss Supra 50 VP</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Supra 50 VP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIB-SEM - Zeiss Auriga 40</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Auriga 40</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

correlative super-resolution and electron microscopy to resolve protein localization in zebrafish retina

Presenteren we een methode om te onderzoeken de eiwit subcellular localisatie in het larvale zebrafish netvlies door het combineren van de lichte microscopie van super resolutie en scanning elektronen microscopie. De sub diffractie limiet resolutie functionaliteit voor super-resolutie lichte microscopen kunnen verbeteren van de nauwkeurigheid van de gecorreleerde gegevens. Kort, 110 nanometer dik cryo-secties worden overgedragen aan een silicium wafer en, na immunofluorescentie kleuring, zijn beeld door de lichte microscopie van super resolutie. De secties worden vervolgens bewaard in methylcellulose en platina schaduw vóór imaging in een Scannende Elektronen Microscoop (SEM). De beelden van deze twee microscopie modaliteiten worden gemakkelijk samengevoegd met behulp van weefsel bezienswaardigheden met open sourcesoftware. Hier beschrijven we de aangepaste methode voor het larvale zebrafish netvlies. Deze methode geldt echter ook voor andere soorten weefsels en organismen. We laten zien dat de aanvullende informatie verkregen door deze correlatie is in staat om de uitdrukking van mitochondriale eiwitten in verband met de membranen en cristae mitochondria alsmede over andere compartimenten van de cel te lossen.

De expressie van het eiwit Tom20, een subeenheid van de translocase mitochondriale buitenmembraan complexe20, werd bepaald, in dunne secties van larvale zebrafish netvlies, door de lichte microscopie van super resolutie (Figuur 1) en deze informatie was aangevuld met de topografische signaal verkregen door het scannen van elektronenmicroscopie na platina schaduwen van dezelfde baanvakken. Deze oereenstemming gegevens bevestigen de lokalisatie van een proteïne in samenwerking met een bijzondere compartiment, de mitochondriale buitenmembraan en bovendien vindt u informatie over de relatie van het eiwit met andere organellen van de cel.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56113/56113fig1.jpg"> 
Figuur 1: CLEM op zebrafish netvlies. A. lage vergroting widefield afbeelding van een 5 dpf zebrafish retinale sectie kernen gekleurd met DAPI (cyaan). B. Scanning elektronen microscopie van hetzelfde gebied. C. hogere vergroting widefield beeld van frame in B. kernen gekleurd met DAPI (cyaan) en Tom20-mitochondriale kleuring verschijnt in het rood. D. Widefield afbeelding van dezelfde sectie bij hogere vergroting. Het patroon van Tom20 expressie is bij de clusters van de mitochondriën. E. expressie van Tom20 (rode stippen) gedetecteerd door GSDIM microscopie. Kernen gekleurd met DAPI (cyaan). F. dezelfde sectie als E oereenstemming super resolutie combineren en scanning elektronen microscopie. Tom20 kleuring (rode stippen) wordt weergegeven op de mitochondriale cluster (M) de buitenste membranen van de mitochondriën. Fluorescentie DAPI signaal in de kernen (N) komt overeen met de topografie van het SEM-beeld. G. hoge vergroting afbeelding van frame in F. De scanning elektronen microscopie afbeelding biedt context naar de GSDIM afbeelding (rode stippen). Mitochondriale cristae duidelijk zichtbaar zijn en de Tom20 kleuring is gelokaliseerd aan de buitenste membranen van de mitochondriën. De membranen van de buitenste segment het researchdieren (OS) zijn duidelijk opgelost. Afbeelding pixel grootte 5 nm. Schaal bars: A, B en C: 10 µm; D: 2 µm; E en F: 1 µm en G: 0,2 µm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56113/56113fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
Aanvullende figuur 1: uitlijning van de figuren van licht- en elektronenmicroscopie. A. Screenshot vanuit TrackEM2-interface met SEM-beeld en genummerde bezienswaardigheden (geel) langs verschillende kernen. B. Screenshot vanuit TrackEM2-interface met fluorescentie beeld en genummerde bezienswaardigheden (geel) langs verschillende DAPI gekleurd kernen. Wijzigen van de transparantie van de laag de schuifregelaars op het linker bovenste gedeelte van het menu kunnen worden gebruikt. Schaal bar: 1 µm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56113/Supplementary_Figure_1.tif">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina at JoVE.com

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

Dit protocol beschrijft het nodige eiwit subcellular localisatie om resultaten te verkrijgen op de zebravis netvlies door correleren super resolutie de lichte microscopie en elektronenmicroscopie afbeeldingen scannen.

Oereenstemming super resolutie en elektronenmicroscopie op te lossen eiwit lokalisatie in Zebrafish Retina

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Meten Eiwit Stabiliteit in Living zebravis embryo&#39;s met behulp van fluorescentie Decay Na Photoconversion (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse van de zebravis Larven skeletspieren Integriteit met Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Large-scale Scanning Transmission Electron Microscopy (Nanotomy) of Healthy and Injured Zebrafish Brain

Large-scale Scanning Transmission Electron Microscopy Nanotomy of Healthy and Injured Zebrafish Brain

Grootschalige Scanning Transmission Electron Microscopy (Nanotomy) van gezonde en beschadigde hersenen zebravis

Large-scale 2D electron microscopy (EM), or nanotomy, is the tissue-wide application of nanoscale resolution electron microscopy. Others and we previously ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

Analyse van de zebravis Kidney Development met Time-lapse Imaging Met behulp van een dissectie microscoop Uitgerust voor Optische-Sectie

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Met behulp van Light Sheet fluorescentiemicroscopie met Afbeelding zebravis Eye Development

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Analysis of Protein-protein Interactions and Co-localization Between Components of Gap, Tight, and Adherens Junctions in Murine Mammary Glands

Analyse van eiwit-eiwitinteracties en co-lokalisatie tussen componenten van kloof-, strakke- en adherentie-knooppunten in muizenmammarysklieren

Cell-cell interactions play a pivotal role in preserving tissue integrity and the barrier between the different compartments of the mammary gland. These ...

Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

Multimodale hiërarchische beeldvorming van seriële secties voor het vinden van specifieke cellulaire doelen binnen grote Volumes

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a ...

Immunohistochemical Detection of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine in Developing and Postmitotic Mouse Retina

Immunohistochemische detectie van 5-Methylcytosine en 5-Hydroxymethylcytosine bij de ontwikkeling en Postmitotic muis Retina

The epigenetics of retinal development is a well-studied research field, which promises to bring a new level of understanding about the mechanisms of a ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualiseren van het knooppunt en de Notochordal plaat In Gastrulating muis embryo's met behulp van Scanning elektronen microscopie en hele Mount immunofluorescentie

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Een gelaagde montagemethode voor de uitgebreide time-lapse confocale microscopie van hele zebravis embryo's

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...